多层工程化心肌

多层工程化心肌
本发明的背景
1.让衰竭的心脏再生仍然是一个巨大的挑战。心力衰竭的常见原因是心脏病发作(heart attack)。心脏病发作或心肌梗死(myocardial infarction)是由动脉血流受阻引起的，导致组织灌注不足，从而被剥夺了氧气和营养。在心脏病发作期间，数以百万计甚至多达十亿计的细胞迅速坏死，这是导致心脏性能下降的主要原因，在临床上称为心力衰竭。由于心脏主要是有丝分裂后组织(post-mitotic tissue)，因此心脏组织不能自行再生。植入工程化心肌是该领域追求的目标。已经开发了不同的工程化心肌形式(engineered heart muscle formats)，用于疾病建模、药物筛选和心脏修复。本发明人和其他人已经发表了工程化人心肌模型用于心肌细胞成熟和肥大的体外研究(tiburcy等人，2017)、疾病建模(hanses等人，2020)和药物筛选(mills等人，2019)以及体内心脏修复(riegler等人，2015)的若干应用。
2.支持心肌细胞自组装为3d组织的一种方法是含支架的方法，其中支架主要由胶原或纤维蛋白支撑(zimmermann等人2006，tulloch等人2011，soong等人2012，zhang等人2013，riegler等人2015，weinberger等人2016，tiburcy等人2017)。此外，非肌细胞(non-myocytes)对于三维组织的生成至关重要。与啮齿动物模型相似(naito等人，2006)，所述非肌细胞主要是成纤维细胞或具有成纤维细胞活性的基质细胞(kensah等人，2013；ronaldson-bouchard等人；2018；tiburcy等2017，zhang等人，2013)。
3.除了细胞成分和支架之外，在生物物理刺激即机械刺激、电刺激或两者的结合的支持下，已经实现了最高程度的成熟(ronaldson-bouchard等人，2018；tiburcy等人，2017)。对于高度成熟的心肌的工程化而言，机械负荷(mechanical loading)是绝对的要求。
4.为了生产用于治疗心肌无力患者的人工心肌组织，工程化心肌需要支持人类心脏跳动的力量。患者中待治疗的心壁厚度通常为5-10mm(kawel等人，2012)，即植入物必须理想地达到该厚度，并且还必须能够产生机械力以支持心壁功能。
5.当试图获得如此厚度的工程化心肌时，一个关键的挑战是嵌入工程化心肌中的细胞在任何时候都能得到氧气和营养供应。因此，在本领域中需要具有足够厚度的工程化心肌以支持人类心脏。本发明人已经通过工程化心肌的重复且依次进行的浇注工艺(repetitive and sequential casting process)克服了这一挑战。


技术实现要素：

6.为了产生多层工程化心肌(multilayer engineered heart muscle，mehm)，含细胞的水凝胶的致密化的层(重构混合物(reconstitution mixture))被至少一个其他层包覆。这种重复且依次进行的工艺确保了增厚和强化的工程化心肌的形成，其中至少一个新层与先前的层合并。换句话说，通过重复且依次进行的成层(layering)，工程化心肌的厚度得以增加。此外，重要的是工程化的心肌被机械支撑物穿透(penetrated)，其中杆状物(pole)延伸穿过工程化的组织，以便支持增张力性收缩(auxotonic contraction)并在整
heart pouch)或工程化心脏圆柱体(engineered heart cylinder)，其中ehm包括(a)胶原，(b)心肌细胞和非肌细胞的细胞混合物，并且其中ehm的厚度为至少约0.6mm。
18.此外，本发明公开了通过本文所公开的方法获得的mehm或如本文所公开的mehm在体外制造工程化人类心肌中的用途。
19.最后，描述了通过本文所公开的方法获得的多层ehm或如本文所公开的mehm用于医学，特别是心力衰竭的用途。
具体实施方式
20.在第一方面，公开了一种制造多层工程化心肌(mehm)的方法，其中该方法包括以下步骤：(
ⅰ
)在模具中提供液体重构混合物，其中所述重构混合物被至少两个杆状物穿孔，其中所述重构混合物包含(a)胶原，(b)心肌细胞和非肌细胞的细胞混合物和(c)合适的重构介质，由此所述重构混合物在所述模具中发生胶凝，(
ⅱ
)将通过步骤(
ⅰ
)获得的在所述模具中的混合物在合适的培养培养基中进行培养，由此所述重构混合物在所述模具中致密化；(
ⅲ
)a)将另外的如步骤(
ⅰ
)中所限定的液体重构混合物从顶部和/或从底部加入到由步骤(
ⅱ
)获得的所述致密化的重构混合物中，由此所述另外的液体重构混合物发生胶凝，随后在与步骤(
ⅱ
)中相同的条件下进行培养，由此所述另外的重构混合物在模具中致密化；或b)将由步骤(
ⅱ
)获得的该致密化的重构混合物转移到不同的模具中，其中所述重构混合物被至少两个杆状物穿孔，随后在所述不同的模具中进行步骤(
ⅲ
)a)；从而获得多层工程化心肌(mehm)，优选地，其中所述mehm通过重复步骤(iii)a)和/或步骤(iii)b)至少一次而加厚，和(iv)任选地，将在所述模具中的步骤(
ⅲ
)的mehm在合适的成熟化培养基中进行培养，其中所述mehm能够收缩。
21.一般而言，本文所用的工程化心肌(ehm)是指包含细胞和胶原的人工心肌，其能够收缩(contracting)。此外，多层工程化心肌(mehm)源自至少2层工程化心肌(ehm)。为了制造多层工程化心肌(mehm)，依次添加各层。当发生依次进行的成层(sequential layering)时，后续层会添加到原始(第一)层上。随后，后续层会与原始(第一)层合并。这种成层过程可能会重复几次。换句话说，随后的一层会与之前添加的一层合并。进行成层时，mehm会逐层增厚。这种方法的主要优点是加厚的mehm比单层ehm更稳定，能够承受更大的力。此外，mehm的另一个关键特征是其能够收缩，类似于天然心脏心肌，优选如下文所进一步限定的。理想情况下，这种多层工程化心肌适合用作植入物，例如心脏植入物。
22.在一个实施方案中，通过步骤(
ⅲ
)和任选的步骤(iv)获得的mehm具有收缩能力，这可以通过目视检查来评估。或者，mehm的收缩可以通过步骤(
ⅰ
)的重构混合物通过进行步骤(
ⅰ
)、(
ⅱ
)和任选的(iv)来形成产生力的工程化心肌(ehm)的能力来确定，并且其中工程化心肌(ehm)能够产生为至少0.05mn收缩力(force of contraction，foc)的收缩力，如在
tiburcy等人的circulation 135(19)1832-1847(2017)的附加图6c中的标准等距条件(standard isometric conditions)下测得的。更具体地，mehm的收缩可以进一步通过并行地评估步骤(
ⅰ
)的重构混合物通过进行步骤(
ⅰ
)、(
ⅱ
)和(iv)来形成环形形式(loop-format)的产生力的工程化人肌肉的能力来确定，如在tiburcy等人的circulation 135(19)1832-1847(2017)中所述，并且其中呈环形形式的工程化心肌产生至少0.05mn的收缩力(foc)，如在tiburcy等人的circulation 135(19)1832-1847(2017)的附加图6c中所测得的。换句话说，mehm的收缩可以通过产生与mehm平行的环形形式的ehm来确定。这种并行方法的优势在于，环形形式的ehm的形成已得到很好的确立(例如，参见tiburcy等人，2017和2020)，也可以以48孔形式(48-well format)进行。此外，由于测量了两个杆状物之间的力，在环形形式中收缩力可以更方便地确定。因此，重构混合物和介质的质量可以更容易地以得到确立的环形形式(well-established loop format)进行评估。此外，预计一个发展良好的环形形式的ehm也可以确保提供的mehm质量相同。或者，也可以直接测量mehm中的收缩力(foc)。例如，zimmermann等人(2000)描述了组织中foc的测量。因此，技术人员也可以调整所述设置用于测量mehm中的foc。在一个优选的实施方案中，mehm产生的收缩力(foc)为至少0.05mn，更优选至少0.1mn，更优选至少0.3mn，更优选至少0.5mn，更优选至少1mn，更优选至少3mn，还更优选至少5mn，最优选至少10mn。
23.在另一个优选实施方案中，mehm的每一层的厚度为至少约0.1mm，优选至少约0.15mm，更优选至少约0.2mm，更优选至少约0.25mm，更优选至少约0.3mm，更优选至少约0.4mm，最优选至少约0.5mm。在特别优选的实施方案中，mehm的厚度为约0.2mm至约30mm，优选约0.3mm至约30mm，优选约0.5mm至约30mm，更优选约0.7mm至约25mm，更优选约0.9mm至约23mm，更优选约1.5mm至约20mm，更优选约2mm至约18mm，更优选约2.8mm至约15mm，更优选约3.3mm至约13mm，更优选约3.8mm至约12mm，更优选约4.2mm至约11mm，更优选约4.6mm至约10.5mm，最优选约5mm至约10mm。当提及本发明的多层工程化心肌的单个层的厚度和本文所述的工程化心肌的厚度二者时，术语“约”意指厚度可以偏离相应的数值
±
1％、
±
2％、
±
3％、
±
4％、
±
5％、
±
6％、
±
7％、
±
8％、
±
9％或
±
10％。这意味着，例如，如果单个层的厚度为“约0.3mm”，则该层的厚度范围为0.27mm(偏差为-10％)至0.33mm(偏差为+10％)。同样，如果工程化心肌本身具有约0.8mm的厚度，则工程化心肌包括0.72mm至0.88mm的厚度。
24.理想情况下，mehm与人类心肌的厚度匹配，在非收缩状态下，其厚度为5mm至12mm。例如，kawel等人(2012)发表文章称，人的心脏壁(heart wall)在最大舒张时至多为12mm。nowosielski等人(2009)发表文章称，收缩时，心脏壁厚度通常会增加60％。因此，据估计，人类心脏的最大厚度为20mm。因此，用作心脏植入物的mehm优选具有5mm至20mm之间的厚度。
25.据发明人所知，这是本领域中第一个加厚的ehm设计。所公开的方法的主要优点是mehm源自至少2个层，所述2个层被合并在一起。通过这种连续和重复的成层，mehm逐层增厚，同时确保整个mehm中的总表面-组织扩散距离最小。穿孔杆状物(perforating pole)的设计和密度确保了所需的表面-组织扩散距离。最小或代谢充分的表面-组织扩散确保细胞始终获得氧气和营养供给。没有例如几厘米的穿孔(perforations)的重构混合物或其多层组织将表现出重构混合物中部的细胞的快速(组织核心)坏死，因为组织核心中的所述细胞将不被供应足够的氧气和/或营养。
26.在另一个实施方案中，mehm的收缩也可以通过视频光学方式(video-optically)测量。例如，可以测量mehm的面积变化分数(fractional area change，fac)。评估fac的方法已由tiburcy等人(2017)进行过描述。简言之，比较了舒张状态和收缩状态下的mehm面积，并以百分比报告了变化。在一个特别优选的实施方案中，通过使用在tiburcy等人，circulation 135(19)1832-1847(2017)中描述的方法测量mehm的面积变化分数(fac)来确定收缩，并且其中在电刺激时面积变化分数(fac)为至少0.5％，优选其中fac为至少0.7％，更优选至少1％，更优选至少2％，更优选至少3％，还更优选至少5％。在特别优选的实施方案中，fac为至多20％，优选至多19％，更优选至多18％，还更优选至多17％，还更优选至多16％，还更优选至多15％。电刺激可以通过电场或通过点刺激(point stimulation)实现。实施例4中示出了电场的实例。使用电极的点刺激也是本领域技术人员已知的。一般来说，电刺激会导致mehm收缩。从tiburcy等人2017年的研究中可以推导出，约7％的fac相当于约1mn foc(附加图11)。基于该图，如果需要，技术人员能够将foc和fac相关联。
27.为了制造这种mehm，在模具中提供液体重构混合物。一般来说，“液体”混合物能够流动并填充(fill out)模具。此外，介质(medium)可以溶解到液体重构混合物中。如此处所用，“液体”混合物意指与“凝胶状”混合物截然不同(in contrast)的混合物，因为凝胶状混合物不能流动，介质不能自由溶解到凝胶状混合物中，定义如下。
28.如本文所用，“重构混合物(reconstitution mixture)”包括胶原、细胞混合物和合适的重构介质，其中细胞混合物由心肌细胞和非肌细胞组成。本领域技术人员容易理解，重构混合物形成mehm的基础，因为重构混合物的不同组分构建工程化心肌的关键部分，即重构心肌的关键部分以使mehm组织工程化。
29.胶原是重构混合物的成分之一。胶原是机体内各种结缔组织中的细胞外基质中的主要结构蛋白。胶原由氨基酸组成，以形成细长原纤维(elongated fibrils)的三股螺旋，这是本领域技术人员已知的。此外，胶原支撑工程化组织，如mehm，并从外部给予细胞结构支撑。本领域技术人员还知道，胶原可以从各种供应商处购买，例如“collagen solutions公司”。例如，重构混合物可以提供最终浓度在0.5mg/ml和3mg/ml之间的胶原，优选在0.55mg/ml和2.5mg/ml之间的胶原，更优选在0.6mg/ml和2.2mg/ml之间的胶原、在0.65mg/ml和2mg/ml之间的胶原，更优选在0.7mg/ml和1.75mg/ml之间的胶原，更优选在0.75mg/ml和1.5mg/ml之间的胶原，更优选在0.8mg/ml和1.2mg/ml之间的胶原，还更优选在0.85mg/ml和1mg/ml之间的胶原，最优选约0.9mg/ml的胶原。在一个优选的实施方案中，步骤(
ⅰ
)的胶原选自下列项：ⅰ型胶原、ⅲ型胶原、iv型胶原、
ⅴ
型胶原、ⅵ型胶原、
ⅻ
型胶原、
ⅹⅲ
型胶原、
ⅹ
iv型胶原、
ⅹⅴ
型胶原及它们的混合物。技术人员知道，i型胶原是人体内最丰富的胶原。在一个特别优选的实施方案中，步骤(
ⅰ
)的重构混合物中至少90％的胶原是i型胶原。特别地，如果mehm用作植入物，则步骤(
ⅰ
)的重构混合物中的胶原可以是医用级的。
30.当然，胶原可以来自不同的来源和不同的供应商。例如，胶原可以是牛来源的、马来源的、人来源的或海洋来源的。在一个特别优选的实施方案中，胶原是牛来源的。在一个特别优选的实施方案中，所用的胶原不含猪内源性逆转录病毒和任何传染性海绵状脑病。还预期步骤(
ⅰ
)的重构混合物中的胶原还包含除胶原之外的一种或多种额外的细胞外基质组分。术语“细胞外基质蛋白”是指普通技术人员已知的任何细胞外基质(extracellular matrix，ecm)蛋白(hynes和naba(2012))。此外，本领域技术人员通过例如mouw jk等人
(2014)了解到细胞外基质的组成，其可用于生成ehm。在一个特别优选的实施方案中，所述一种或多种额外的基质组分选自下列项：弹性蛋白、层粘连蛋白、内功素(entactin)、巢蛋白(nidogen)、蛋白聚糖(例如核心蛋白聚糖)、糖胺聚糖(例如透明质酸)和纤维粘连蛋白。此外，本领域技术人员知道存在商购可得的所述细胞外蛋白的合成模拟物，并且所述合成模拟物也适用于制造mehm。例如，本领域技术人员知道例如o'leary等人(2011)的文献，该文献描述了胶原模拟肽从三螺旋到纳米纤维和水凝胶的自组装。
31.在一个优选的实施方案中，步骤(
ⅰ
)中的细胞混合物在重构混合物中提供的最终细胞浓度为1
×
10
6-26.5
×
106个细胞/ml，优选2
×
10
6-13.2
×
106个细胞/ml，更优选3
×
10
6-10
×
106个细胞/ml，更优选3.5
×
10
6-9
×
106个细胞/ml，更优选4
×
10
6-8
×
106个细胞/ml，更优选4.3
×
10
6-7
×
106个细胞/ml，更优选4.6
×
10
6-6
×
106个细胞/ml，还更优选约5
×
106个细胞/ml。然而，技术人员能够确定重构混合物中细胞的合适浓度。例如，技术人员可以通过tiburcy等人(2017)或schlick等人(2019)的指导确定合适的细胞浓度和组成。
32.细胞混合物由心肌细胞和非肌细胞组成。心肌细胞是在自然组织中构成心肌(cardiac muscle，heart muscle)的肌细胞(muscle cells，myocytes)。每个心肌细胞都含有肌原纤维(肌原纤维是由肌节长链组成的特殊细胞器—肌细胞的基本收缩单位)。本领域技术人员知道，心肌细胞可以商购获得或通过从多能干细胞分化获得，例如从诱导多能干细胞获得。在特别优选的实施方案中，心肌细胞是人心肌细胞。在另一个特别优选的实施方案中，心肌细胞源自胚胎干细胞，其中该细胞不是使用涉及修饰人的种系遗传特性或涉及将人胚胎用于工业或商业目的的方法(process)而产生的。例如，心肌细胞可以源自诱导多能干细胞、孤雌干细胞、程序性体细胞或成体干细胞，优选其中心肌细胞源自诱导多能干细胞。本领域技术人员知道如本领域所述的诱导多能干细胞、孤雌干细胞或成体干细胞。程序性体细胞被直接重编程为所需的细胞类型。这种方法避免了多能性(pluripotency)的诱导和随后的分化过程(例如，参见ieda等人，2010，song等人，2012，nam等人，2013)。特别地，本领域技术人员知道文献中的各种方案，这些方案描述了心肌细胞的产生，例如通过wo2015/040142中所述的无血清分化，或替代方案，例如在burridge等人(2012)，production of de novo cardiomyocytes:human pluripotent stemcell differentiation and direct reprogramming,cell stem cell.2012jan6；10(1):16-28中所描述的。此外，-korting_stucchi maria-engler,_landsiedel(87017223)organotypic models in drug development,handbook of experimental pharmacology(springer,2020)一书中zimmermann的engineered heart muscle models in phenotypic drug screens一章总结了各种方案，以获得心肌细胞，这些方案可用于本文所公开的方法。在所述方案中，还考虑到心肌细胞可以是非人灵长类干细胞来源的、胎儿的或新生儿的心肌细胞。本领域技术人员还知道评估心肌细胞身份的方法，例如通过流式细胞术或rna测序。例如，所述方法允许确定标志物actn2、ttn、ryr2和/或肌钙蛋白的表达，它们是心肌细胞的特征。
33.在一个实施方案中，步骤(
ⅰ
)的细胞混合物包含至少10％，优选至少20％，更优选至少30％，还更优选至少40％，最优选至少50％的心肌细胞。技术人员能够确定心肌细胞和非肌细胞的最佳比例。最佳比例的优化将受到ehm的致密化(compaction)，特别是ehm收缩能力的指引。例如，tiburcy等人(2017)和schlick等人(2019)证明，心肌细胞和基质细胞等非肌细胞是工程化人心肌收缩(contraction)和致密化(compaction)所必需的。具体而言，
medium)和/或(3)成熟化培养基(maturation medium)中提供最终浓度。当然，浓度和成分可以独立地选择用于(1)重构混合物中，(2)培养培养基或(3)成熟化培养基中。
37.例如，可以配制无血清补充剂以在(1)-(3)中的任一种中提供以下组分的最终浓度：0.5-50mg/ml(优选1-40mg/ml，更优选2-30mg/ml，更优选3-20mg/ml，更优选4-10mg/ml，最优选4.5-7.5mg/ml，例如约5mg/ml)的白蛋白；
38.1-100μg/ml，(优选2-90μg/ml，更优选3-80μg/ml，更优选4-70μg/ml，更优选5-60μg/ml，更优选6-50μg/ml，更优选7-40μg/ml，更优选8-30μg/ml，更优选9-20μg/ml，例如约10μg/ml)的转铁蛋白；
39.0.1-10μg/ml，(优选0.2-9μg/ml，更优选0.3-8μg/ml，还更优选0.4-7μg/ml，还更优选0.5-6μg/ml，更优选0.6-5μg/ml，更优选0.7-4μg/ml，更优选0.8-3μg/ml，最优选1-2.5μg/ml，例如约2μg/ml)的乙醇胺；
40.14.4-1446nm硒或其生物可利用盐，(优选40-700nm，更优选70-300nm，还更优选130-160nm，最优选约144.6nm)；
41.0.4-40μg/ml(优选0.5-30μg/ml，更优选1-20μg/ml，还更优选2-10μg/ml，更优选3-5μg/ml，最优选约4μg/ml)的左旋肉碱盐酸盐；
42.1-100μg/ml，(优选1.4-80μg/ml，更优选1.8-40μg/ml，还更优选2-24μg/ml，更优选2.4-8μg/ml，最优选3.2-6μg/ml，例如约4μg/ml)的脂肪酸补充剂；和
43.0.0004-0.04μg/ml(优选0.0010-0.02μg/ml，更优选0.0016-0.010μg/ml，还更优选0.002-0.006μg/ml，最优选约0.004μg/ml)的三碘-l-甲状腺原氨酸(t3)。
44.例如，脂肪酸补充剂可以包括亚油酸和/或亚麻酸。
45.例如，硒的生物可利用盐为亚硒酸钠，从而在重构混合物、培养培养基或重构培养基(culturing or reconstitution medium)中提供的亚硒酸钠的最终浓度为0.003-0.3μg/ml(优选0.005-0.16μg/ml，更优选0.010-0.1μg/ml，还更优选0.02-0.05μg/ml，最优选0.03μg/ml)。
46.在另一个实施方案中，无血清补充剂还可以包含维生素a、d-半乳糖、孕酮和腐胺中的一种或多种。这些成分有利于细胞的活力。各个组分的合适浓度是本领域技术人员已知的，或者可以通过常规实验容易地确定。
47.无血清补充剂的一个实例可以根据已公布的方案制备(也见brewer等人(1993))，也可以通过商业途径购买。例如，可以使用去除胰岛素的b27(b27 minus insulin)(表1)。在优选的实施方案中，无血清补充剂由重构混合物、培养培养基(culturing medium)或重构介质中的0.2-20％(v/v)的去除胰岛素的b27、优选1-16％(v/v)、更优选2-12％(v/v)、更优选3-8％(v/v)、还更优选3-8％(v/v)、还更优选3.4-5％(v/v)的去除胰岛素的b27，最优选在重构混合物、培养培养基或重构介质中的约4％(v/v)的去除胰岛素的b27提供，如商业途径获得的或优选根据表1制备的。或者，也可以应用含有胰岛素的b27。对于所用的每种细胞类型，都可以通过实验确定最佳b27组成。本领域技术人员知道如何确定最佳b27组成和/或其浓度。例如，tiburcy等人(2017)在仅供在线使用的数据附加图iiif中比较了b27和去除胰岛素的b27的使用。用去除胰岛素的b27产生的工程化肌肉表现出比用b27产生的肌肉更高的力量(force)。然而，该图还示出，b27(含胰岛素)可用于成功生成工程化人心肌，以实现良好的收缩力。
48.此外，重构培养基、培养培养基和/或成熟化培养基的基础培养基可以额外包含抗坏血酸或其衍生物。例如，当抗坏血酸包含在重构培养基、培养培养基和/或成熟化培养基的基础培养基中时，在重构混合物、培养培养基和/或成熟化培养基中提供10-1000μm，优选50-400μm，更优选100-300μm，还更优选150-250μm，最优选约200μm的浓度。还更优选的是以抗坏血酸-2-磷酸酯(ascorbate-2-phosphate)形式存在的抗坏血酸。
49.此外，重构培养基、培养培养基和/或成熟化培养基的基础培养基可以为rpmi培养基，其还包含丙酮酸盐(pyruvate)。rpmi中的丙酮酸盐的特别优选的浓度范围为0.1-10mm丙酮酸盐，更优选0.2-5mm丙酮酸盐，还更优选0.4-2.5mm丙酮酸盐，还更优选0.8-1.5mm丙酮酸盐，还更优选0.9-1.2mm丙酮酸盐，最优选约1mm丙酮酸盐。
50.重构培养基的基础培养基可以例如选自iscove培养基、rpmi、αmem和dmem或它们的混合物，优选其中基础培养基选自iscove培养基、rpmi、αmem或它们的混合物，更优选其中基础培养基为iscove培养基和rpmi的混合物。然而，任何合适的基础培养基均可用于本方法。基础培养基是商购可得的，也可以根据公开的配方生产，例如从atcc产品目录中获得。一般而言，如本文所用，培养基结合了合适量的葡萄糖、乳酸盐和/或脂肪酸作为必需营养物。葡萄糖、乳酸盐和/或脂肪酸可确保嵌入重构混合物中的细胞获得适当的营养供应。
51.如果认为合适，可以在基础培养基中补充氨基酸。例如，如果使用αmem作为基础培养基，则不需要在基础培养基中额外补充非必需氨基酸。非必需氨基酸可以作为组合补充剂在市场上购得。例如，此类补充剂包含750mg/l甘氨酸、890mg/l l-丙氨酸、1320mg/l l-天冬酰胺、1330mg/l l-天冬氨酸、1470mg/l l-谷氨酸、1150mg/l l-脯氨酸和1050mg/l l-丝氨酸。
52.在特别优选的实施方案中，重构培养基还包含(c)35-790μm抗坏血酸，(d)5-500ng/ml igf-1，(e)0.3-26ng/ml vegf，(f)0.5-53ng/ml fgf-2，和(g)0.5-10ng/ml tgfβ1。在还更优选的实施方案中，重构培养基还包含(c)75-300μm抗坏血酸，(d)26-105ng/ml igf-1，(e)1.3-5.2ng/ml vegf，(f)2.6-10.5ng/ml fgf-2，和(g)1-6ng/ml tgfβ1。在还更优选的实施方案中，培养基还包含(c)约158um抗坏血酸，(d)约53ng/ml igf-1，(e)约2.6ng/ml vegf，(f)约5.3ng/ml fgf-2和约3ng/ml tgfβ1。
53.特别优选的是，vegf为vegf
165
。技术人员知道已公布的用于适当的重构介质的方案，例如tiburcy等人(2017)或tiburcy等人(2020)，并且技术人员能够确定同样适用的方案。
54.如本文所用，“模具(mould)”是可以自由选择的，并且可以是几何形状可变的。关键是模具要容纳重构混合物，并且重构混合物要在模具中发生胶凝。该模具可以按预期用途定制。例如，如果目的是用于人体植入的植入物，则定制的模具可以与心肌缺损匹配。如果mehm的目的是测试，例如药物功效，则可以使用不同的形状。技术人员能够根据技术人员的需要或目的定制模具的形状。例如，技术人员可以使用3d打印机来单独定制模具的形状。在优选的实施方案中，形成模具以便于形成平面状的mehm、袋状的mehm或圆柱状的mehm。在优选的实施方案中，模具具有补片(patch)、袋或圆柱体的形式。进一步优选的是，mehm具有补片、袋或圆柱体的形式。在更优选的实施方案中，补片具有盘(disc)的形式。
55.如果模具的形成是为便于形成平面状的mehm，则模具可以具有盘的形式，优选为圆形或多边形盘的形式，更优选为六边形盘的形式。图2和图7中也示出了本文公开的示例
性六边形盘，并且用于形成如实施例2所述的mehm。
56.如果模具的形成是为便于形成袋状mehm，则模具可以具有袋的形式，优选为球状或椭圆状的袋的形式。在特别优选的实施方案中，所述模具由内部和外部的球状或椭球状壁形成，并且更优选地，内部和外部的球状或椭球状壁是可充气的。袋状模具的实例可以在本文公开的图8a中看到。此外，wo2008/058917a1和ep2842581 a1公开了产生袋状工程化心脏组织的方法，如其中的图1所示。因此，本领域技术人员通常知道袋状工程化心脏组织的产生。然而，本领域技术人员不知道多层袋状ehm，其中重构混合物(形成mehm)由至少两个杆状物穿孔。如上所述，模具可以是3d打印的，以便调节例如袋的半径。在完成mehm的袋状生成(pouch shaped generation)后，将袋从模具上分离出来，并可切开(如需要)。
57.如果模具形成以便于形成圆柱状mehm，则模具可以具有圆柱体的形式，优选地，模具是圆柱形模具。在特别优选的实施方案中，圆柱形模具由圆柱形内壁和圆柱形外壁形成。在另一个实施方案中，圆柱形模具由单个圆柱形壁形成。单个圆柱形壁可以通过离心法用重构混合物覆盖。示例性圆柱形模具示于如本文所公开的图8b中。如上所述，模具可以是3d打印的，以便调整例如圆柱体的长度或直径。圆柱形mehm的一个主要优点是，可以通过占用相对较小的空间来产生较大的mehm。因此，可以并行生成多个mehm。圆柱形mehm在潜在使用(potential use)前，例如在患者中，可以沿长轴切开。
58.如示例性的图2、图7和图8所示，重构混合物被至少两个杆状物穿孔。在一个实施方案中，杆状物是柔性的，从而能够在mehm上引入机械负载。一般而言，杆状物是制造mehm的关键，因为杆状物至少有两个目的：首先，穿透mehm的杆状物产生通道，以便为重构混合物/mehm内的细胞提供足够的氧气和营养供应。其次，杆状物为发展中的肌肉提供物理刺激。技术人员知道，化学和物理刺激对于工程化肌肉的发展(development)至关重要。换句话说，杆状物支持mehm的发力(force development)，因为肌肉训练对肌肉的发展至关重要。在实施方案中，由穿孔杆状物产生的通道能够允许在步骤(
ⅱ
)、(
ⅲ
)中用培养培养基并且任选地在步骤(iv)中用成熟化培养基并且在步骤(
ⅱ
)、(
ⅲ
)和任选的(iv)中用氧气灌注(perfusion)mehm。在特别优选的实施方案中，在步骤(
ⅱ
)、(
ⅲ
)和/或任选的(iv)期间，培养培养基和/或成熟化培养基的灌注导致心肌细胞和非肌细胞的适当的营养支持。
59.在优选的实施方案中，重构混合物被至少两个杆状物穿孔，其中穿孔杆状物在重构混合物/mehm中引入通道，从而增加重构混合物/mehm的表面积。在还更优选的实施方案中，重构混合物/mehm被至少两个杆状物穿孔，其中mehm表面积的增加控制氧气和营养在mehm中的扩散距离。所述表面积的增加提供了细胞至重构混合物/mehm表面的减小的平均距离，使得细胞得到充分的氧气和/或营养供应，如可通过例如缺氧传感器(hypoxia sensor)(例如hesse等人，2014)或细胞死亡(例如使用熟知的活力测定染料)来确定，如下文进一步所述。在另一个优选的实施方案中，杆状物间距离(interpole distance)为0.1至10mm，优选0.5至9mm，更优选1mm至8mm，还更优选2mm至7mm，还更优选2.5mm至6mm，还更优选3mm至5mm，还更优选3.1mm至6mm，还更优选3.2mm至5mm，还更优选3.3mm至4mm，还更优选3.4mm至3.7mm，最优选约3.5mm。图8示出强烈优选的实施方案。最佳杆状物间距离对于厚度比杆状物间距离更大的mehm尤为重要，因为细胞到下一个穿孔杆状物的距离可能比到顶表面或底表面的距离更短。
60.在实施方案中，重构混合物从底部和/或从顶部被至少两个杆状物穿孔。具体而
area)。技术人员能够根据模具的尺寸来确定最佳容积。通常，一种液体重构混合物的厚度为1mm至约10mm。根据浇注区域和所需厚度，技术人员能够通过简单乘法来确定最佳容积。在优选的实施方案中，每种液体重构混合物的体积为0.5-200ml，优选1-150ml，更优选1.5-100ml，更优选2-50ml，更优选2.5-40ml，更优选3-30ml，更优选3.5-25ml，更优选4-20ml，更优选4.5-15ml，更优选5-11.5ml，更优选6-9.5ml，还更优选6.5-8.5ml，最优选约8ml。如本文所公开的，在图2中示出了使用8ml容积的示例性ehm。
67.模具可以容纳1-400ml的体积。模具可以容纳的体积可以由浇注面积乘以mehm的可能高度来确定。例如，如果模具能够形成盘，则模具容积可以通过浇注面积乘以模具高度来计算。图7a示出了用于产生六边形盘的示例性浇注模具。如果模具具有袋的形式，则模具的容积是球形或椭球形的外壁和内壁的体积之间的差。类似地，如果圆柱状模具具有外壁和内壁，则模具的容积可以由圆柱的外壁和内壁之间的体积差来确定。在圆柱状模具仅包括一个外壁的情况下，圆柱状模具理论上可以容纳整个圆柱体积。在优选的实施方案中，模具的容积为2-300ml，更优选3-200ml，更优选4-100ml，更优选5-80ml，更优选6-60ml，更优选6.5-50ml，更优选7-40ml，更优选7.5-30ml，更优选8-23ml，更优选13-19ml，还更优选13-17ml，还更优选约15ml。如上所述，模具可以为补片状、袋状或圆柱状。
68.如上所述，模具具有浇注区域。将液体重构混合物浇注到浇注区域中。换句话说，模具的尺寸描述了浇注区域的尺寸。此外，技术人员能够根据技术人员的需要确定模具的理想浇注区域。例如，如果希望将mehm用作植入物，可以用例如3d打印机定制模具。在优选的实施方案中，模具的尺寸为1-400cm2，优选2-300cm2，更优选3-200cm2，更优选4-100cm2，更优选5-80cm2，更优选6-60cm2，更优选7-50cm2，更优选8-40cm2，更优选9-30cm2，更优选10-23cm2，更优选12-19cm2，还更优选13-17cm2，还更优选约为13-17c m2。在强烈优选的实施方案中，模具用于形成补片状的mehm。
69.如上所述，重构混合物被至少两个杆状物穿孔。在优选的实施方案中，重构混合物被至少三个杆状物穿孔。在还更优选的实施方案中，杆状物被布置成网格(grid)，更优选地，其中杆状物被布置成三角形或矩形网格，还更优选地，布置为三角形网格。示例性的三角形网格布置在例如本文所公开的图7中示出。然而，技术人员能够确定其他合适的网格布置。
70.将重构混合物穿孔的杆状物的合适数量以及直径取决于模具的尺寸。在重构混合物上穿孔的杆状物有两个目的：首先，杆状物确保形成通道，以便为重构混合物内的细胞提供足够的氧气和营养。其次，杆状物支持发展中的肌肉(developing muscle)的训练，即杆状物支持肌肉的发力。技术人员能够根据模具尺寸确定杆状物的最佳数量。通过简单的实验，本领域技术人员能够确定细胞是否没有得到充分氧气和/或营养供应。例如，hesse等人(2014)描述了缺氧传感器可用于工程化组织如工程化心肌中，以确定细胞是否遭受低氧。此外，如果细胞没有得到足够的氧气和/或营养供应，细胞可能死亡，这也可以通过使用染色方法的标准实验来确定。此外，技术人员能够通过mehm的收缩力确定杆状物的最佳数量和直径。如上所述，可以通过fac或foc测量收缩，例如在tiburcy等人(2017)或zimmermann等人(2000)中所描述的。在优选的实施方案中，重构混合物被至少5个杆状物，更优选至少7个杆状物，更优选至少14个杆状物，还更优选至少20个杆状物，还更优选至少30个杆状物，还更优选至少37个杆状物，最优选至少52个杆状物穿孔。如本文图7a和图7c所示的，示例性
浇注模具(casting mould)分别示出了52个杆状物和14个杆状物。据发明人所知，杆状物的数量没有固定的上限。例如，重构混合物可以被至多2000个，优选至多1500个，还更优选至多1000个穿孔。根据本发明，技术人员可以自由地组合杆状物数量的界限。在另一个特别优选的实施方案中，杆状物的直径为0.5至3mm，优选为0.6至2.5mm，更优选为0.65至2mm，还更优选为0.7至1.7mm，还更优选为约0.8至1.5mm。如图7c中进一步示出的，从0.8至1.1mm的不同直径也已经过实验测试。在特别优选的实施方案中，重构混合物可以被至少七个杆状物穿孔，其中杆状物被布置成网格，并且其中杆状物的直径沿着一个平面轴形成梯度。直径梯度的一个实例在本文所公开的图7c中示出。此外，直径的梯度会产生这样的技术效果，即沿该梯度测得的fac大于沿具有相同杆状物厚度的杆状物测得的fac。实验数据也支持这一发现，如图7c所示。
71.例如，如图7a所示的浇注模具包括52个杆状物，并且每种液体重构混合物的体积为8ml。本领域技术人员还可以从该实施方案中推断出重构混合物的体积和杆状物的数量。
72.在优选的实施方案中，每个杆状物具有一个底座区域(base area)，并且底座可以为圆形、矩形、椭圆形、三角形或多边形，优选地，其中底座区域为圆形。杆状物的圆形底座区域也示出在例如本文的图7和图8中。
73.有利地，杆状物产生回复力(restoring force)以模拟收缩周期期间的正常和/或梗塞心脏的心壁应力(heart wall stress)。回复力是一种作用于使物体达到平衡位置的力。如上所述，杆状物通常是柔性的，以便在mehm上引入机械负荷(mechanical load)。因此，杆状物理想地具有弹性特性(柔性)。一般来说，杆状物的弹性特性由弹性模量或杨氏模量来量化，该模量定义了获得单位应变所需的应力大小。例如，较高的模量表示材料较难变形。通常，该模量的si单位是帕斯卡(pa)。例如，rump等人(2007)和pislaru等人(2014)描述了正常心肌和梗死心肌的粘弹性特性。理想的工程化组织模拟正常心肌和/或梗死心肌的收缩特性(约0.3-60mn/mm2；wiegerinck等人，2009，muleri等人，1992)和粘弹性(5至27千帕；rump等人，2007)特性。
74.在特别优选的实施方案中，杆状物的回复力理想地匹配正常和/或病变的心肌的壁张力(10至200千达因/cm2或1至20千帕；fujita等人，1993)。弹性特性可以由工作弹簧刚度(working spring rate)来限定。在本案中，可以在mehm与杆状物接触的点处评估工作弹簧刚度。通常，弹簧刚度被定义为使弹簧变形一个距离单位所需的力的大小。弹簧刚度的测量单位通常为n/mm(牛顿/毫米)或mn/mm(毫牛顿/毫米)。在强烈优选的实施方案中，杆状物的弹性特性，由弹性模量定义的，产生0.5-50mn/mm，优选0.7-40mn/mm，更优选0.9-30mn/mm，还更优选1-20mn/mm，还更优选2-10mn/mm，还更优选3-5mn/mm，最优选约4mn/mm的回复力。在特别优选的实施方案中，杆状物的回复力与正常和/或病变人类心脏的壁张力相匹配，还更优选地，其中壁张力为1至20千帕。fujita等人(1993)也公开了所述范围。
75.杆状物的弹性特性可以表现出不同的弹性模量，以建立生物力学各向异性。换句话说，弹性模量在杆状物之间表现出变化。在另一个实施方案中，杆状物的弹性特性表现出相似的弹性模量以建立生物力学各向同性。换句话说，弹性模量在杆状物之间是均匀的。
76.在另一个实施方案中，在杆状物的下部杆状物被圆周壁(circumferential wall)包围，其中圆周壁形成围绕杆状物的环形斜坡(ring-shaped ramp)，并且其中环形斜坡从底部向上逐渐变细。图4b中描述了用于环形ehm的圆周壁的示例性尺寸。此外，wo 2017/
207431 a1详细描述了所述圆周壁。杆状物底部的圆周壁的优势在于，由于致密化和/或肌肉力量的发展，致密化的重构混合物沿斜坡向上移动。这种由于致密化和/或肌肉力量的发展而产生的向上滑动(sliding)有利于从底部添加另外的重构混合物，如该方法的步骤(
ⅲ
)所述。
77.在另一个实施方案中，杆状物呈圆锥形渐缩，并且杆状物在底部处具有最大直径。从杆状物的底部到顶部逐渐变细具有与圆周壁类似的优点：ehm可以从模具分离并向上滑动，以便于添加另外的的重构混合物，特别是从底部添加。
78.技术人员知道进行组织培养实验的合适条件。在优选的实施方案中，步骤(
ⅰ
)、(
ⅱ
)和/或任选的(iv)在36.4-37.6℃的温度范围内进行，优选在36.6-37.4℃的温度范围内进行，优选在36.8-37.2℃的温度范围内进行，更优选在约37℃下进行。此外，在另一个优选的实施方案中，步骤(
ⅰ
)、(
ⅱ
)和/或任选的(iv)在存在2-10％的co2，优选2.5-8％的co2，更优选3-7％的co2，还更优选3.5-6.5％的co2，还更优选4-6％的co2，最优选约5％的co2的加湿细胞培养箱中进行。一般而言，培养可以在环境氧气或氧气载体下进行，例如可能存在基于血红蛋白的氧气载体(hboc)和基于全氟化碳的氧气载体(perfluorocarbon-based oxygen carrier，pfoc)条件下进行(iyer等人，2007)。在另一个优选的实施方案中，步骤(
ⅰ
)、(
ⅱ
)和/或任选的(iv)在存在5-40％的o2、优选10-30％的o2、更优选15-35％的o2、还更优选17-33％的o2、还更优选19-25％的o2、最优选约21％的o2的加湿的细胞培养箱中进行。此外，本领域技术人员从普通常识中知道，所述温度范围和co2范围为本领域的标准组织培养条件。此外，21％的o2相当于干燥空气中氧气的通常浓度。
79.在步骤(
ⅰ
)中，液体重构混合物发生胶凝。当重构混合物发生胶凝时，重构混合物不再是液体—换句话说是非液体的。在优选的实施方案中，胶凝的特征在于通过步骤(
ⅰ
)获得的重构混合物为凝胶状的。由于重构混合物中的胶原，重构混合物发生胶凝。例如，如果在重构混合物中使用高度纯化的牛真皮(bovine corium)(皮肤)i型酸溶胶原，则将重构混合物的ph值调节至生理ph，例如在7.0-8.0之间。在这种ph值的偏移中，胶原会形成凝胶。事实上，胶原形成凝胶(3d支架)的理想条件是ph值在7左右。生物化学上，天然胶原分子是共价交联的羟基赖氨酸和赖氨酸残基。因此，在体外，通过在37℃和接近中性的ph下交联，天然胶原分子能够自组装成胶原纤维并形成水凝胶。所述自组装胶凝过程可由ph值偏移引发，并最佳在37℃下发生。胶原水凝胶的物理化学特性受胶原浓度、聚合ph值和交联期间离子强度的影响。本领域技术人员知道该过程，并且该过程已经被用于各种组织工程应用以形成3d支架(例如，tiburcy等人，2017)。在特别优选的实施方案中，重构混合物的ph值为7.0至7.8，优选ph值为7.2至7.6，更优选ph值为7.3至7.5，最优选其中重构混合物的ph值约为7.4。
80.在另一个优选的实施方案中，步骤(
ⅰ
)中的胶凝的特征在于，如果加入到模具中，培养培养基包围重构混合物并且不溶解重构混合物。技术人员可以例如通过测试培养培养基在不同时间点之后是否溶解重构混合物来评估重构混合物的胶凝。该测试也可以在制造mehm的同时在实验试管中进行。此外，步骤(
ⅰ
)中的胶凝作用可表征为重构混合物是不透明的，优选通过如tiburcy m等人(2014)的图3b中所示目视检查来确定。
81.在强烈优选的实施方案中，步骤(
ⅰ
)进行至少15分钟，优选至多24小时，更优选20分钟至15小时，更优选30分钟至8小时，还更优选45分钟至1.5小时，最优选约1小时。
82.在另一个实施方案中，步骤(
ⅱ
)中的培养培养基包含(a)基础培养基，(b)无血清补充剂，(c)l-谷氨酰胺，(d)抗坏血酸，(e)igf-1，(f)vegf和(g)tgfβ1。然而，技术人员能够确定合适的培养培养基。例如，tiburcy等人(2017)、(2020)和schlick等人(2019)提供了适合培养ehm的示例性培养基。每个因子，如igf-1、vegf和/或tgfβ1，都可以被具有相同或相似作用的因子替代。例如，可以用刺激非肌细胞(特别是基质细胞)的任何其他因子替代tgfβ1，以启动重构混合物的致密化。
83.在优选的实施方案中，培养培养基的基础培养基选自iscove培养基、αmem培养基、dmem培养基和rpmi培养基，优选基础培养基为iscove培养基或αmem培养基，更优选其中基础培养基为iscove培养基。然而，任何合适的基础培养基均可用于本方法。基础培养基是商购可得的，也可以根据公开可用的配方生产，如atcc产品目录。如果认为合适，可以在基础培养基中补充氨基酸。在另一个优选的实施方案中，培养基可以包含无血清补充剂。无血清补充剂可以在培养培养基中提供如上文所限定的最终浓度。在另一个优选的实施方案中，步骤(ii)中的培养培养基可以包含0.4-10mm l-谷氨酰胺，优选0.8-6mm l-谷氨酰胺，更优选1.2-5mm l-谷氨酰胺，更优选1.5-4mm l-谷氨酰胺，更优选1.7-3mm l-谷氨酰胺，最优选约2mm l-谷氨酰胺。在非常强烈优选的实施方案中，步骤(ii)中的培养培养基可以包含30-3000μm抗坏血酸或其衍生物，优选100-1000μm抗坏血酸或其衍生物，更优选180-500μm抗坏血酸或其衍生物，更优选220-370μm抗坏血酸或其衍生物，更优选270-330μm抗坏血酸或其衍生物，最优选约300μm抗坏血酸或其衍生物。抗坏血酸衍生物的一个实例是抗坏血酸-2-磷酸酯。
84.在另一个优选的实施方案中，步骤(ii)中的培养培养基包含10-1000ng/ml igf1，优选50-500ng/ml igf1，更优选70-200ng/ml igf1，还更优选90-120ng/ml igf1，最优选约100ng/ml igf1。特别地，igf1可以为人igf1。
85.在另一个优选的实施方案中，步骤(ii)中的培养培养基包含2.5-10ng/ml vegf，优选3-9ng/ml vegf，更优选3.5-8ng/ml vegf，更优选4-7ng/ml vegf，更优选4.5-6ng/ml vegf，最优选约5ng/ml vegf。特别地，vegf可以为人vegf，优选地，其中vegf为vegf
165
。
86.在另一个优选的实施方案中，步骤(ii)中的培养培养基包含5-20ng/ml fgf-2，优选6-18ng/ml fgf-2，更优选7-16ng/ml fgf-2，更优选8-14ng/ml，更优选9-12ng/ml fgf-2，最优选约10ng/ml fgf-2。特别地，fgf-2可以为人fgf-2。
87.在另一个优选的实施方案中，步骤(ii)中的培养培养基包含2-8ng/ml的tgfβ1，优选3-7ng/ml的tgfβ1，更优选4-6ng/ml的tgfβ1，还更优选4.5-5.5ng/ml的tgfβ1，还更优选约5ng/ml的tgfβ1，最优选地，其中的tgfβ1为人tgfβ1。
88.在另一个优选的实施方案中，步骤(ii)中的培养培养基包含约750mg/l甘氨酸、约890mg/l l-丙氨酸、约1320mg/l l-天冬酰胺、约1330mg/l l-天冬氨酸、约1470mg/l l-谷氨酸、约1150mg/l l-脯氨酸和约1050mg/l l-丝氨酸。
89.在步骤(ii)中，重构混合物致密化。步骤(ii)得到致密化的重构混合物。在优选的实施方案中，步骤(ii)中的重构混合物致密化缩小(compact)了原始重构混合物体积的至少约20％，优选至少约25％，更优选至少约30％，更优选至少约40％，更优选至少约50％，还更优选至少约60％，更优选至少约70％，更优选至少约80％，还更优选至少约90％，如优选通过目视检查和/或视频-光学分析确定的。例如，假设ehm体积致密化在所有维度上都是对
称的，则可以通过平面测量法(planimetric method)来评估ehm体积。此外，厚度可以例如通过超声、激光干涉测量法或光学相干断层扫描来精确确定。通过结合平面面积和厚度测量，可以确定ehm体积。在优选的实施方案中，步骤(ii)的完成是通过以下步骤确定的：(a)通过进行步骤(
ⅰ
)和(ii)产生与mehm平行的环形形式的工程化心肌(ehm)，以及(b)确定环形形式的工程化心肌(ehm)从模具中脱离，如tiburcy m等人的collagen-based engineered heart muscle,methods mol biol.2014；1181:167-176的图3c中所述。通过并行生成环形形式的ehm可以很容易地评估从模具中的脱离，因为脱离是明显可见的。例如，本文的图5c也示出了环形形式的ehm从模具中的明显的脱离。在进一步优选的实施方案中，步骤(ii)的完成可以通过通过以下步骤(
ⅰ
)和(ii)产生与mehm平行的环形形式的ehm来进一步确定，并且其中环形形式的重构混合物致密化缩小(compact)了原始重构混合物横截面积的至少20％，优选至少25％，更优选至少30％，更优选至少40％，更优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，还更优选至少90％。所述致密化可以通过目视检查和/或ehm的视频-光学分析来评估。本文的图5c作为一个实例示出了环形形式的ehm的最佳致密化。
90.在特别优选的实施方案中，步骤(ii)进行至少12小时，优选最多15天，更优选12小时至7天，优选14小时至6天，更优选16小时至5.5天，更优选18小时至5天，更优选20小时至4.5天，还更优选22小时至4天，还更优选23小时至3.5天，最优选24小时至3天。
91.在步骤(iii)中，将另外的重构混合物从顶部和/或底部加入到步骤(ii)的重构混合物中。在优选的实施方案中，在步骤(iii)a)中，将一种另外的重构混合物加入到步骤(ii)的致密化的重构混合物的顶部。在另一个优选的实施方案中，在步骤(iii)a)中，将一种额外的重构混合物从底部加入到步骤(ii)的致密化的重构混合物中。在另一个优选的实施方案中，在步骤(iii)a)中，将一种额外的重构混合物从顶部和底部同时加入到步骤(ii)的致密化的重构混合物中。在一个更优选的实施方案中，在步骤(iii)a)中，将另外的重构混合物从顶部和/或底部涂覆步骤(ii)的致密化的重构混合物。例如，步骤(ii)的致密化的重构混合物和步骤(iii)a)的另外的重构混合物的表面积是相同的。为便于说明，图3所示的五层的ehm是通过对步骤(ii)的致密化的重构混合物进行涂覆而生成的，并且其中步骤(iii)a)的另外的重构混合物和步骤(ii)的致密化的重构混合物的表面积相同。在另一个实例中，在步骤(iii)a)中，另外的重构混合物从顶部或底部涂覆步骤
ⅱ
)的致密化的重构混合物的限定区域(restricted area)。步骤(
ⅲ
)a)的另外的重构混合物的表面积可以小于步骤(
ⅱ
)的重构混合物的表面积。为便于说明，图8c2描绘了入口，可将其置于步骤(
ⅱ
)的致密化的重构混合物上，以便在步骤(
ⅱ
)的致密化的重构混合物之上提供较小尺寸的液体重构混合物。例如，步骤(
ⅲ
)a)的重构混合物的较小表面积可以是根据病人的特定缺陷或另一种期望的形状可调整的。这样做的优点在于与mehm的其余部分相比，用于心脏修复的mehm可以在特定的限定区域增强更多(more enforced)。
92.在另一个实施方案中，另外的重构混合物的表面积大于步骤(
ⅱ
)的致密化的重构混合物的表面积。例如，在步骤(
ⅲ
)b)中，不同的模具具有比步骤(
ⅰ
)的模具更大的浇注区域，优选地，其中另外的重构混合物至少从顶部或从底部涂覆步骤(
ⅱ
)的致密化的重构混合物。还更优选的是，另外的重构混合物从顶部或从底部涂覆步骤(
ⅱ
)的致密化的重构混合物，并填充不同模具的较大浇注区域。为了便于说明，图8c1描绘了较小尺寸的致密化的
重构混合物已被转移到具有较大表面积的模具中。例如，在步骤(iii)b)中，不同模具的较大表面积可以是根据患者的特定缺陷可调整的。这样做的优势在于，用于心脏修复的mehm可以根据具体需要进行定制。
93.通过在步骤(iii)中添加另外的重构混合物，产生了额外的ehm层。因此，添加另外的重构混合物使ehm逐层增厚。所需厚度可以由技术人员确定。例如，mehm可用作人类心脏的植入物。优选地，通过例如超声心动图、磁共振成像或计算机断层摄影的现有技术的成像技术对人体缺陷进行成像，可以确定期望的厚度和尺寸。在优选的实施方案中，重复步骤(
ⅲ
)a)或(
ⅲ
)b)至少2次，优选至少3次，更优选至少4次，更优选至少5次，更优选至少6次，更优选至少7次，更优选至少8次，还更优选至少9次，最优选至少10次。在还更优选的实施方案中，重复步骤(iii)a)或(
ⅲ
)b)2-200次，优选2-100次，更优选2-80次，更优选2-70次，更优选2-60次，更优选2-50次，更优选2-40次，更优选3-30次，更优选3-25次，更优选4-20次，更优选4-15次，更优选4-10次，还更优选5-9次，最优选5-8次。然而，技术人员能够确定步骤(
ⅲ
)应该重复多少次，以及是否应进行步骤(
ⅲ
)a)或(
ⅲ
)b)。本领域技术人员将以所需的尺寸和几何形状为指引，从而评估这些层是否应该具有相同的表面积，或者个别层是否应更小或更大。例如，技术人员可能需要心脏植入物。因此，单个层的表面积将根据心肌缺损的大小进行定制。此外，mehm的厚度理想地与健康组织的厚度相匹配。例如，一种致密化的重构混合物的厚度可以为例如约500μm。为了达到最大10mm的所需心壁厚度(kawel等人(2012))，可以分层堆积(layered)20种致密化的重构混合物。在另一个实例中，致密化的重构混合物可以比500μm更薄。那么，可能需要将50种重构混合物分层堆积，以获得典型的心壁厚度。技术人员能够确定需要多少种重构混合物才能获得具有典型的人类心脏厚度和/或患者心肌缺损厚度的mehm。
94.在完成步骤(
ⅲ
)后，ehm可以在成熟化培养基中进一步成熟(matured)。技术人员可以在例如tiburcy等人(2017)或tiburcy等人(2020)中找到成熟化培养基的示例性组成。在特别优选的实施方案中，步骤(iv)中的成熟化培养基限定为上述培养培养基，不同之处在于与培养培养基相比，成熟化培养基中省去了tgfβ1。在还更优选的实施方案中，步骤(iv)进行4-200天，优选6-150天，更优选8-120天，更优选9-110天，更优选10-90天，更优选15-70天，更优选20-50天，最优选28-42天。
95.在优选的实施方案中，步骤(
ⅲ
)的mehm在步骤(iv)中在合适的成熟化培养基中培养，由此，步骤(iv)的mehm表现出增强的成熟性(maturation)，如通过心肌细胞肌节蛋白(cardiomyocyte sarcomeric protein)丰度的增加确定的，例如对一种或几种所述蛋白进行抗体标记后通过荧光显微镜所确定的例如α肌节肌动蛋白、肌球蛋白重链蛋白、肌球蛋白轻链蛋白和肌钙蛋白、蛋白印迹法、流式细胞术或rna测序以确定各自蛋白编码转录本的丰度，如tiburcy等人的circulation 135(19)1832-1847(2017)中所述的。此外，当与步骤(iii)的mehm相比时，步骤(iv)的mehm可以表现出增强的发力，其中增强的发力通过使用在tiburcy等人的circulation 135(19)1832-1847(2017)中描述的方法进行面积变化分数(fac)测量来确定，并且其中步骤(iv)的mehm在电刺激时的面积变化分数(fac)为至少0.5％，优选至少1％，更优选至少1.2％，更优选至少1％，更优选至少2％，更优选至少3％，还更优选至少5％。
96.本文所公开的方法的一个特别的优点在于在重构混合物/mehm内的细胞在任何时
候都能得到充分的营养和氧气供应。充分的营养供应理想地通过在制造过程中始终通过穿孔杆状物形成通道，以确保最低限度可接受的表面-组织扩散距离来实现，同时仍产生加厚的mehm，其例如可用作植入物。例如，杆状物间距离可以为3.5mm，使得扩散距离为1.75mm，即从杆状物(组织表面)到组织核心(两个杆状物之间的中心；图8和上文进一步描述的)的距离。换句话说，从组织表面(杆状物或顶表面/底表面)到组织核心的扩散距离保持在最佳状态。所述扩散距离可以通过穿孔杆状物的数量和杆状物的设计来调整。最佳表面-组织扩散距离可以通过组织缺氧测量(例如，使用hesse ar等人(2014)中描述的odd-luc缺氧报告基因(hypoxia reporter))或细胞活力测定(例如，使用熟知的活力染料)来确定。活力染料，也称为活/死染色剂，是本领域已知的，并且可以从各种供应商购获得。例如，细胞内酯酶(intracellular esterase)可以在活细胞中水解染料以产生亲水性的强荧光化合物，从而可以在活细胞中以例如ex/em＝485/530nm测量荧光信号。死细胞染料进入受损细胞膜，与核酸结合后可能会发生40倍的荧光增强，从而在死细胞中产生鲜红色荧光(ex/em＝495/635nm)。在mehm制品(formulation)中，表面-组织距离由穿孔杆状物的杆状物间距离来限定。图8所示为合适的3.5mm的杆状物间距离实例，导致最大表面-核心扩散距离为1.75mm。举例来说，如果选择3.5mm的杆状物间距离，无论mehm厚度如何，最大表面-组织核心扩散距离均为1.75mm。本领域技术人员可以根据本文提供的信息，根据需要确定和调整mehm中的最佳杆状物间距离，以确保在所需尺寸和厚度的整个mehm中提供氧气和营养。例如，当通过以下步骤(
ⅰ
)、(ii)和(iv)产生单层的ehm时，8ml的液体重构混合物致密化至约0.8ml，如图3c右侧所示。此类单层的ehm可以在0.5mm和1mm之间。因此，在整个过程中，重构混合物可以致密化约90％。然而，理想情况下，临床使用的人工心脏组织的厚度为至少5mm，以维持心脏跳动的应力并支持心脏跳动。作为一个思考实验(thought experiment)，并且为了获得具有单一重构混合物的厚度为至少5mm的ehm，技术人员将需要浇注至少80ml的重构混合物，这相当于50mm(5cm)的液体重构混合物的厚度。然而，在这种厚度的单一重构混合物的中心处的细胞将不能在这种方法中存活，因为由于缺氧和缺乏营养所述细胞将在重构混合物的核心部位遭受坏死，并且随后使组织致密化。穿孔杆状物的引入规避了这一限制，因为它建立了所需的最佳表面-组织核心扩散距离，以确保整个mehm中有充足的氧气和营养供应。
97.本文公开的方法的另一个关键优点在于各层是依次添加的。因此，每种另外的重构混合物合并到步骤(
ⅱ
)的致密化的重构混合物中。由于所述合并，产生的mehm源自几个层，然而，这些层是不可分离的。换句话说，形成的mehm表现得像单层肌肉，因为各个层合并形成单一实体。与wo2007054286、zimmermann等人2006和naito等人2006中公开的单独堆叠的工程化心肌的融合(fusion)相比，这是一个特别的优势。
98.在优选的实施方案中，用缺氧报告基因测定缺氧。在特别优选的实施方案中，mehm中的心肌细胞得到充分的氧气供应，优选其中氧气供应由odd-luc缺氧报告基因测定，如hesse ar等人(2014)中所述。如图3d所示，该实施方案也得到实验证据的支持。在所述实验中，mehm最内层的心肌细胞和单层ehm的心肌细胞包含odd-lux缺氧报告基因。从图3d的对比中可以看出，单层ehm实际上表现出比5层ehm更缺氧。在特别优选的实施方案中，mehm中的心肌细胞得到充分的氧气供应，这是通过如hesse ar等人(2014)中所述的odd-luc缺氧报告基因所测定的，优选地，其中如果mehm的心肌细胞的平均相对发光是通过本方法的以下步骤(
ⅰ
)、(
ⅱ
)和任选的(iv)获得的单层ehm中的平均相对发光的至多6倍，更优选至多5
倍，更优选至多4倍，更优选至多3倍，更优选至多2.5倍，还更优选至多2倍，并且还更优选至多1.5倍，则确保足够的氧气供应。在还更优选的实施方案中，mehm中的心肌细胞得到充分的氧气供应，这是由如hesse ar等人(2014)中所述的odd-luc缺氧报告基因所测定的，并且其中mehm的心肌细胞的平均相对发光不大于在单层ehm的心肌细胞中测量的平均相对发光，例如在图3c中实验性地示出的。
99.在另一方面，还描述了通过本文公开的方法获得的多层工程化心肌(mehm)。此外，还描述了通过本文公开的方法可获得的多层工程化心肌(mehm)。
100.在另一方面，公开了多层工程化心肌(mehm)，其中mehm包括(a)胶原和(b)心肌细胞和非肌细胞的细胞混合物，并且其中ehm包括至少2层。mehm优选为补片、袋或圆柱体。还更优选的是，mehm的厚度为至少0.2mm。进一步优选的是，mehm是通过重复且依次进行成层的方法(repetitive and sequential layering method)产生的，其中mehm源自2-200层。进一步优选的是，这些层已经相互合并，从而增加了mehm厚度。本领域技术人员知道，细胞混合物需要培养基来为细胞提供营养。还更优选的是，mehm的每一层均源自重构混合物，并且其中重构混合物包含(a)胶原，(b)心肌细胞和非肌细胞的细胞混合物，以及(c)合适的重构介质。
101.在优选的实施方案中，描述了一种多层工程化心肌(mehm)，其中mehm的特征在于mehm已经通过重复且依次进行成层的方法产生，其中mehm源自2-200层，其中这些层已经相互合并并由此增加了mehm厚度，其中每层均源自重构混合物，并且其中每种重构混合物包括(a)胶原，(b)心肌细胞和非肌细胞的细胞混合物以及(c)合适的重构介质。
102.还更优选的是，mehm能够收缩，如通过使用tiburcy等人在circulation 135(19)1832-1847(2017)中描述的方法测定mehm的面积变化分数(fac)来测量的。在还更优选的实施方案中，fac在电刺激时为至少0.5％，优选其中fac为至少0.7％，更优选至少1％，更优选至少2％，更优选至少3％，还更优选至少5％。
103.在非常优选的实施方案中，mehm源自2-100层，优选2-80层，更优选2-70层，更优选2-60层，更优选2-50层，更优选2-40层，更优选3-30层，更优选3-25层，还更优选4-20层。例如，对于制造作为人体植入物的用途的mehm而言，每种重构混合物的单独的充分致密化的厚度(individual fully compacted thickness)为0.5mm的20层可能是理想的设置。
104.由于至少有两层，mehm的厚度可以为0.2mm至约30mm，优选约0.3mm至约30mm，更优选约0.5mm至约30mm，更优选约0.7mm至约25mm，更优选约0.9mm至约20mm，更优选约1mm至约17mm，更优选约2.3mm至约15mm，更优选约2.8mm至约14mm，更优选约3.3mm至约13mm，更优选约3.8mm至约12mm，更优选约4.2mm至约11mm，更优选约4.6mm至约10.5mm，最优选约5mm至约10mm。
105.还更优选的是，mehm没有血管化和/或mehm不受中枢神经系统的控制。在优选实施方案中，mehm被贯穿mehm的具有相似扩散距离的至少2个杆状物穿孔，以确保细胞混合物的营养和氧气供应。例如，mehm中的心肌细胞得到了足够的氧气供应，优选其中氧气供应由odd-luc缺氧报告基因确定，如hesse ar等人(2014)所述。具体而言，mehm中的心肌细胞可以得到充分的氧气供应，这是通过如hesse ar等人(2014)中所述的odd-luc缺氧报告基因来确定的，优选地，其中如果mehm的心肌细胞的平均相对发光是单层ehm中的平均相对发光高的至多6倍，更优选至多5倍，更优选至多4倍，更优选至多3倍，更优选至多2.5倍，还更优
选至多2倍，并且还更优选至多1.5倍，则可以确保足够的氧气供应，其中单层ehm可以通过如本文所公开的方法的以下步骤(
ⅰ
)、(
ⅱ
)和任选的(iv)获得。
106.特别优选的是，mehm中的心肌细胞得到充分的氧气供应，这是由hesse ar等人(2014)中所述的odd-luc缺氧报告基因确定的，并且其中mehm的心肌细胞的平均相对发光不大于在单层ehm的心肌细胞中测得的平均相对发光。
107.在优选的实施方案中，mehm是通过本文公开的方法的任何实施方案或实施方案的组合获得的。本文所公开的mehm可能表现出关于本文所公开方法的任何特征。
108.在另一方面，mehm是通过进行本文公开的方法的步骤(
ⅰ
)-(iii)而获得的。
109.在另外的方面，公开了一种工程化心肌，优选工程化心脏补片、工程化心脏袋或工程化心脏圆柱体，其中ehm包括(a)胶原，(b)心肌细胞和非肌细胞的细胞混合物，并且其中ehm具有至少约0.6mm的厚度。优选地，所述ehm是mehm并且包括至少2层。
110.在另一方面，还描述了通过本文公开的方法获得的mehm或本文公开的mehm在用于药物筛选的体外模型中的用途。特别是，mehm可用于在体外模型中进行药物毒性筛选或药物疗效筛选。
111.此外，还描述了通过本文公开的方法获得的mehm或本文公开的mehm在体外制造工程化人心肌中的用途。在优选的实施方案中，mehm具有三维形状以匹配患者特异性心肌缺损，更优选地，其中患者特异性心肌缺损是通过mri、超声、计算机断层扫描、正电子发射断层扫描和/或光学相干断层扫描来评估的。技术人员知道所有这些方法，因为它们是本领域的标准实践。在评估了三维患者特异性心肌缺损后，技术人员可以生成具有定制尺寸的mehm。例如，技术人员可以根据患者的心肌壁厚度，优选根据缺损发生前患者的心肌壁厚度来生产mehm。
112.通过本文公开的方法获得的mehm或本文公开的mehm也可用作研究工具。
113.在另外的方面，还预期了通过本文公开的方法获得的mehm或本文公开的mehm用于药物的用途。特别地，预期将通过本文公开的方法获得的mehm或本文公开的mehm用于心脏修复的用途。例如，mehm可以是一种植入物。所述植入物可用于治疗患有心力衰竭的患者。在优选的实施方案中，mehm被永久地应用于患者的心脏。mehm在心脏上的这种永久性应用可通过标准手术程序实现，例如缝合、钉合(stapling)或胶合(gluing)。例如，可以将mehm缝合到患者的心脏上。
114.最后，还公开了治疗患有心力衰竭的个体(subject)的方法，该方法包括向患者的心脏施用通过本文公开的方法获得的mehm。在优选的实施方案中，该方法包括将mehm附着于个体的心脏上，并且其中附着优选包括将mehm缝合到心脏上。
115.本发明通过以下实施方案进一步描述：
116.1.一种制造多层工程化心肌(mehm)的方法，该方法包括以下步骤：(i)在模具中提供液体重构混合物，其中所述重构混合物被至少两个杆状物穿孔，其中所述重构混合物包括(a)胶原，(b)心肌细胞和非肌细胞的细胞混合物和(c)合适的重构介质，由此所述重构混合物在模具中发生胶凝，(ii)将通过步骤(i)获得的在所述模具中的混合物在合适的培养培养基中进行培养，由此重构混合物在模具中致密化；(iii)a)将另外的如步骤(i)中所限定的液体重构混合物从顶部和/或底部加入到
由步骤(ii)获得的致密化的重构混合物中，由此所述另外的液体重构混合物发生胶凝，随后在与步骤(ii)中相同的条件下进行培养，由此所述另外的重构混合物在模具中致密化；或b)将由步骤(ii)获得的致密化的重构混合物转移到不同的模具中，其中所述重构混合物被至少两个杆状物穿孔，随后在所述不同的模具中进行步骤(
ⅲ
)a)；从而获得多层工程化心肌(mehm)，优选地，其中mehm通过重复步骤(iii)a)和/或步骤(iii)b)至少一次而加厚，和(iv)任选地，将在所述模具中的步骤(iii)的mehm在合适的成熟化培养基中进行培养，其中，该mehm能够收缩。
117.2.根据实施方案1所述的方法，其中mehm收缩的能力是通过目视检查和/或通过确定步骤(
ⅰ
)的重构混合物通过进行步骤(
ⅰ
)、(ii)和任选的(iv)来形成产生力的工程化心肌的能力来评估的，并且其中工程化心肌能够产生为至少0.05mn收缩力(foc)的收缩力，如在tiburcy等人的circulation 135(19)1832-1847(2017)的附加图6c中的标准等距条件下测得的。
118.3.根据实施方案2所述的方法，其中mehm的收缩是通过平行评估步骤(i)的重构混合物通过进行步骤(i)、(ii)和(iv)来形成环形形式的产生力的工程化人肌肉的能力进一步确定的，如在tiburcy等人的circulation135(19)1832-1847(2017)中所述，并且其中环形形式的工程化心肌产生至少0.05mn的收缩力(foc)，如在tiburcy等人的circulation135(19)1832-1847(2017)的附加图6c中所测得的。
119.4.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中mehm产生的收缩力(foc)为至少0.05mn，更优选至少0.1mn，更优选至少0.3mn，更优选至少0.5mn，更优选至少1mn，更优选至少3mn，还更优选至少5mn，最优选至少10mn。
120.5.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中mehm的每一层的厚度为至少约0.1mm、至少约0.15mm、至少约0.2mm、至少约0.25mm、至少约0.3mm、至少约0.4mm或至少约0.5mm。
121.6.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中mehm的厚度为约0.2mm至约30mm，优选约0.3mm至约30mm，优选约0.5mm至约30mm，更优选约0.7mm至约25mm，更优选约0.9mm至约20mm，更优选约1.5mm至约17mm，更优选约2mm至约15mm，更优选约2.8mm至约14mm，更优选约3.3mm至约13mm，更优选约3.8mm至约12mm，更优选约4.2mm至约11mm，更优选约4.6mm至约10.5mm，最优选约5mm至约10mm。
122.7.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中mehm的收缩是通过面积变化分数(fac)测量来视频-光学地测量的(measured video-optically)。
123.8.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中收缩是通过使用在tiburcy等人的circulation 135(19)1832-1847(2017)中描述的方法对mehm进行面积变化分数(fac)测量来确定的，并且其中面积变化分数(fac)在电刺激时为至少0.5％，优选其中fac为至少0.7％，更优选地为至少1％，更优选地为至少2％，更优选地为至少3％，还更优选地为至少5％。
124.9.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中重构混合物的ph值为7.0至7.8，
优选地，ph值为7.2至7.6，更优选地，ph值为7.3至7.5，最优选地，其中重构混合物的ph值为约7.4。
125.10.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中重构混合物提供最终浓度为0.5mg/ml至3mg/ml的胶原，优选地，0.55mg/ml至2.5mg/ml的胶原，更优选地，0.6mg/ml至2.2mg/ml的胶原，更优选地，0.65mg/ml至2mg/ml的胶原，更优选地，0.7mg/ml至1.75mg/ml的胶原，更优选地，0.75mg/ml至1.5mg/ml的胶原，更优选地，0.8mg/ml至1.2mg/ml的胶原，还更优选地，0.85mg/ml至1mg/ml的胶原，最优选地，约0.9mg/ml的胶原。
126.11.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中步骤(
ⅰ
)的胶原选自i型胶原、iii型胶原、iv型胶原、v型胶原、vi型胶原、xii型胶原、xiii型胶原、xiv型胶原、xv型胶原及它们的混合物。
127.12.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中步骤(
ⅰ
)的重构混合物的至少90％的胶原为i型胶原。
128.13.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中步骤(
ⅰ
)的重构混合物的胶原是医用级的。
129.14.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中步骤(
ⅰ
)的重构混合物的胶原为牛来源的、马来源的、人来源的或海洋来源的，优选其中胶原为牛来源的。
130.15.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中步骤(
ⅰ
)的混合物的胶原还包含除胶原以外的一种或一种以上额外的细胞外基质成分，优选地，其中所述一种或一种以上额外的基质成分选自天然存在或合成的细胞外基质成分，更优选地，其中细胞外基质成分选自弹性蛋白、层粘连蛋白、内功素(entactin)、巢蛋白(nidogen)、蛋白聚糖、糖胺聚糖和纤维粘连蛋白或它们的合成模拟物。
131.16.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中步骤(
ⅰ
)中的细胞混合物在重构混合物中提供1
×
10
6-26.5
×
106个细胞/ml，优选2
×
10
6-13.2
×
106个细胞/ml，更优选3
×
10
6-10
×
106个细胞/ml，更优选3.5
×
10
6-9
×
106个细胞/ml，更优选4
×
10
6-8
×
106个细胞/ml，更优选4.3
×
10
6-7
×
106个细胞/ml，更优选4.6
×
10
6-6
×
106个细胞/ml，还更优选约5
×
106个细胞/ml的最终细胞浓度。
132.17.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中心肌细胞是人心肌细胞。
133.18.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中心肌细胞源自胚胎干细胞，其中该细胞不是使用涉及修饰人的种系遗传特性或涉及将人胚胎用于工业或商业目的的方法而产生的。
134.19.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中心肌细胞源自诱导多能干细胞、孤雌干细胞、程序性体细胞或成体干细胞，优选地，其中心肌细胞源自诱导多能干细胞。
135.20.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中心肌细胞通过无血清分化获得，优选地，其中心肌细胞通过遵循wo2015/040142的方案或诸如在burridge等人(2012)，production of de novo cardiomyocytes:human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming.cell stem cell.2012jan 6；10(1):16-28或zimmermann(2020)中所综述的替代方案而获得。
136.21.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中心肌细胞是非人灵长类干细胞来源的、胎儿的或新生儿的心肌细胞。
137.22.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中如通过流式细胞术或rna测序确定的，心肌细胞表达actn2、ttn、ryr2和肌钙蛋白。
138.23.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中步骤(
ⅰ
)的细胞混合物包含的心肌细胞为至少10％，优选至少20％，更优选至少30％，还更优选至少40％，最优选至少50％。
139.24.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中mehm的收缩是由心肌细胞引起的，从而产生mehm的收缩发力。
140.25.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中非肌细胞选自基质细胞、内皮细胞、平滑肌细胞和间充质干细胞中的一种或多种，优选其中非肌细胞为基质细胞或内皮细胞，更优选地，其中非肌细胞为基质细胞，还更优选地，其中基质细胞为心脏基质细胞，还更优选地，其中心脏基质细胞具有成纤维细胞特性，还更优选地，其中心脏基质细胞为成纤维细胞。
141.26.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中非肌细胞表达cd90，如通过流式细胞术测定的，优选其中非肌细胞表达cd90、cd74和cd44，还更优选地，其中非肌细胞分泌细胞外基质蛋白，特别是胶原，和/或表达整合素以促进细胞-基质相互作用，其中非肌细胞使重构混合物致密化(compact the reconstitution mixture)。
142.27.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中非肌细胞源自胚胎干细胞，其中该细胞不是使用涉及修饰人的种系遗传特性或涉及将人胚胎用于工业或商业目的的方法而产生的。
143.28.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中非肌细胞源自诱导多能干细胞、孤雌干细胞、程序性体细胞、成体干细胞或间充质干细胞，优选其中非肌细胞源自诱导多能干细胞。
144.29.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中非肌细胞来源于从人类个体获得的活体组织，优选来源于患者，还更优选来源于用于自体或同种异体施用mehm的患者。
145.30.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中非肌细胞通过无血清分化获得，优选地，其中非肌细胞通过遵循ep20188364.2；witty ad,mihic a,tam ry等人，generation of the epicardial lineage from human pluripotent stem cells,nat biotechnol.2014；32(10):1026-1035；iyer d等人，robust derivation of epicardium and its differentiated smooth muscle cell progeny from human pluripotent stem cells.development,2015apr 15；142(8):1528-41；bao x等人，long-term self-renewing human epicardial cells generated from pluripotent stem cells under defined xeno-free conditions,nat biomed eng.2016；1；或bao x等人，directed differentiation and long-term maintenance of epicardial cells derived from human pluripotent stem cells under fully defined conditions,nat protoc.2017sep；12(9):1890-1900的方案获得。
146.31.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中步骤(
ⅰ
)的细胞混合物的非肌细胞为基质细胞，优选地，其中基质细胞为人基质细胞。
147.32.根据实施方案31所述的方法，其中步骤(
ⅰ
)的细胞混合物包含至少10％，优选至少20％，更优选至少30％，还更优选至少40％，还更优选至少50％的基质细胞。
148.33.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中非肌细胞，优选基质细胞，能够
使步骤(ii)中的重构混合物致密化。
149.34.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中重构介质包含(a)基础培养基和(b)无血清补充剂。
150.35.根据实施方案34所述的方法，其中无血清补充剂提供最终浓度为0.5-50mg/ml的白蛋白、1-100μg/ml的转铁蛋白、0.1-10μg/ml的乙醇胺、0.003-0.3μg/ml的亚硒酸钠、0.4-40μg/ml的左旋肉碱盐酸盐、0.1-10μg/ml的氢化可的松、0.05-5μl/ml的脂肪酸补充剂和0.0001-0.1μg/ml的三碘-l-甲状腺原氨酸(t3)。
151.36.根据实施方案34或35所述的方法，其中无血清补充剂还包含以下一种或多种组分：维生素a、d-半乳糖、亚油酸、亚麻酸、孕酮和腐胺。
152.37.根据实施方案34-36中任一项所述的方法，其中无血清补充剂为去除胰岛素的b27补充剂。
153.38.根据实施方案34-37中任一项所述的方法，其中无血清补充剂为2-6％(v/v)的去除胰岛素的b27补充剂，优选其中无血清补充剂为4％(v/v)的去除胰岛素的b27补充剂。
154.39.根据实施方案34-38中任一项所述的方法，其中步骤(
ⅰ
)中的基础培养基选自iscove培养基、rpmi、αmem和dmem或它们的混合物，优选地，其中基础培养基选自iscove培养基、rpmi、αmem或它们的混合物，更优选地，其中基础培养基是iscove培养基和rpmi的混合物。
155.40.根据实施方案34-39中任一项所述的方法，其中重构介质还包含(c)35-790um抗坏血酸，(d)5-500ng/ml igf-1，(e)0.3-26ng/ml vegf，(f)0.5-53ng/ml fgf-2和(g)0.5-10ng/ml tgfβ1；优选地，其中重构介质还包含(c)75-300um抗坏血酸，(d)26-105ng/ml igf-1，(e)1.3-5.2ng/ml vegf，(f)2.6-10.5ng/ml fgf-2和(g)1-6ng/ml tgfβ1；更优选地，其中重构介质还包含(c)约158um抗坏血酸，(d)约53ng/ml igf-1，(e)约2.6ng/ml vegf，(f)约5.3ng/ml fgf-2和约3ng/ml tgfβ1。
156.41.根据实施方案40所述的方法，其中vegf为vegf
165
。
157.42.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中模具的形成是为了便于形成平面形状的ehm、袋状的ehm或圆柱状的ehm。
158.43.根据实施方案42所述的方法，其中模具的形成是为了便于形成平面形状的ehm，优选地，其中模具具有盘的形式，优选地，其中盘具有圆形或多边形盘的形式，更优选地，其中模具具有六边形盘的形式，最优选地，其中盘具有补片状形状(patch-like shape)；或者其中模具形成受限的三维空间，优选地，其中三维空间具有圆形或多边形三维空间的形式，更优选地，其中模具具有六边形三维空间的形式，还更优选地，其中三维空间具有补片状形状。
159.44.根据实施方案42所述的方法，其中模具的形成是为了便于形成袋状的ehm，优选地，其中模具具有袋的形式(form)，更优选地，其中模具具有球状或椭圆状袋的形式，还更优选地，其中模具由内部和外部的球状或椭球状壁形成，更优选地，其中内部和外部的球状或椭球状壁是可充气的。
160.45.根据实施方案42所述的方法，其中模具的形成是为了便于形成圆柱状的ehm，优选地，其中模具具有圆柱的形式，更优选地，其中模具为圆柱形模具，更优选地，其中圆柱
形模具由内部和外部的球状或椭球状壁形成；或者其中圆柱形模具由单个圆柱形壁形成，并且其中圆柱形模具通过离心作用(centrifugation)被重构混合物覆盖。
161.46.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中重构混合物被至少两个杆状物穿孔，并且其中杆状物是柔性的，从而能够在mehm上引入机械负荷。
162.47.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中杆状物能够允许在步骤(ii)、(iii)中用培养培养基灌注mehm，并且任选地，在步骤(iv)中用成熟化培养基灌注mehm，并且在步骤(ii)、(iii)和任选的(iv)中用氧气灌注mehm，优选地，其中培养培养基灌注和成熟化培养基灌注导致在步骤(ii)、(iii)和/或任选的(iv)期间对心肌细胞和非肌细胞的营养支持。
163.48.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中重构混合物从底部或从顶部被所述至少两个杆状物穿孔，优选地，其中重构混合物在其整个厚度上被穿孔。
164.49.根据实施方案48所述的方法，其中至少两个杆状物从底部对重构混合物进行穿孔，并且其中模具具有盘的形式，优选地，其中至少两个杆状物从所述模具的底部延伸穿过重构混合物，更优选地，其中杆状物永久地附接到所述模具或基板(base plate)上，更优选地，其中杆状物永久地附接到模具的浇注区域或附接到模具的可移除基板，还更优选地，其中(a)模具和至少两个杆状物或(b)可移除基板和至少两个杆状物被3d打印为一个实体。
165.50.根据实施方案48所述的方法，其中至少两个杆状物从顶部对重构混合物进行穿孔，并且其中模具具有盘的形式，优选地，其中至少两个杆状物从顶部插入到液体重构混合物中。
166.51.根据实施方案48所述的方法，其中至少两个杆状物从底部对重构混合物进行穿孔，并且其中模具具有袋的形式，优选地，其中袋由内部和外部的球状或椭球状壁形成，更优选地，其中至少两个杆状物从内部和外部的球状或椭球状壁延伸，更优选地，其中杆状物永久地附接到内部和外部的球状或椭球状壁。
167.52.根据实施方案48所述的方法，其中至少两个杆状物从顶部对重构混合物进行穿孔，并且其中模具具有袋的形式，优选地，其中袋由内部和外部的球状或椭球状壁形成，更优选地，其中至少两个杆状物从内部和外部的球状或椭球状壁延伸，更优选地，其中杆状物永久地附接到外部的球状或椭球状壁。
168.53.根据实施方案48所述的方法，其中至少两个杆状物从底部对重构混合物进行穿孔，其中模具为圆柱形模具，并且其中圆柱形模具由内部和外部的球状或椭球状壁形成，优选地，其中至少两个杆状物从外圆柱形壁延伸穿过重构混合物，更优选地，其中杆状物永久地附接到外圆柱形壁，还更优选地，其中包括至少两个杆状物的外圆柱形壁被3d打印为一个实体(entity)。
169.54.根据实施方案48所述的方法，其中至少两个杆状物从顶部对重构混合物进行穿孔，其中模具为圆柱形模具，并且其中圆柱形模具由内圆柱形壁和外圆柱形壁形成，优选地，其中至少两个杆状物从内圆柱形壁延伸穿过重构混合物，更优选地，其中杆状物永久地附接到内圆柱形壁，还更优选地，其中包括至少两个杆状物的内圆柱形壁被3d打印为一个实体。
170.55.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中每种重构混合物的体积为0.5-200ml，优选1-150ml，更优选1.5-100ml，更优选2-50ml，更优选2.5-40ml，更优选3-30ml，更
优选3.5-25ml，更优选4-20ml，更优选4.5-15ml，更优选5-11.5ml，更优选6-9.5ml，还更优选6.5-8.5ml，最优选为约8ml。
171.56.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中模具容纳的体积为1-400ml，优选2-300ml，更优选3-200ml，更优选4-100ml，更优选5-80ml，更优选6-60ml，更优选6.5-50ml，更优选7-40ml，更优选7.5-30ml，更优选8-23ml，更优选13-19ml，还更优选13-17ml，还更优选15ml，最优选其中模具用于形成ehm，其为补片状、袋状或圆柱状。
172.57.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中模具的尺寸为1-400cm2，优选2-300cm2，更优选3-200cm2，更优选4-100cm2，更优选5-80cm2，更优选6-60cm2，更优选7-50cm2，更优选8-40cm2，更优选9-30cm2，更优选10-23cm2，更优选12-19cm2，还更优选13-17cm2，还更优选16cm2的尺寸，最优选其中模具用于形成补片状的ehm。
173.58.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中重构混合物被至少三个杆状物穿孔。
174.59.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中杆状物被布置为网格，优选地，其中杆状物被布置为三角形或矩形网格，优选地，被布置为三角形网格。
175.60.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中重构混合物被至少5个杆状物、更优选至少7个杆状物、更优选至少14个杆状物、还更优选至少20个杆状物、还更优选至少30个杆状物、还更优选至少37个杆状物、最优选至少52个杆状物、最优选至少61个杆状物穿孔。
176.61.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中每个杆状物都具有底座区域(base area)，并且其中底座为圆形、矩形、椭圆形、三角形或多边形，优选地，其中底座区域为圆形。
177.62.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中杆状物具有相似或不同的弹性特性。
178.63.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中，杆状物的弹性特性由mehm与杆状物接触的点处的工作弹簧刚度来限定，优选地，其中回复力为0.5至50mn/mm，更优选地为0.7至40mn/mm，还更优选地为0.9至30mn/mm，还更优选地为1至20mn/mm，还更优选地为2至10mn/mm，还更优选地为3至5mn/mm，最优选地为约4mn/mm。
179.64.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中杆状物的弹性特性模拟人类心脏中的壁张力，优选地，其中壁张力为1至20千帕。
180.65.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中杆状物的弹性特性表现出不同的弹性模量以建立生物力学各向异性。
181.66.根据实施方案1-64中任一项所述的方法，其中杆状物的弹性特性表现出相似的弹性模量以建立生物力学各向同性。
182.67.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中在杆状物的下部杆状物被圆周壁包围，其中圆周壁形成围绕杆状物的环形斜坡，并且其中环形斜坡从底部向上逐渐变细。
183.68.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中杆状物呈锥形地逐渐变细，并且其中杆状物在底部处具有最大直径。
184.69.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中杆状物的直径为0.5至3mm，优选地为0.6至2.5mm，更优选地为0.65至2mm，还更优选地为0.7至1.7mm，还更优选为约0.8至
1.5mm。
185.70.根据实施方案69所述的方法，其中重构混合物被至少七个杆状物穿孔，其中杆状物布置成网格，并且其中杆状物的直径沿一个平面轴形成梯度(gradient)，特别是如图7c中所描绘，优选地由此沿梯度测量的fac大于沿具有相同杆状物厚度的杆状物测得的fac。
186.71.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中步骤(
ⅰ
)、(ii)和/或任选的(iv)在36.4-37.6℃的温度范围内进行，优选地，在36.6-37.4℃的温度范围内进行，优选地，在36.8-37.2℃的温度范围内进行，更优选地，在约37℃下进行。
187.72.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中步骤(
ⅰ
)、(ii)和/或任选的(iv)在存在2-10％的co2，优选2.5-8％的co2，更优选3-7％的co2，还更优选3.5-6.5％的co2，还更优选4-6％的co2，最优选约5％的co2的加湿细胞培养箱中进行。
188.73.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中步骤(
ⅰ
)、(ii)和/或任选的(iv)在存在5-40％ o2，优选10-30％ o2，更优选15-35％ o2，还更优选17-33％ o2，还更优选19-25％ o2，最优选约21％ o2的加湿细胞培养箱中进行。
189.74.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中步骤(
ⅰ
)中的胶凝的特征在于通过步骤(
ⅰ
)获得的重构混合物是凝胶状的。
190.75.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中步骤(
ⅰ
)中的胶凝的特征在于，如果将培养培养基添加到模具中，则培养培养基包围重构混合物并且不溶解重构混合物。
191.76.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中步骤(
ⅰ
)中的胶凝的特征在于重构混合物是不透明的，优选通过如tiburcy m，meyer t，soong pl，zimmermann wh的collagen-based engineered heart muscle.methods mol biol.2014；1181:167-76的图3b中所示出的目视检查测定。
192.77.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中步骤(
ⅰ
)进行至少15分钟，优选至多24小时，更优选为20分钟至15小时，更优选为30分钟至8小时，还更优选为45分钟至1.5小时，最优选为约1小时。
193.78.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中步骤(ii)中的培养培养基包含(a)基础培养基，(b)无血清补充剂，(c)l-谷氨酰胺，(d)抗坏血酸，(e)igf-1，(f)vegf和(g)tgfβ1。
194.79.根据实施方案78所述的方法，其中(a)基础培养基选自iscove培养基、αmem、dmem和rpmi，优选地，其中基础培养基为iscove培养基或αmem，更优选地，其中基础培养基为iscove培养基。
195.80.根据实施方案78或79所述的方法，其中(b)无血清补充剂由实施方案35-38中任一项中所限定。
196.81.根据实施方案78-80中任一项所述的方法，其中步骤(ii)中的培养培养基包含0.4-10mm l-谷氨酰胺，优选0.8-6mm l-谷氨酰胺，更优选1.2-5mm l-谷氨酰胺，更优选1.5-4mm l-谷氨酰胺，更优选1.7-3mm l-谷氨酰胺，最优选约2mm l-谷氨酰胺。
197.82.根据实施方案78-81中任一项所述的方法，其中步骤(ii)中的培养培养基包含30-3000μm抗坏血酸或其衍生物，优选100-1000μm抗坏血酸或其衍生物，更优选180-500μm抗坏血酸或其衍生物，更优选220-370μm抗坏血酸或其衍生物，更优选270-330μm抗坏血酸
或其衍生物，最优选约300μm抗坏血酸或其衍生物。
198.83.根据实施方案82所述的方法，其中抗坏血酸的衍生物为抗坏血酸-2-磷酸酯。
199.84.根据实施方案78-83中任一项所述的方法，其中步骤(ii)中的培养培养基包含10-1000ng/ml igf1，优选50-500ng/ml igf1，更优选70-200ng/ml igf1，还更优选90-120ng/ml igf1，最优选约100ng/ml igf1。
200.85.根据实施方案84所述的方法，其中igf1为人igf1。
201.86.根据实施方案78-85中任一项所述的方法，其中步骤(ii)中的培养培养基包含2.5-10ng/ml vegf，优选3-9ng/ml vegf，更优选3.5-8ng/ml vegf，更优选4-7ng/ml vegf，更优选4.5-6ng/ml vegf，最优选约5ng/ml vegf。
202.87.根据实施方案86所述的方法，其中vegf为人vegf，优选其中vegf为vegf
165
。
203.88.根据实施方案78-87中任一项所述的方法，其中步骤(ii)中的培养培养基包含5-20ng/ml fgf，优选6-18ng/ml fgf，更优选7-16ng/ml fgf，更优选8-14ng/ml，更优选9-12ng/ml fgf，最优选约10ng/ml fgf。
204.89.根据实施方案78-88中任一项所述的方法，其中fgf-2为人fgf-2。
205.90.根据实施方案78-89中任一项所述的方法，其中步骤(ii)中的培养培养基包含2-8ng/ml的tgfβ1，优选3-7ng/ml的tgfβ1，更优选4-6ng/ml的tgfβ1，还更优选4.5-5.5ng/ml的tgfβ1，还更优选约5ng/ml的tgfβ1，并且最优选其中tgfβ1为人tgfβ1。
206.91.根据实施方案78-90中任一项所述的方法，其中步骤(ii)中的培养培养基包含约750mg/l甘氨酸、约890mg/l l-丙氨酸、约1320mg/l l-天冬酰胺、约1330mg/l l-天冬氨酸、约1470mg/l l-谷氨酸、约1150mg/l l-脯氨酸和约1050mg/l l-丝氨酸。
207.92.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中如优选通过ehm体积的目视检查或视频光学分析来确定的，步骤(ii)中的重构混合物致密化减小了(compact)原始重构混合物体积的至少约20％，优选至少约25％，更优选至少约30％，更优选至少约40％，更优选至少约50％，更优选至少约60％，更优选至少约70％，更优选至少约80％，还更优选至少约90％。
208.93.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中步骤(ii)的完成是通过遵循步骤(
ⅰ
)和(ii)产生与mehm平行的环形形式的工程化心肌(ehm)，以及通过在步骤(ii)完成后确定环形形式的工程化心肌(ehm)与模具的脱离来确定的，如tiburcy m,meyer t,soong pl,zimmermann wh.collagen-based engineered heart muscle.methods mol biol.2014；1181:167-176的图3c中所述。
209.94.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中步骤(ii)进行至少12小时，优选最多15天，更优选12小时至7天，优选14小时至6天，更优选16小时至5.5天，更优选18小时至5天，更优选20小时至4.5天，还更优选22小时至4天，还更优选23小时至3.5天，最优选24小时至3天。
210.95.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中在步骤(iii)a)中，在步骤(ii)的致密化的重构混合物的顶部加入一种另外的重构混合物。
211.96.根据实施方案1-94中任一项所述的方法，其中在步骤(iii)a)中，将一种另外的重构混合物从底部加入到步骤(ii)的致密化的重构混合物中。
212.97.根据实施方案1-94中任一项所述的方法，其中在步骤(iii)a)中，将一种另外
的重构混合物同时从顶部和底部加入以涂覆(coat)步骤(ii)的致密化的重构混合物。
213.98.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中在步骤(iii)a)中，另外的重构混合物从顶部和/或底部涂覆步骤(ii)的致密化的重构混合物，优选地，其中步骤(ii)的致密化的重构混合物和步骤(iii)a)的另外的重构混合物的表面积相同。
214.99.根据实施方案1-97中任一项所述的方法，其中在步骤(iii)a)中，另外的重构混合物从顶部或底部涂覆步骤(ii)的致密化的重构混合物的限定区域，优选地，其中步骤(iii)a)的另外的重构混合物的表面积小于步骤(ii)的重构混合物的表面积。
215.100.根据实施方案1-97中任一项所述的方法，其中在步骤(iii)b)中，不同模具具有比步骤(
ⅰ
)的模具更大的浇注区域，优选地，其中在步骤(iii)b)中，另外的重构混合物至少从顶部或底部涂覆步骤(ii)的致密化的重构混合物，更优选地，其中在步骤(iii)b)中，另外的重构混合物从顶部或从底部涂覆步骤(ii)的致密化的重构混合物，并填充不同模具的较大的浇注区域，更优选地，其中步骤(iii)b)的另外的重构混合物的表面积大于步骤(ii)的致密化的重构混合物的表面积。
216.101.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中重复步骤(iii)a)或步骤(iii)b)至少2次，优选至少3次，更优选至少4次，更优选至少5次，更优选至少6次，更优选至少7次，更优选至少8次，还更优选至少9次，最优选至少10次。
217.102.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中重复步骤(iii)a)或步骤(iii)b)2-200次，优选2-100次，更优选2-80次，更优选2-70次，更优选2-60次，更优选2-50次，更优选2-40次，更优选3-30次，更优选3-25次，更优选4-20次，更优选4-15次，更优选4-10次，还更优选5-9次，最优选5-8次。
218.103.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中步骤(iv)中的成熟化培养基被限定为实施方案60-71和73中的任一项所述的培养培养基，不同之处在于与所述培养培养基相比，成熟化培养基中省去了tgfβ1。
219.104.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中步骤(iv)进行4-200天，优选6-150天，更优选8-120天，更优选9-110天，更优选10-90天，更优选15-70天，更优选20-50天，最优选28-42天。
220.105.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中在步骤(iv)中，步骤(iii)的mehm在合适的成熟化培养基中培养，由此当与步骤(iii)的mehm相比时，步骤(iv)的mehm表现出增强的发力(increased force development)，其中增强的发力通过使用在tiburcy等人，circulation135(19)1832-1847(2017)中描述的方法进行面积变化(fac)测量来确定，并且其中步骤(iv)的mehm的面积变化分数(fac)在电刺激时为至少0.5％，优选至少1％，更优选至少1.2％，更优选至少1％，更优选至少2％，更优选至少3％，还更优选至少5％。
221.106.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中mehm中的心肌细胞得到充分的氧气供应，优选其中氧气供应由如hesse ar，levent e，zieseniss a，tiburcy m，zimmermann wh，katschinski dm:lights on for hif-1α:genetically enhanced mouse cardiomyocytes for heart tissue imaging.cell physiol biochem 2014；34:455-462中所描述的odd-luc缺氧报告基因确定。
222.107.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中mehm中的心肌细胞得到充分的氧气供应，这是由如hesse ar等人(2014)中所述的odd-luc缺氧报告基因所确定的，优选
地，其中如果mehm的心肌细胞的平均相对发光是通过该方法的以下步骤(
ⅰ
)、(ii)和任选的(iv)获得的单层ehm的至多6倍，更优选至多5倍，更优选至多4倍，更优选至多3倍，更优选至多2.5倍，还更优选至多2倍，还更优选至多1.5倍，则确保足够的氧气供应。
223.108.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中mehm中的心肌细胞得到充分的氧气供应，这是由hesse ar等人(2014)中所述的odd-luc缺氧报告基因所确定的，并且其中mehm的心肌细胞的平均相对发光不大于在单层ehm的心肌细胞中测得的平均相对发光。
224.109.一种通过根据实施方案1-108中任一项所述的方法获得的多层工程化心肌(mehm)。
225.110.一种通过根据实施方案1-108中任一项所述的方法能够获得的多层工程化心肌(mehm)。
226.111.一种多层工程化心肌(mehm)，优选工程化心脏补片、工程化心脏袋或工程化心脏圆柱体，其中mehm包含(a)胶原和(b)心肌细胞和非肌细胞的细胞混合物，并且其中mehm包含至少2层。
227.112.根据实施方案111所述的mehm，其中mehm的厚度为至少0.2mm。
228.113.根据实施方案111或112所述的mehm，其中，mehm是通过重复且依次进行的成层方法生成的，其中mehm来源于2-200层，其中这些层已经相互合并，从而增加了mehm厚度。
229.114.根据实施方案111-113中任一项所述的mehm，其中每层均源自重构混合物其中每种重构混合物均包含(a)胶原，(b)心肌细胞和非肌细胞的细胞混合物和(c)合适的重构介质，并且其中mehm能够收缩，如通过使用tiburcy等人，circulation135(19)1832-1847(2017)中描述的方法测定mehm的面积变化分数(fac)所测量的。
230.115.根据实施方案111-114中任一项所述的mehm，其中mehm源自2-100层，优选2-80层，更优选2-70层，更优选2-60层，更优选2-50层，更优选2-40层，更优选3-30层，更优选3-25层，还更优选4-20层。
231.116.根据实施方案111-115中任一项所述的mehm，其中fac在电刺激时为至少0.5％，优选其中fac为至少0.7％，更优选至少1％，更优选至少2％，更优选至少3％，还更优选至少5％。
232.117.根据实施方案111-116中任一项所述的mehm，其中mehm的厚度为0.2mm至约30mm，优选约0.3mm至约30mm，更优选约0.5mm至约30mm，更优选约0.7mm至约25mm，更优选约0.9mm至约20mm，更优选约1mm至约17mm，更优选约2.3mm至约15mm，更优选约2.8mm至约14mm，更优选约3.3mm至约13mm，更优选约3.8mm至约12mm，更优选约4.2mm至约11mm，更优选约4.6mm至约10.5mm，最优选约5mm至约10mm。
233.118.根据实施方案111-117中任一项所述的mehm，其中mehm没有血管化(vascularized)和/或mehm不受中枢神经系统的控制。
234.119.根据实施方案111-118中任一项所述的mehm，其中mehm被贯穿mehm的具有相似扩散距离的至少2个杆状物穿孔，以确保细胞混合物的营养和氧气供应。
235.120.根据实施方案111-119中任一项所述的mehm，其中mehm中的心肌细胞得到充
分的氧气供应，优选地，其中氧气供应由如hesse ar，levent e，zieseniss a，tiburcy m，zimmermann wh，katschinski dm:lights on for hif-1α:genetically enhanced mouse cardiomyocytes for heart tissue imaging.cell physiol biochem 2014；34:455-462中所述的odd-luc缺氧报告基因确定。
236.121.根据实施方案111-120中任一项所述的mehm，其中mehm中的心肌细胞得到充分的氧气供应，这是由如在hesse ar等人(2014)中所述的odd-luc缺氧报告基因所确定的，优选地，其中如果mehm的心肌细胞的平均相对发光是遵循本方法的以下步骤(
ⅰ
)、(ii)和任选的(iv)获得的单层ehm中的平均相对发光的至多6倍，更优选至多5倍，更优选至多4倍，更优选至多3倍，更优选至多2.5倍，还更优选至多2倍，还更优选至多1.5倍，则确保足够的氧供应。
237.122.根据实施方案111-121中任一项所述的mehm，其中mehm中的心肌细胞得到充分的氧气供应，这是由hesse ar等人(2014)中所述的odd-luc缺氧报告基因确定的，并且其中mehm的心肌细胞的平均相对发光不大于在单层ehm的心肌细胞中测得的平均相对发光。
238.123.根据实施方案111-122中任一项所述的mehm，其中，mehm是通过根据实施方案1-95中任一项所述的方法获得的。
239.124.一种通过进行根据实施方案1-102中任一项所述的方法的步骤(
ⅰ
)-(iii)获得的多层工程化心肌(mehm)。
240.125.一种工程化心肌(ehm)，优选为工程化心脏补片、工程化心脏袋或工程化心脏圆柱体，其中ehm包括(a)胶原，(b)心肌细胞和非肌细胞的细胞混合物，并且其中ehm的厚度为至少约0.6mm，优选其中ehm的厚度为至少约0.61mm、为至少0.62mm、为至少0.63mm、为至少0.64mm、为至少0.65mm，为至少0.66mm、为至少0.67mm、为至少0.68mm、为至少0.69mm、为至少0.7mm、为至少0.8mm或为至少0.9mm。
241.126.根据实施方案125所述的ehm，其中ehm为多层ehm并且包括至少2层。
242.127.通过根据实施方案1-108中任一项所述的方法获得的mehm或根据实施方案109-126中任一项所述的mehm在用于药物筛选的体外模型中的用途。
243.128.实施方案127在用于药物毒性筛选或药物功效筛选的体外模型中的用途。
244.129.通过根据实施方案1-108中任一项所述的方法获得的mehm或根据实施方案109-126中任一项的mehm在工程化人心肌的体外制造中的用途，优选地，其中所述mehm具有三维形状以匹配患者特异性心肌缺损，更优选地，其中所述患者特异性心肌缺损通过mri、超声、计算机断层扫描、正电子发射断层扫描和/或光学相干断层扫描来评估。
245.130.通过根据实施方案1-108中任一项所述的方法获得的mehm或根据实施方案109-126中任一项所述的mehm用作研究工具的用途。
246.131.通过根据实施方案1-108中任一项所述的方法或根据实施方案109-126中任一项所述的mehm获得的多层ehm(mehm)用于药物的用途。
247.132.通过根据实施方案1-108中任一项所述的方法获得的多层ehm(mehm)或根据实施方案109-126中任一项所述的mehm用于心脏修复，优选用于治疗患有心力衰竭的患者的用途。
248.133.根据实施方案132所述的mehm，其中，mehm被永久地应用于患者的心脏，优选地，其中，mehm被缝合到患者的心脏上。
249.134.一种治疗患有心力衰竭的个体的方法，该方法包括向患者的心脏施用通过根据实施方案1-108中任一项所述的方法而获得的或如实施方案109-126中任一项所限定的mehm。
250.135.根据实施方案134所述的方法，其中该方法包括将mehm附着在个体的心脏上，并且其中附着优选地包括将mehm缝合到心脏上。
251.当然，本文公开的所有实施方案可以单独应用或与其他实施方案结合应用。此外，本文公开的所有实施方案均适用于制造mehm的方法以及适用于mehm和mehm的体外和体内用途。
附图说明
252.图1：重复成层以获得本文公开的多层工程化心肌(mehm)的概述。通常，新添加的层(重构混合物)会与前一层(致密化的重构混合物)合并。通过重复成层，获得了厚而有力的工程化心肌。通过在致密化的重构混合物上添加新的重构混合物，获得“顶部成层”。通过将第一层和连续形成的合并层堆叠物浸泡在新添加的重构混合物中，获得“洋葱模式(onion pattern)”。通过将新的重构混合物从底部加入到致密化的重构混合物中获得“从底部成层”。考虑到嵌入细胞的氧气和营养扩散的要求，这种成层可以无限地重复。氧气和营养的供应是通过浸泡在包括营养物(特别是葡萄糖、乳酸盐和/或脂肪酸)的含氧培养培养基(oxygenated culturing medium)中并通过设计增加组织表面积来实现的，即通过经由穿孔杆状物创造通道(未在示意图中示出；参见图2和图3)。初始的第一层用虚线表示；后续层用黑色表示。
253.图2：工程化心肌的可扩展性。照片描绘了本发明人用于疾病建模、药物筛选和心脏修复的典型工程化心肌形式(typical engineered heart muscle formats)。标示体积代表各自的工程化心肌重构混合物的初始体积。在为了产生如本文所公开的mehm的成层方法中，每种重构混合物都可以具有这些示例性体积。通过将柔性杆状物集成到相应的组织制品(respective tissue formulations)中实现机械负载。可以根据需要进一步调整几何形状和比例。完成一层ehm的自组织过程(self-organization process)后，在展示的制品中，ehm厚度(z-维度)通常为0.5
±
0.1mm。通过重复成层，如本文所公开的，mehm得到增厚和强化。比例尺：1cm。
254.图3：通过连续/重复成层以及充足的氧气和营养供应来增加ehm的厚度。a：定制设计的带有拉伸装置(stretch device)(由固定在实心基板上的具有规定间距的3d印刷柔性杆状物组成)的浇注模具，使得能够实现穿孔的ehm设计，并有助于发展中的ehm或mehm克服规定阻力产生增张力性收缩。b：分层穿孔的补片设计示意图。c：5层的(左)和单层的(右)ehm的俯视图和侧视图；5层的ehm的厚度为约5-6mm，单层的ehm的厚度为约1mm。d：通过使用人odd-luc缺氧报告基因ipsc系来构建5层构建体(construct)中的中间层(5层的和单层的ehm二者均含有相同量的odd-luc心肌细胞，hesse等人2014年的odd-lux缺氧方法)，没有证据表明在大幅增厚的5层设计中，缺氧增强。右侧的灰度代码(gray shade code)表示低和高的odd-luc活性，是缺氧感应的标志。灰度等级(grey scale)描绘了报告基因细胞系(reporter cell line)的发光情况。与单补片(single patch)中的背景odd-luc信号(右)相比，5层ehm中的odd-luc信号(左)强度较低。换句话说，与多层ehm相比，在单层ehm中的发
光信号的强度，如果不是在单层ehm中更亮的话，似乎至少是相同的。因此，5层ehm不会受到缺氧的影响。
255.图4：呈环形形式的自动浇注的多孔板形式(multi-well plate format)。a：定制拉伸器(stretcher)(固定在基板上的柔性杆状物)，以支持环形形式的工程化心肌的增张力性收缩(auxotonic contractions)，示出了杆状物尺寸和布置的典型尺寸。b：多孔板形式，用于48个环形形式的工程化心肌的自动浇注、平行培养和视频-光学分析，其中单孔特写(close-up view)示出了用于浇注的空腔和在限定的机械负荷下用于成熟化(maturation)的柔性杆状物(更多细节请参考tiburcy等人，2020)。
256.图5：呈环形形式的ehm形成。a：在多孔板中自动浇注ehm。b：浇注后1小时，ehm转变为非液体状态(胶原胶凝化导致ehm重构混合物外观不透明)c：浇注后24小时，ehm明显致密化并悬浮(suspension)在用于施加机械负荷(for mechanical loading)的柔性杆状物上。d：在培养第18天完成致密化后的ehm，ehm完全悬浮在用以施加双向机械负荷并在预负荷条件下支持增张力性收缩的柔性杆状物上。比例尺：5mm。
257.图6：a：有刺激或无刺激时ehm收缩的视频光学分析。a：定制的视频-光学分析工具的屏幕截图，用于通过面积变化分数(fac)测量进行ehm功能性表型分析。b：用于对ehm进行电刺激以诱发以限定的频率(at a defined rate)收缩的装置。增加电场刺激(至通常为2v/cm)，直到诱导ehm以限定的搏动频率(beating rate)收缩。(c)备选地，可以应用用接触电极的ehm进行局部点刺激以诱发ehm同步收缩，以进行fac分析。
258.图7：呈补片形式的多层ehm浇注模具具。a：定制设计的浇注模具，带有两个凹槽，用于固定带有杆状物的底板(底部)和培养基(顶部)。在带有柔性杆状物的左侧凹槽中，为了阐述说明，描绘了致密化的重构混合物。多个层(layers)堆叠在上面(stacked on top)，插入在第一层下面或围绕第一层制定(formulated)。b：浇注模具中的凹槽的横截面，带有竖直穿孔杆状物(灰色和白色)，其中成层的ehm以黑色表示。c：有杆状物厚度梯度和没有杆状物厚度梯度的杆状物设计实例；注意，通过将杆状物(弹性特性、直径或杆状物的几何形状)设计为均匀的(没有梯度，本实例中所有杆状物的直径都是0.9mm)和不均匀的(从顶部到底部有梯度的实例，杆状物从顶部到底部具有1.1mm到0.7mm的直径，步长(step)为0.1mm)，可以控制施加在ehm上的机械负荷。d：ehm的实例，它发展了各向同性(无梯度；其中杆状物的直径相同)或各向异性(竖直梯度；其中杆状物在直径上具有梯度)的收缩模式。通过比较ehm的上部和下部的fac分析了收缩模式。当所有杆状物具有相同的直径时，ehm的上部和下部示出约1％ fac的类似收缩。相比之下，竖直梯度导致上部收缩力增加至约1.2％ fac(杆状物直径较大)，并导致下部收缩力减少至约0.7％ fac(杆状物直径较小)。
259.图8：呈不同几何形状的多层工程化心肌(mehm)。多层工程化心肌(mehm)设计的实例。mehm可以制成带有不同厚度和x-y-尺寸的袋形式(a)、圆柱形式(b)和补片形式(c)(以c中的补片形式为例)。在mehm袋的几何形状(a)中，mehm被浇注在带有中心元件(坚硬的(solid)或柔性的、用于使ehm致密化的生物力学负载(biomechanical loading)；与zimmermann wh，yildirim y，eschenhagen t:pouch-like engineered heart muscle tissue，wo2008058917和yildirim等人(2007)circulation中所述的相似)的圆形或球形模具中。在所示实例中，杆状物间距离为3.5mm，杆状物直径为1.5mm，类似于针对ehm补片描述的优选实施方案(图7)。可以根据需要调整杆状物的尺寸、几何形状和杆状物间距离，以便
为氧气和营养供应创造最佳的负载和穿孔。在圆柱体几何形状(b)的情况下，杆状物可以制造成指向内部或外部，并且优选整体在圆柱体中具有指向外部的杆状物。成层可以由受控旋转引起的离心力(》2g；“旋涂”)支撑(supported)。(c)通过将穿孔的补片组件(包括穿孔杆状物元件)定位到新模具中以适应额外的成层(c1)或通过使用嵌件(insert)在更大的浇注模具设计中隔离限定的浇注体积(c2)，表明了不均匀的(“补片中的补片”)多层策略(heterogeneous(“patch-in-patch”)multilayer strategies)。这使得可以自由设计不同厚度和xy尺寸的mehm，以便于制造与患者心脏匹配/个体化的补片。实施例
260.以下实施例旨在进一步说明本发明，但不限于此。这些实施例描述了许多技术特征，本发明还涉及本节中介绍的技术特征的组合。
261.实施例1-环形形式和补片形式的工程化心肌(ehm)的规模化生产
262.如本发明人先前在tiburcy等人(2017)和tiburcy等人(2020)中所述，工程化人心肌可以以环形形式以及作为补片生产。特别是在体内用于心脏修复时，工程化心脏补片至关重要。图2提供了以前已经生产和公布的不同尺寸和形式(formats)的概述(tiburcy等人(2017)和tiburcy等人(2020))。
263.实施例2-通过由穿孔杆状物支撑的依次且重复成层来增加ehm厚度，以确保机械负荷以及氧气和营养的充分供应
264.为了生产用于治疗心力衰竭患者的心肌，工程化心肌理想地需要支持人类心脏搏动的力量。待治疗的心壁在患者体内通常为5-10mm厚，即植入物理想地达到该厚度，并且在几何学上适于满足患者对性能不佳的心壁的机械支撑的特定需求。
265.为了产生加厚的(和加强的)多层ehm，本发明人开发了连续和重复的成层方法。具体而言，图1示出了三种不同的重复且依次进行成层的方式，以获得加厚的工程化心脏补片(注意，为简化起见，不包括穿孔杆状物)。作为一般原则，第一种重构混合物在致密化成限定的层(defined layer)后，用额外的重构混合物进行涂覆。如图1中示意性地示出的，涂层可以从顶部、底部或两侧进行。重复该过程，直到达到所需的组织厚度。通过设计浇注模具，可以创造任何形状和所需的x-y尺寸(个性化的补片设计)。涂层/成层工艺的先决条件是第一层和随后产生的层形成致密的组织(compact tissue)。由于各个重构混合物相互融合在一起(merge to each other)，因此这种致密组织的形成通过重复且依次进行的成层实现。组织致密化(tissue compaction)取决于基质细胞类型和含量(tiburcy等人(2017)，schlick等人(2019))。选择基质细胞类型和含量，以达到≥20％的原始重构混合物的致密化缩小(图5b-c示例性地展示了呈环形形式的ehm的致密化)。这提供了结构和物理空间，以从顶部和/或底部给致密化的(compacting)ehm涂覆一个另外的层(a further layer)或两个表面涂层(a both surface coating layers)。本发明人通常在前一层浇注24小时后添加新的层。这些时间可以根据需要和通过实验确定进行缩短或延长，因为所需的组织致密化过程取决于基质细胞类型和密度、一般的细胞组成以及水凝胶和培养基组成(例如，添加有效的tgfb1浓度可以加速该过程，如在tiburcy等人(2017)和wo2017/207431中开发用于ehm的形成)。可以将另外的重构混合物添加到模具中，以涂覆致密化的多层工程化心肌。通过进行此方法，ehm会逐层增厚，因此多层ehm可达到临床所需的5mm至10mm的厚度甚至更厚。由于人类细胞的壁(human cell wall)的厚度在5mm至10mm之间，因此认为这种增厚的
心脏补片也能够维持足够的机械稳定性以支持心壁功能。此外，预期嵌入了ehm的心肌细胞的收缩性支持天然心脏的收缩。
266.图3a描绘了带有拉伸装置(包括具有固定到坚硬的可移除基板上的限定间距的3d打印的柔性杆状物)的浇注模具，以实现穿孔ehm设计并促进发展中的补片抵抗限定阻力的增张力性收缩。当然，浇注模具的尺寸以及杆状物的数量和杆状物的尺寸也可以调整。图3b示出了如本文所公开的多层ehm的示意性概述。在图3c中，生成的5层ehm和单层ehm彼此相邻示出。在图3c的下部，对ehm的厚度进行了具体比较，表明5层ehm的厚度为约5-6mm。通过使用引入的穿孔成层设计，由于穿孔杆状物产生的通道，在恒定扩散距离的情况下，整体组织厚度没有限制。当然，杆状物的距离和尺寸可以调整，以增加通道数量，并改变通道尺寸和通道间距离。
267.试图获得这样厚的多层工程化心肌(mehm)的一个关键挑战是确保嵌入工程化心肌中的细胞的氧气和营养的供应。通过穿孔的ehm设计，本发明人在任何给定的多层设计中确保了足够的氧气和营养供应。这是通过本发明人使用人odd-luc缺氧报告基因模型(由本发明人基于先前在小鼠模型中的经验开发；hesse等人(2014))的研究例证的。源自odd-luc人多能干细胞系的呈单层和5层(5-6mm厚)的心肌细胞未表现出高于背景(在单层ehm中报告的)的odd-luc信号强度上的差异。在展示的ehm设计中，通道直径和密度由杆状物直径(1.5mm)和杆状物圆周到圆周的距离(3.5mm)限定。在这些条件下(ehm中的有效最大表面距离≤1.75mm)，未观察到缺氧。穿孔的补片形式与人类心脏中的血管密度(2.000-5.000个毛细血管/mm2，毛细血管间距离《25μm)形成鲜明对比。因此，这是令人惊讶并且也与以下理论假设相反：即在》100μm的距离上通过扩散来供应氧气将导致心肌细胞对缺氧条件的感知(radisic等人，2005)。这种不一致可以通过多能干细胞来源的心肌细胞在含有营养物(葡萄糖、乳酸盐和/或脂肪酸)的培养基存在下的高耐缺氧性(high hypoxia resistance)来解释。
268.通过进行重复且依次进行的成层以及特别是穿孔补片设计，确保了ehm内的细胞不遭受缺氧，并获得足够的营养。产生例如10mm的加厚的ehm的另一理论选择是在一个浇注步骤中直接浇注大体积的重构混合物。为了获得厚度为10mm的ehm，单一重构混合物的厚度需要达到约100mm。根据组织致密化的阶段和程度，需要在1至10cm的距离上向所述混合物中的细胞提供氧气和营养。由于ehm未被血管化，嵌入在厘米级的ehm中的细胞将遭受缺氧诱导的细胞凋亡和坏死。为了克服这一障碍，本发明人已经开发了一种方法，以在配备有穿孔杆状物的浇注模具中进行重复且依次进行的成层(图3和图7)，如本文所公开的。这种方法优于其他方法，因为其他方法不能确保充足的氧气和营养供应。
269.此外，穿透杆状物安装机械支撑元件来支撑增张力性收缩也是至关重要的。
270.实施例2的材料和方法
271.5层ehm的生成：使用tiburcy等人(2017)和wo2015025030中描述的重构混合物，在定制的浇注模具中构建ehm(图7)。浇注重构混合物(8ml；参见图2)后，在3天内观察到ehm致密化至小于原始重构体积的50％。去除培养培养基后，用移液管将第二层(由6ml重构混合物组成—体积可根据模具设计/表面积和用途进行调整，并可根据ehm致密化情况进行调整)移至浇注模具中，以从顶部和底部覆盖致密化的ehm。例如，也可添加8ml或更小的体积(如2ml)以覆盖限定区域(进一步说明参见实施例5)。大约1小时后，新移入的重构混合物的
凝胶化完成，并向模具中加入培养培养基。重复该过程，直到获得5层。用于重复成层的重构混合物体积和时机取决于浇注模具尺寸和基质细胞介导的ehm的致密化(compaction)。
272.缺氧报告系的产生。克隆pigybac-odd-luc质粒，该质粒含有在鸡肌动蛋白启动子(chicken actin promotor，cag)控制下与hif1α的氧依赖性降解结构域(oxygen-dependent degradation domain，odd)融合的萤火虫荧光素酶。在常氧条件下，odd结构域被泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system)快速降解。在缺氧情况下，odd结构域稳定化，导致可测量的发光(hesse等人(2014))。将tc1133 ipsc与piggybac-oddluc构建体以及转座酶载体一起进行电穿孔。电穿孔后48小时，用浓度递增(250-500-750ug/ml)的新霉素选择细胞7天，然后手动挑选和扩增菌落。
273.缺氧报告系的验证。在鸡肌动蛋白启动子(cag)的控制下，将表达与hif1α的氧依赖性降解结构域(odd)融合的萤火虫荧光素酶的多能干细胞在暴露于缺氧条件(5％或1％ o2)后，在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂(均购自罗氏公司)的1
×
被动裂解缓冲液(dual-reporter assay systems，promega公司)中进行裂解。将含细胞或无细胞(仅裂解缓冲液)的裂解物与荧光素酶检测试剂ii(dual-reporter assay systems，promega公司)混合，并使用flexstation 3多模式微孔板读取器(分子设备)测量发光情况(luminescence)。平均值
±
sem；n＝3：
274.来自稳定遗传整合的odd-luc报告基因响应于较低的氧浓度的发光信号的增加，证明了odd-luc模型在人类多能干细胞模型的缺氧感知中的效用。
275.缺氧报告基因ehm的生物发光成像。将odd-luc ehm浸没在含1mg/ml xenolight d-荧光素(xenolight d-luciferin)(珀金埃尔默公司)的磷酸盐缓冲液中。使用ivis lumina iii系统(珀金埃尔默公司)在37℃下对ehm的发光进行成像。发光在图3d中以灰度表示。5层的ehm比单层的ehm显示出更少的发光。
276.实施例3-在多孔板中生成呈环形形式的ehm，说明工程化人心肌的凝结(condensation)过程
277.图5提供了重构混合物的凝结(胶凝1小时后)和致密化(24小时和18天后)以形成环形形式的产生力的ehm的原理验证概述。例如，可以在定制的拉伸器(固定在基板上的柔性杆状物)上生成环形形式的ehm，以支持工程化人心肌的增张力性收缩(图4a)。如先前在tiburcy等人(2020)中所述，通过使用限定的多孔板，可以并行生产48个呈环形形式的ehm(图4b)。在wo 2017/207431中也进一步描述了多孔板。多孔板的特征在于，每个模具均为环形通道的形式。每个ehm都被浇注到一个环形通道中。在重构混合物的凝结和致密化过程中，工程化人心肌从环形通道脱离，向上移动并紧密包裹在两个杆状物周围。
278.在第一步中，如先前在tiburcy等人2017或tiburcy等人2020中所述，在多孔板的模具中提供重构混合物。当将重构混合物浇注到模具中时，重构混合物是一种粘稠的液体半透明溶液。在含有5％ co2的加湿培养箱中于37℃下培养1小时后，由于重构混合物主要通过不依赖于细胞的胶原水凝胶的胶凝作用而固结，工程化人心肌变得不透明(也参见
tiburcy等人(2014)，schlick等人(2019))。固结(持续例如1小时，图5b)后，向模具中加入培养培养基，培养培养基提供营养和生长因子(参见例如tiburcy等人(2017)和tiburcy等人(2020)的示例性培养基组成)。培养例如24小时后，环(loop)从模具上脱离，使得可以看到重构混合物和模具之间的空间。此外，24小时后，重构混合物从环形通道上脱离，并紧密包裹在两个杆状物周围(图5c)。围绕柔性杆状物的ehm形成过程取决于基质细胞成分，并且可以通过添加有效浓度的tgfb1进一步促进该过程。工程化人心肌位于柔性杆状物上后，使用不含tgfb1的工程化人心肌维持培养基。在接下来的17天内，混合物进一步在两个杆状物周围凝结，如图5d所示，并形成致密且收缩的(compact and contracting)工程化人心肌。杆状物被开发为响应于ehm收缩而弯曲，并且在ehm舒张期(relaxation phase)期间将ehm拉伸至限定的静息长度(resting length)，以模拟心脏的自然增张力性收缩周期。
279.实施例4-工程化心肌的兴奋性(ehm)
280.心肌细胞的兴奋通常会导致这些细胞的收缩。为了测量ehm内的收缩，tiburcy等人(2017)描述了收缩时补片的面积变化分数(fac)。fac是一种视频-光学量度(video-optical measurement)，其中在非收缩和收缩状态下比较补片的表面积。通过使用所述视频分析工具，可以对ehm进行表型分析和比较。图6a描绘了定制的视频光学分析工具，以便于测量。图6b示出了用于对ehm进行电刺激以诱导其在限定的频率下进行收缩的装置。增加电场刺激强度(至通常为2v/cm2)，直到诱导ehm以限定的搏动频率(通常控制在0.1-3hz)收缩。备选地，可以采用用接触ehm的电极进行局部点刺激，以诱导ehm以所需的搏动频率同步收缩，进行fac分析(图6c)。
281.通过比较最大收缩期(最大收缩状态)和最大舒张期(最大舒张状态)的视频光学成像时的ehm表面积来测量fac(面积变化分数)。表面积的变化被记录为时间的函数。
282.实施例5—多层工程化心肌设计的各种几何形状
283.通常，mehm可以以各种三维形状生成。一般原则是，在模具中配备具有均一或非均一的形状和尺寸的穿孔杆状物，以便(
ⅰ
)对正在形成的ehm施加机械阻力，和(ii)创造用于营养和氧气供应的穿孔通道。在ehm袋的几何形状中(如图8a所示)，ehm被浇注在带有中心元件(坚硬的或柔性的，用于施加使ehm致密化的生物力学负载；与zimmermann wh，yildirim y，eschenhagen t:pouch-like engineered heart muscle tissue，wo2008058917和yildirim等人(2007)circulation中所述相似)的圆形或球形模具中。与wo2008058917不同的是，为了可靠地生成出例如》1mm厚度的具有可控的肌肉形成的袋，在中心元件的顶部设计穿孔杆状物。在图8a所示的示例中，杆状物间距离为3.5mm，杆状物直径为1.5mm，类似于针对ehm补片描述的优选实施方案(图7)。杆状物的尺寸、几何形状和杆状物间距离可以根据需要进行调整，以产生用于氧气和营养供应的最佳负载和穿孔。
284.在另外的实例中，mehm也可以为圆柱体的形式。在圆柱体几何形状的情况下(图8b)，可以将杆状物制造为指向内或指向外，以便对重构混合物进行穿孔。圆柱体ehm的一个关键优势在于，许多ehm可以并行生产，占用的空间相对较小。圆柱体mehm生产完成后，可以将mehm的一侧切开以获得补片，或保持完整以获得所需尺寸的mehm圆柱体/管。可以通过自由调整带有向内或向外延伸/辐射的杆状物的内和/或外模具圆柱体的周长来调整mehm尺寸。带有穿孔杆状物的圆柱体形式的模具例如通过原型的3d打印来生产，以适应容器。然后，所述容器提供用于圆柱体ehm生产的外壁(例如50ml聚丙烯或玻璃管)。容器中装入足够
的重构混合物，以覆盖圆柱体的内侧或外侧。通过受控旋转引起的离心力(》2g；“旋涂”)可以支撑成层。在圆柱体、纵向旋转的生物反应器中产生管状/圆柱体状ehm应在》2g下进行。插入式管状拉伸器包含径向突出的杆状物，用于对ehm进行打孔。ehm经历的离心力可以通过调整转速来控制，以模拟成熟化过程中舒张压的增加。此外，离心确保了重构混合物的均匀分散，以确保ehm厚度相等。在向外辐射的圆筒设计中，均匀涂层可以通过使用整体式内模圆筒来进一步改善，以便在旋涂过程中使重构混合物均匀分布。涂覆、胶凝后，可以加入培养培养基，以促进致密化。可以重复多层化，直到达到所需的层组成。可以将多个层(layers)添加到先前的重构混合物的顶部和/或底部。
285.图8c展示了mehm设计的另外的实例。图8c示出了不均匀的(“补片中的补片”)多层策略，以根据个性化mehm生产(例如用于心脏修复的临床用途)的需要来创造具有可变的厚度的mehm：首先，通过将穿孔的补片组件定位到新模具中以适应额外的成层(c1)，其次，通过使用嵌件在更大的浇注模具设计中隔离出限定的浇注体积(c2)。这使得ehm可以自由设计(i)可变的厚度和(ii)xy尺寸，以便于制造与患者心脏匹配的/个性化的补片。所述元件可以通过如tiburcy等人(2017)所述的原型3d打印、铸塑或其他合适的工程方法制备。模具通常由聚四氟乙烯、pdms或琼脂糖通过铣削或铸塑创造，而穿孔杆状物组件通常使用3d打印进行打印，例如使用connex350(stratasys公司)3d打印机打印，或通过铸塑。对于3d打印，可以使用生物相容的med610聚合物作为刚性组件(例如，穿孔补片设计中的基板或袋设计中的外模具元件)，并结合tangoblack聚合物作为柔性元件，例如杆状物和圆柱体。表格表1：无血清补充剂“去除胰岛素的b27”(50
×
浓度，液体)的组成每500ml培养基中20ml
‘
去除胰岛素的b27’，相当于4％的去除胰岛素的b27(v/v)；
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技术特征：
1.一种制造多层工程化心肌(mehm)的方法，所述方法包括以下步骤：(
ⅰ
)在模具中提供液体重构混合物，其中所述重构混合物被至少两个杆状物穿孔，其中所述重构混合物包含(a)胶原，(b)心肌细胞和非肌细胞的细胞混合物和(c)合适的重构介质，由此所述重构混合物在所述模具中发生胶凝，(
ⅱ
)将通过步骤(
ⅰ
)获得的在所述模具中的所述混合物在合适的培养培养基中进行培养，由此所述重构混合物在所述模具中致密化；(
ⅲ
)a)将另外的如步骤(
ⅰ
)中所限定的液体重构混合物从顶部和/或从底部加入到由步骤(
ⅱ
)获得的所述致密化的重构混合物中，由此所述另外的液体重构混合物发生胶凝，随后在与步骤(
ⅱ
)中相同的条件下进行培养，由此所述另外的重构混合物在所述模具中致密化；或b)将由步骤(
ⅱ
)获得的所述致密化的重构混合物转移到不同的模具中，其中所述重构混合物被至少两个杆状物穿孔，随后在所述不同的模具中进行步骤(
ⅲ
)a)；从而获得多层工程化心肌(mehm)，优选地，其中所述mehm通过重复步骤(iii)a)和/或步骤(iii)b)至少一次而加厚，和(iv)任选地，将在所述模具中的步骤(
ⅲ
)的mehm在合适的成熟化培养基中进行培养，其中所述mehm能够收缩。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述mehm收缩的能力是通过目视检查和/或通过确定步骤(
ⅰ
)的所述重构混合物通过进行步骤(
ⅰ
)、(
ⅱ
)和任选的(
ⅳ
)来形成产生力的工程化心肌的能力来评估的，并且其中所述工程化心肌能够产生为至少0.05mn收缩力(foc)的收缩力，如在tiburcy等人的circulation 135(19)1832-1847(2017)的附加图6c中的标准等距条件下测得的。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述收缩是通过使用在tiburcy等人的circulation 135(19)1832-1847(2017)中描述的方法的mehm的面积变化分数(fac)测量来确定的，并且其中所述面积变化分数(fac)在电刺激时为至少0.5％，优选地，其中所述fac为至少0.7％，更优选至少1％，更优选至少2％，更优选至少3％，还更优选至少5％。4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述非肌细胞选自以下一种或多种：基质细胞、内皮细胞、平滑肌细胞和间充质干细胞，优选地，其中所述非肌细胞为基质细胞或内皮细胞，更优选地，其中所述非肌细胞为基质细胞，还更优选地，其中所述基质细胞为心脏基质细胞，还更优选地，其中所述心脏基质细胞具有成纤维细胞特性，还更优选地，其中所述心脏基质细胞为成纤维细胞。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述mehm为补片、袋或圆柱体的形式。6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(
ⅰ
)中所述的胶凝的特征在于所述重构混合物是不透明的，优选如tiburcy m等人的collagen-based engineered heart muscle,methods mol biol.2014；1181:167-76的图3b中所示出的，通过目视检查确定。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述步骤(
ⅱ
)的完成通过以下步骤确定：(a)通过进行步骤(
ⅰ
)和(
ⅱ
)产生与所述mehm平行的环形形式的工程化心肌(ehm)，以及(b)确定所述呈环形形式的工程化心肌(ehm)从所述模具中脱离，如在tiburcy m等人的collagen-based engineered heart muscle,methods mol biol.2014；1181:167-176的图3c中所述。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中重复步骤(
ⅲ
)a)或步骤(
ⅲ
)b)2-200次，优选2-100次，更优选2-80次，更优选2-70次，更优选2-60次，更优选2-50次，更优选2-40次，更优选3-30次，更优选3-25次，更优选4-20次，更优选4-15次，更优选4-10次，还更优选5-9次，最优选5-8次。9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述mehm中的心肌细胞被充分地供应氧气，优选地，其中所述氧气供应由如hesse ar等人，lights on for hif-1α,genetically enhanced mouse cardiomyocytes for heart tissue imaging,cell physiol biochem,2014；34:455-462中所述的odd-luc缺氧报告基因确定，优选地，其中如果所述mehm的心肌细胞的平均相对发光是通过所述方法的以下步骤(
ⅰ
)、(
ⅱ
)和任选的(
ⅳ
)获得的单层ehm的平均相对发光的至多6倍，更优选至多5倍，更优选至多4倍，更优选至多3倍，更优选至多2.5倍，还更优选至多2倍，还更优选至多1.5倍，则确保足够的氧气供应。10.一种通过根据权利要求1-9中任一项所述的方法获得的多层工程化心肌(mehm)。11.一种多层工程化心肌(mehm)，优选为工程化心脏补片、工程化心脏袋或工程化心脏圆柱体，其中所述mehm包含(a)胶原和(b)心肌细胞和非肌细胞的细胞混合物，并且其中所述mehm包含至少2层。12.根据权利要求11所述的mehm，其中所述mehm是通过重复且依次进行的成层方法产生的，其中所述mehm源自2-200层，并且其中所述这些层已经相互合并，从而增加了mehm厚度。13.根据权利要求11或12所述的mehm，其中所述mehm中的心肌细胞被充分地供应氧气，其是通过如hesse ar等人(2014)中所述的odd-luc缺氧报告基因来确定的，优选地，其中如果所述mehm的心肌细胞的平均相对发光是通过所述方法的以下步骤(
ⅰ
)、(
ⅱ
)和任选的(
ⅳ
)获得的单层ehm的平均相对发光的至多6倍，更优选至多5倍，更优选至多4倍，更优选至多3倍，更优选至多2.5倍，还更优选至多2倍，还更优选至多1.5倍，则确保足够的氧气供应。14.通过根据权利要求1-9中任一项所述的方法获得的mehm或根据权利要求10-13中任一项所述的mehm在体外制造工程化人心肌中的用途，优选地，其中所述mehm具有与患者特异性心肌缺损匹配的三维形状，更优选地，其中所述患者特异性缺损通过mri、超声、计算机断层摄影、正电子发射断层摄影和/或光学相干断层摄影来评估。15.通过根据权利要求1-9中任一项所述的方法获得的多层ehm(mehm)或根据权利要求10-13中任一项所述的mehm用于心脏修复，优选地用于治疗患有心力衰竭的患者的用途。

技术总结
本申请描述了用于制造多层工程化心肌的方法。具体地，该方法涉及(


技术研发人员：W
受保护的技术使用者：乔治-奥古斯特-哥廷根大学公法大学医学基金会
技术研发日：2021.10.21
技术公布日：2023/9/22