一种干细胞来源的蛋白提取液及其制备方法与流程

1.本技术涉及生物领域，具体的涉及一种干细胞来源的蛋白提取液及其制备方法。


背景技术：

2.血管内皮细胞(vec)为覆盖于血管内膜表面的单层扁平或多角形的细胞。它既是感应细胞又是效应细胞，不仅能感知血液中的炎性信号、激素水平、切应力、压力等信息，而且能通过分泌多种血管活性物质对这些信息作出反应。研究表明，内皮细胞的损伤及功能紊乱与多种疾病的发生密切相关，包括高血压、冠心病、糖尿病、慢性肾功能衰竭等。
3.血管内皮细胞始终受到血管中流动的血液的流体力学作用，同时亦是首先受血液中病理生理变化影响的细胞之一，多种因素会导致内皮细胞损伤。内皮细胞的损伤是心血管性疾病的关键环节。vec衰老主要包括细胞复制性衰老和氧化应激诱发的细胞早衰2种方式。因细胞基因异常(如各种类型的dna损伤)引起的细胞分裂停止称为细胞复制性衰老。
4.氧化应激是指机体或细胞内以氧自由基为代表的氧化性物质的产生与消除失衡，或外源性氧化物质的过量摄入，导致氧化性物质在细胞内蓄积而易于引发氧化反应状态。氧化应激诱导内皮细胞损伤的机制非常复杂，主要表现为氧自由基的过氧化反应。由于自由基的反应引起细胞膜脂质过氧化、蛋白质和核酸变性，导致不可逆损伤。脂质过氧化可改变细胞的转运功能和酶的功能。酶活性的变化(如活化caspase3)可诱导内皮细胞的凋亡，刺激内皮细胞合成血小板活化因子，引起血小板和中性粒细胞聚集，促进炎症反应等。此外，活性氧还参与以内皮细胞脱落为特征的“失巢凋亡”。失巢凋亡是由于细胞基质间相互作用丧失而诱导发生的，鱼油具有抗动脉粥样硬化功能，鱼油中的不饱和脂肪酸可防止内皮细胞发生“失巢凋亡”。导致氧自由基大量产生的病理条件很多，如炎症反应、缺血再灌注、高血压、糖尿病等。高糖血症时，重要的抗氧化蛋白由于糖基化可使抗氧化蛋白失活，使抗氧化防御屏障减弱。同时由于葡萄糖自氧化非酶可促使蛋白糖基化，使活性氧自由基增多，引起内皮细胞损伤。
5.第10号染色体同源缺失性磷酸酶-张力蛋白(pten)具有双特异性的磷酸酶活性，人的pten基因可以编码403个氨基酸，其含有两个功能结构域，c2区域和磷酸酶区域，磷酸酶结构域调控酶催化过程，而c2区在pten与膜脂的结合中发挥关键作用，在pten的c端含有能够与pdz结合的区域，是pten与相关支架蛋白结合的重要区域，其还具有自身的去磷酸功能，这些pten的结构域和自身特点是其调控细胞生长、凋亡等过程的重要基础。pten能够调控细胞的生长、凋亡等过程，并且在癌症发生、心肌缺血再灌注、心肌肥厚等疾病发生过程中也具有调控作用，对于血管内皮细胞生物学行为、心脏发育、胰岛素信号转导等具有重要意义。研究显示，ox-ldl刺激后的vec中pten表达下调，参与动脉粥样硬化的发生。研究显示，stat3能够促进vec增殖，抑制vec凋亡。本研究结果显示，ox-ldl能够抑制vec中stat3的磷酸化，而pten可提高stat3磷酸化水平，pten可能通过促进stat3信号通路影响vec增殖和凋亡。
6.骨髓间充质干细胞是一族具有自我复制和多向分化潜能的细胞，在一定条件下可
分化成骨、软骨、脂肪和内皮细胞等中、内、外胚层细胞。具有易于获得、能大量扩增等特点。将mscs细胞经过内皮诱导培养14d后，细胞形态发生较大变化，由长梭形变为扁平多角形，细胞呈铺路石样排列，且所得细胞高度表达cd31，说明诱导后细胞获得了内皮细胞的特性，证明了mscs在vegf和bfgf诱导下可向内皮细胞方向分化可以用于治疗内皮细胞相关的疾病。此外，在干细胞培养的培养基中分离得到的培养物，其中富含各种细胞因子以及mirna，其可以对高糖诱导的血管内皮细胞凋亡具有保护作用，并促进血管内皮细胞的增殖和迁移，改善血管内皮细胞因高糖导致的细胞功能障碍。


技术实现要素：

7.本发明提供了一种针对pten的单克隆抗体。
8.进一步的，本发明以pten重组蛋白为免疫原，通过免疫小鼠，制备杂交瘤细胞，通过筛选，获得了特异性针对pten的单克隆抗体p3f6。
9.进一步，将p3f6杂交瘤细胞通过测序，鉴定获得了其轻链可变区序列和重链可变区序列，具体如下：
10.轻链可变区(seq id no：1)
11.diqltqspaimsasagekvtmtcsarkvfklmywyqqkagssprlliyp drnlasgvpvrfsgvdsgtsysltisrmeaedaatyycnqfrwadkwfgag tklei；
12.重链可变区(seq id no：2)
13.qvklqesgtvwagpgalvpmsckasfaemrlsdmhwikqrpgqglew igacwcvkyhvsynqkfkgkvkltavtststarmelssltnedaavyycrk lhgiwgqgttvtvss。
14.具体的，本发明的可变区还可以被保守性修饰。进一步的，“保守性修饰的变体”包括对多肽序列的各个置换、缺失或添加，它们导致某个氨基酸置换为化学上相似的氨基酸。提供功能上相似氨基酸的保守性置换表是本领域熟知的。这类保守性修饰的变体相对于本发明的多态性变体、物种间同源物和等位基因而言是附加的并且不排斥它们。以下8组含有互为保守替换的氨基酸：1)丙氨酸(a)、甘氨酸(g)；2)天冬氨酸(d)、谷氨酸(e)；3)天冬酰胺(n)、谷氨酰胺(q)；4)精氨酸(r)、赖氨酸(k)；5)异亮氨酸(i)、亮氨酸(l)、甲硫氨酸(m)、缬氨酸(v)；6)苯丙氨酸(f)、酪氨酸(y)、色氨酸(w)；7)丝氨酸(s)、苏氨酸(t)；和8)半胱氨酸(c)、甲硫氨酸(m)(参阅例如，creighton,
15.proteins(1984))。在一些实施方案中，术语“保守序列修饰”用于指不显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。
16.具体的，所述的重链可变区和轻链可变区可以在保持cdr序列不变的情形下，进行保守性的替换或修饰。
17.具体的，所述重链可变区序列与seq id no:2相比，保持氨基酸序列大于95％的同源性并且保持抗体活性。
18.具体的，所述重链可变区序列与seq id no:2相比，保持氨基酸序列大于96％的同源性并且保持抗体活性。
19.具体的，所述重链可变区序列与seq id no:2相比，保持氨基酸序列大于97％的同源性并且保持抗体活性。
20.具体的，所述重链可变区序列与seq id no:2相比，保持氨基酸序列大于98％的同
源性并且保持抗体活性。
21.具体的，所述重链可变区序列与seq id no:2相比，保持氨基酸序列大于99％的同源性并且保持抗体活性。
22.具体的，所述轻链可变区序列与seq id no:1相比，保持氨基酸序列大于95％的同源性并且保持抗体活性。
23.具体的，所述轻链可变区序列与seq id no:1相比，保持氨基酸序列大于96％的同源性并且保持抗体活性。
24.具体的，所述轻链可变区序列与seq id no:1相比，保持氨基酸序列大于97％的同源性并且保持抗体活性。
25.具体的，所述轻链可变区序列与seq id no:1相比，保持氨基酸序列大于98％的同源性并且保持抗体活性。
26.具体的，所述轻链可变区序列与seq id no:1相比，保持氨基酸序列大于99％的同源性并且保持抗体活性。
27.进一步的，本领域熟知，干细胞的培养液中富含各种蛋白和细胞因子，具有较强的抗衰老、促进细胞增殖的效果。因此，本发明还提供一种脂肪干细胞无细胞提取液，其内富含蛋白和细胞因子成分，具有抗衰老、促进细胞增殖等作用，在抗衰老研究中拥有广阔的应用前景。
28.因此，本发明进一步的提供了干细胞的培养液在抑制细胞衰老或凋亡中的用途。
29.pten具有蛋白酪氨酸磷酸酶活性，负调节pi3k-akt信号通路，参与调控细胞多种功能如细胞周期进展，细胞迁移、扩散和生长，研究表明高糖通过上调pten诱导内皮细胞凋亡。因此，通过添加pten的单克隆抗体p3f6，能够在高糖环境下，抑制pten的活性，进而提高内皮细胞的活性，避免凋亡。
30.更进一步的，本发明还提供了pten的单克隆抗体p3f6在制备用于抑制内皮细胞在高糖环境下衰老或凋亡的药物中的用途。
31.更进一步的，本发明还提供了pten的单克隆抗体p3f6联合脂肪干细胞培养液在制备用于抑制内皮细胞在高糖环境下衰老或凋亡的药物中的用途。
32.具体的，本发明的药物组合物可以是口服剂型或者注射剂型。
33.可根据熟知技术使用适宜分散剂或润湿剂及悬浮剂来调配可注射制剂，例如，无菌可注射水性或油性悬浮液。无菌可注射制剂还可为存在于无毒胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如，作为溶于1，3-丙二醇的溶液。可采用的可接受溶媒及溶剂尤其为水、林格溶液以及等渗氯化钠溶液。此外，常采用无菌不挥发性油作为溶剂或悬浮媒介。为达此目的，可采用任何温和不挥发性油，包括合成甘油单酯或甘油二酯。此外，在注射剂制备中可使用诸如油酸等脂肪酸。
34.本发明提供药物组合物，所述组合物包含与可药用载体配制在一起的结合pten的抗体(完整抗体或其结合片段)。该组合物可以额外地含有适于例如治疗或预防心血管病的一种或多种其他治疗药。可药用载体增强或稳定组合物，或可以用来促进组合物的制备。可药用载体包括生理上相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。
35.可以通过本领域已知的多种方法施用本发明的药物组合物。施用途径和/或模式
根据所需的结果变动。优选玻璃体内、静脉内、肌内、腹内或皮下施用或靠近靶部位施用。可药用载体应当适于玻璃体内、静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊髓或表皮施用(例如，通过注射或输注)。取决于施用途径，可以将活性化合物(即，抗体，双特异性和多特异性分子)包覆在保护该化合物免遭可能使这种化合物失活的酸和其他天然条件作用的材料中。
36.组合物应当是无菌和流动的。可以例如通过使用包衣如卵磷脂、在分散体情况下通过维持要求的粒度和通过使用表面活性剂，维持适宜的流动性。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇或山梨醇和氯化钠。可以通过在组合物中包含延迟吸收的物质例如单硬脂酸铝或明胶，引起可注射组合物的长期吸收。
37.有益效果
38.本发明提供一种脂肪干细胞无细胞提取液，其内富含蛋白和细胞因子成分，具有抗衰老、促进细胞增殖等作用，在抗衰老研究中拥有广阔的应用前景。同时以pten重组蛋白为免疫原，通过免疫小鼠，制备杂交瘤细胞，通过筛选，获得了特异性针对pten的单克隆抗体p3f6，该抗体单独或者联合无细胞提取液能够有效的抑制内皮细胞的衰老，能够用于抑制糖尿病患者内皮细胞凋亡，具有较好的治疗心血管疾病的应用前景。
附图说明
39.图1pten单克隆抗体p3f6特异性鉴定结果图
40.图2各实验组细胞凋亡率结果图
41.图3western blot检测各实验组pten蛋白表达水平结果图
具体实施方式
42.本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。以下实施案例中的方法、设备、材料，如果未进行特别说明，均为本领域常规方法、设备和材料，均可由市场购得。
43.实施例1pten单克隆抗体的制备
44.磷酸酶张力蛋白同源物(pten)重组蛋白，货号：zy822hu015，品牌：hzbscience。
45.取3只6-8周龄雌性balb/c小鼠，将pten重组蛋白与弗氏完全佐剂1:1均匀乳化，通过腹腔注射方式免疫小鼠，每只小鼠免疫注射50μg蛋白，每次免疫间隔2周，第2次及以后免疫使用弗氏不完全佐剂与pten蛋白1:1均匀乳化，第3次免疫后1周对小鼠进行尾部采血，将小鼠血清梯度稀释后作为一抗、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠igg作为二抗，使用pten蛋白包被elisa板，用间接elisa方法检测抗体效价，选取抗体效价最高的1号小鼠(1:250000)进行超免。超免为腹腔注射60μg蛋白。
46.超免后的小鼠脾脏，研磨制备单细胞悬液后和sp2/0细胞按照10:1的比例进行混合，使用peg1500进行细胞融合，使用1640培养基终止融合并使用hat培养基均匀铺板，待细胞生长7d后以细胞上清作为一抗、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠igg作为二抗，用间接elisa方法筛选阳性孔。
47.挑选间接elisa检测od450nm值高于阴性对照2.1倍的孔进行转孔，转移至96孔板，按梯度进行稀释，用1640培养基将其充分混匀，铺于96孔板，扩大培养；待亚克隆细胞长满后进行elisa检测，挑选阳性克隆孔进行第2次亚克隆；第2次亚克隆结束后，再次进行elisa检测，直至单克隆孔的细胞上清检测阳性率为100％，筛选获得了1株能够最稳定分泌pten蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞p3f6。
48.取balb/c小鼠腹腔注射弗氏不完全佐剂,每只500μl,10d后腹腔注射杂交瘤细胞1
×
106/200μl,待小鼠腹部明显膨大以后抽取腹水,12000r/min离心10min，取上清。
49.将腹水分别进行梯度稀释,通过间接elisa测定效价,结果如表1所示。
50.表1单克隆抗体小鼠腹水效价测定结果
51.稀释度p/n1:10036.3871:100030.5641:1000024.6571:10000018.7641:25000014.4571:5000009.2591:10000003.2561:20000000.197
52.从表1显示可以看出，p3f6单克隆抗体的的腹水效价达到1:1000000。
53.将腹水采用protein g亲和层析柱分离纯化柱纯化，通过sds-page鉴定获得了纯净的单克隆抗体，采用bca法进行蛋白含量鉴定，调整单抗浓度为1mg/ml。
54.实施例2pten单克隆抗体p3f6特异性鉴定
55.将pten单克隆抗体p3f6分别与pten及bsa、小鼠血清、大肠杆菌裂解液进行westernblot反应，验证单克隆抗体的特异性。
56.具体的以上各组分分别加入2
×
sds裂解液，每泳道10ng上样。sds-page后，将蛋白转移至硝酸纤维素膜上；5％脱脂奶粉(tbst配制)室温封闭2h后，分别与p3f6单抗(2μg/ml)4℃孵育过夜。次日洗涤后，加入hrp标记的羊抗鼠igg(1∶2000)，室温孵育50min，ecl化学发光显色。
57.结果显示，单克隆抗体与pten蛋白反应，而不与bsa、小鼠血清、大肠杆菌裂解液反应(图1，泳道1是pten蛋白，泳道2-4分别是bsa、小鼠血清、大肠杆菌裂解液)，表明制备的单克隆抗体特异性识别pten蛋白。
58.实施例3pten单克隆抗体p3f6的亲和力鉴定
59.用scatchard分析法测定p3f6单抗的总结合和非特异结合，计算其特异性结合。本实验用抗原直接竞争法进行(标记抗原稀释法)，具体操作如下。在酶标板上加入1：500稀释的单抗(1mg/ml)，37℃孵育60分钟；洗涤；在总结合孔加入浓度递增的pten-hrp溶液(pten含量为1
×
10-9
～1
×
10-6
mol/l)，在非特异结合孔加入浓度递增的pten-hrp溶液和浓度递增的游离pten(1
×
10-6
～
[0060]1×
10-3
mol/l)，37℃孵育60分钟，4℃过夜；洗涤；加入底物缓冲液显色；终止液终止反应后，于450nm测定吸光值。以特异性结合的吸光值对pten-hrp浓度绘制饱和曲线，计
算p3f6单抗的亲和常数k为1.46
×
109l/mol。
[0061]
实施例4脂肪干细胞无细胞提取液的制备
[0062]
将人脂肪组织清洗消化后中和反应，室温1200r/min离心5min，离心半径6cm，弃去油脂、脂肪组织及上清，重复2遍后重悬沉淀细胞，接种于培养瓶内。待adscs融合约80％时传代，取adscs接种于100mm的培养皿中，待细胞80％融合时弃去培养液，以不含fbs的dmem培养72h，收上清液，室温下1200r/min，离心5min，离心半径6cm，并用0.22μm的无菌滤器过滤，即得到无细胞提取液，将提取液进行超滤，控制提取液中蛋白浓度为5mg/ml备用。
[0063]
实施例5p3f6单抗以及干细胞无细胞提取液功效验证
[0064]
人主动脉内皮细胞(haec)(编号pc-137h，武汉赛奥斯生物)加入4ml内皮细胞专用培养基(sciencecell)悬浮细胞，接种到塑料培养瓶中。细胞生长融合达80％～90％，胰酶消化细胞，取4代细胞做实验。
[0065]
实验分为正常组、高糖模型组、高糖模型+低浓度单抗处理组，高糖模型+高浓度单抗处理组，高糖模型+无细胞提取液处理组，高糖模型+低浓度单抗+无细胞提取液处理组。
[0066]
正常组糖浓度为5.6mmol/l，高糖模型组糖浓度为30mmol/l；高糖模型+低浓度单抗处理组的糖浓度为30mmol/l同时单抗浓度为50μg/ml，高糖模型+高浓度单抗处理组的糖浓度为30mmol/l同时单抗浓度为200μg/ml，高糖模型+无细胞提取液处理组的糖浓度为30mmol/l同时无细胞提取液蛋白浓度为1mg/ml，高糖模型+低浓度单抗+无细胞提取液处理组的糖浓度为30mmol/l同时无细胞提取液蛋白浓度为1mg/ml单抗浓度为50μg/ml。阳性对照组：糖浓度为30mmol/l同时添加sf1670浓度为50μg/ml。后几组实验组均是将单抗或提取液或pic先预培养内皮细胞0.5h后加入高糖，各组作用时间为6d，实验重复5次。
[0067]
fitc-pi双染流式细胞术检测细胞凋亡率：参照annexin-v-fluos染色试剂盒说明书操作：细胞分组干预后，用胰酶(0.25％，不含edta)消化处理细胞，1000r/min离心5min，收集细胞沉淀，pbs清洗2遍后，加入500μl fitc/pi试剂盒缓冲液重悬细胞，取300μl悬液于流式管中，分别加入fitc3μl、pi3μl，避光15min后上机检测。结果如图2所示。
[0068]
从图2可以看出，高糖模型组的凋亡率显著高于正常组的凋亡率。在高糖的环境下，随着抗体浓度升高，凋亡率是逐步下降的，在单抗浓度为200μg/ml时，内皮细胞的凋亡率只有(13.12
±
0.28)％，较模型组显著的降低，差异极其显著(p《0.01)。从图2也可以看出，添加干细胞无细胞提取液也能够显著的降低细胞的凋亡率，而且将干细胞无细胞提取液与单抗一起使用后，内皮细胞的凋亡率更是显著的低于单抗的凋亡率，其只有(10.61
±
0.83)％，这也说明单抗和干细胞无细胞提取液具有协同的降低细胞凋亡的效果。
[0069]
westernblot检测总pten蛋白水平：收集细胞，用pbs洗涤干净，裂解液裂解，4℃，12000r/min离心10min，取上清，bca法测定蛋白浓度，上样缓冲液稀释各样品蛋白，95℃变性5min后上样。先后经电泳、转膜、封闭过夜后，分别加入pten一抗4℃振荡过夜，tbst洗5min
×
3次，加入hrp标记的二抗常温孵育1h，ecl法显影，应用凝胶成像分析仪测定蛋白条带灰度后，计算蛋白条带和内参照β-actin的比值。结果如图3所示。
[0070]
westernblot蛋白灰度pten/actin比较显示，模型组较正常组pten蛋白表达增加明显，而低浓度单抗组即可有效的抑制pten的表达，高浓度单抗组pten表达只有(0.31
±
0.05)，有效的抑制了pten的表达，比阳性对照组的抑制效果显著。
[0071]
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实
体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
[0072]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

技术特征：
1.一种特异性针对pten的单克隆抗体，其命名为p3f6，其轻链可变区序列如seq id no：1所示，重链可变区序列如seq id no：2所示。2.权利要求1所述的pten单克隆抗体p3f6在制备用于抑制细胞中pten表达的试剂中的用途。3.权利要求1所述的pten单克隆抗体p3f6在制备用于抑制内皮细胞凋亡的药物中的用途。4.权利要求1所述的pten单克隆抗体p3f6和脂肪干细胞无细胞提取液在制备用于抑制内皮细胞凋亡的药物中的用途；其中，脂肪干细胞无细胞提取液是将adscs接种于培养皿中，待细胞80％融合时弃去培养液，以不含fbs的dmem培养72h，收上清液，室温下离心取上清液，并用0.22μm的无菌滤器过滤，即得脂肪干细胞无细胞提取液。5.如权利要求4所述的用途，其特征在于所述的内皮细胞是人主动脉内皮细胞。

技术总结
本发明涉及一种干细胞来源的蛋白提取液及其制备方法。该提取液其内富含蛋白和细胞因子成分，具有抗衰老、促进细胞增殖等作用，在抗衰老研究中拥有广阔的应用前景。同时以PTEN重组蛋白为免疫原，通过免疫小鼠，制备杂交瘤细胞，通过筛选，获得了特异性针对PTEN的单克隆抗体P3F6，该抗体单独或者联合无细胞提取液能够有效的抑制内皮细胞的衰老，能够用于抑制糖尿病患者内皮细胞凋亡，具有较好的治疗心血管疾病的应用前景。疾病的应用前景。


技术研发人员：袁吉运 戴伟利
受保护的技术使用者：北京川晋生物科技有限公司
技术研发日：2023.07.12
技术公布日：2023/9/22