靶向TOR1A蛋白的sgRNA及其应用

靶向tor1a蛋白的sgrna及其应用
技术领域
1.本发明属于生物医学领域，涉及一种靶向tor1a蛋白的sgrna及其在dyt1肌张力障碍治疗中的应用。


背景技术：

2.dyt1肌张力障碍是一种遗传性的孤立性肌张力障碍，表现为持续或间歇性的肌肉收缩导致的不自主运动或姿势异常。从遗传学上讲，这种早发的运动障碍是由tor1a基因5号外显子的3-bp杂合框内缺失(c.907_909delgag)引起的，导致tor1a蛋白(tor1a
δe
)在302或303位失去1个谷氨酸残基。tor1a是一个普遍表达的aaa+蛋白，定位在内质网(er)/核包膜(ne)的连续腔内。到目前为止，tor1a的生物学作用尚未完全阐明，然而，它已发现参与到各种生物学功能中，包括作为分子伴侣的蛋白质质量控制、与调控er应急及相关的perk-eif2α信号传导、调节核骨架和细胞骨架(linc)复合体和细胞极性、核孔的生物生成、膜平衡和核质运输、突触囊泡循环和大核糖核蛋白颗粒通过ne排出到细胞膜等等。
3.其中许多功能可能涉及er中的蛋白质相互作用。研究表明，tor1a
δe
突变通过损害tor1a的功能以多种方式发挥作用。aaa+蛋白一般是通过多聚体的形式发挥功能的。研究发现tor1a分别与lap1(ne上)和lull1(er上)相互作用形成一个六聚体并触发atp水解和分解，以此发挥其酶活性，这也被晶体结构所证实。具体来说，tor1a的c端区域在tor1a/lull1和tor1a/lap1六聚体内部发挥作用，而δe突变体导致它们的结合不稳定，从而导致其atp酶的活性降低。
4.dyt1肌张力障碍是由tor1a
δe
突变的功能丧失(单倍体剂量不足)还是显性负效应(dominant-negative)所引起的目前仍有争议。不过，显性负效应确实参与了dyt1的病理过程。例如，tor1a
δe
在ne中积累，导致形成被称为球状体的ne源性膜性包裹体。tor1a
δe
过量表达导致野生型(wt)tor1a被招募进入球状体，而通过选择性地沉默tor1a
δe
可以抑制这一过程，从而恢复其正常的亚细胞定位和功能。同样，蛋白质质量控制机制也被tor1a
δe
抑制，导致核周围泛素(ubiquitin)的异常积累。此外，tor1a促进了细胞核中复制的单纯疱疹病毒(hsv)衣壳穿越ne进入细胞膜并离开细胞，而内源性水平的tor1a
δe
干扰了这一过程。通过基因组编辑突变等位基因明显使正常tor1a活性增加，并恢复了其在dyt1成纤维细胞中促进hsv复制的功能。为进一步支持其显性负效应，以往研究也证明了用小干扰rna(sirna)或反义寡核苷酸(aso)选择性地沉默tor1a突变体的mrna可以使dyt1表型恢复正常。
5.前期已有现有技术对tor1a突变等位基因开展特异性靶向的尝试，但所使用的spcas9-vrqr和sgrna对鉴别突变和wt两个等位基因的特异性较低。


技术实现要素：

6.本发明旨在提供一种靶向tor1a蛋白的sgrna，该sgrna可特异与tor1a
δe
等位基因序列结合，继而被nmcas9结合，导致tor1a
δe
突变序列被切割而丧失编码能力。
7.为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
8.靶向tor1a蛋白的sgrna，该sgrna可特异与tor1a
δe
等位基因序列结合，继而被nmcas9结合。
9.作为一种优选方式，所述sgrna的核苷酸序列如seq id no.1、seq id no.2或seq id no.16所示。
10.如seq id no.1所示的sgrna命名为sgmut-nm21，sgmut-nm21为识别nmcas9的pam位点之前21个核苷酸，其序列与野生型tor1a核苷酸序列相比存在3-nt的错配。
11.sgmut-nm21核苷酸序列与tor1a
δe
核苷酸序列完全匹配。
12.如seq id no.2所示的sgrna命名为sgmut-nm24，sgmut-nm24为识别nmcas9的pam位点之前24个核苷酸，其序列与野生型tor1a核苷酸序列相比存在3-nt的错配。
13.sgmut-nm24核苷酸序列与tor1a
δe
核苷酸序列完全匹配。
14.如seq id no.16所示的sgrna命名为sgmut-nm23，sgmut-nm23为识别nmcas9的pam位点之前23个核苷酸，其序列与野生型tor1a核苷酸序列相比存在3-nt的错配。
15.sgmut-nm23核苷酸序列与tor1a
δe
核苷酸序列完全匹配。
16.所述靶向tor1a蛋白的sgrna可特异与tor1a
δe
等位基因序列结合，继而被nmcas9结合，导致tor1a
δe
突变序列被切割而丧失编码能力。
17.编码nmcas9的核苷酸序列如seq id no.7所示，所述nmcas9的氨基酸序列如seq id no.8所示。
18.一种重组质粒或重组病毒，包括如seq id no.1、seq id no.2或seq id no.16所示的sgrna。
19.一种大肠杆菌，包括如seq id no.1、seq id no.2或seq id no.16所示的sgrna；或重组质粒、或重组病毒。
20.基于同样的发明创造，本发明还要求保护所述靶向tor1a蛋白的sgrna、所述重组质粒或重组病毒、或所述大肠杆菌在制备治疗dyt1肌张力障碍的药物中的应用。
21.作为一种优选方式，所述靶向tor1a蛋白的sgrna特异性与tor1a
δe
等位基因序列结合，继而被nmcas9结合，导致tor1a
δe
突变序列被切割而丧失编码能力。
22.编码nmcas9的核苷酸序列如seq id no.7所示，所述nmcas9的氨基酸序列如seq id no.8所示。
23.基于同样的发明创造，本发明还要求保护一种试剂盒，所述试剂盒包括所述靶向tor1a蛋白的sgrna、所述重组质粒或重组病毒、或所述大肠杆菌。
24.本发明还要求保护所述试剂盒在制备治疗dyt1肌张力障碍的试剂中的应用。
25.作为一种优选方式，上述sgrna来源于人或非人哺乳动物，较佳地来源于人。
26.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
27.本发明发现nmcas9联合鉴别性sgrna(sgmut-nm21、sgmut-nm23、sgmut-nm24)相较于sacas9-kkh(sgmut-kkh1)对突变型tor1a
δe
基因的切割特异性更强，几乎不切割wt tor1a基因；而相较于spca9-v(r)qr(sgmut-vqr1)切割效率更高。另外，nmcas9是一种紧凑型cas酶，其大小为1082aa，与传统的spcas9(1368aa)相比，更适合包装入基因治疗中常用的腺相关病毒(aav)中，因此，其临床转化的价值更为突出。
附图说明
28.图1是利用crispr开展等位基因特异性靶向tor1a
δe
的策略分析；
29.a.利用ascrispr网站进行in silico分析结果；b.选取的用于等位基因特异性编辑的sgrna序列。
30.图2是pcag-egxxfp-htor1a-wt-gdna质粒图谱；
31.图3是pcag-egxxfp-htor1a-mut-gdna质粒图谱；
32.图4是利用nmcas9开展等位基因特异性靶向的质粒图谱；
33.图5是利用sacas9-kkh开展等位基因特异性靶向的质粒图谱；
34.图6是利用spcas9-vqr开展等位基因特异性靶向的质粒图谱；
35.图7是实验验证鉴别性sgrna的切割效率和靶向特异性；
36.a.利用pcag-egxxfp系统鉴定sgrna切割效率示意图；b.鉴别性sgrna长度设置；c.293t细胞中sgrna切割产生egfp荧光结果图；d.产生egfp荧光统计结果图。
37.图8是鉴别性sgrna/nmcas9减少dyt1病人成纤维细胞中核周ubiquitin的聚集；a.载体图示；b.成纤维细胞中载体表达(ha；绿色荧光染色)及核周ubiquitin聚集情况(红色荧光染色)；c.核周ubiquitin聚集的比例统计。
38.图9为包装质粒的结构示意图。
39.图10为包膜蛋白质粒的结构示意图。
40.图11为0420载体的结构示意图。
41.图12为0421载体的结构示意图。
42.图13为0422载体的结构示意图。
43.图14为0423载体的结构示意图。
44.图15为0424载体的结构示意图。
45.图16为0425载体的结构示意图。
46.图17为0426载体的结构示意图。
47.图18为0427载体的结构示意图。
48.图19为0428载体的结构示意图。
49.图20为0429载体的结构示意图。
50.图21为0430载体的结构示意图。
51.图22为0431载体的结构示意图。
52.图23为0432载体的结构示意图。
具体实施方式
53.以下将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
54.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，通常按照常规条件如j.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。
55.主要实验材料
56.293t细胞(普诺赛，#cl-0001)
57.dyt1病人成纤维细胞(coriell,#gm03211，携带tor1a
wt/δe
杂合变异)
58.dmem完全培养基：dmem(gibco)，10％胎牛血清(fbs)和1％青链霉素混合液(solarbio)
59.pei转染试剂(polysciences,#24765)
60.opti-mem(gibco,#31985062)
61.lb液体培养基：蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl 5g(定容至1l，高压蒸汽灭菌，4℃保存)
62.lb固体培养基：蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl 5g，琼脂15g(定容至1l，高压蒸汽灭菌)，冷却后添加氨苄霉素，分装倒至细菌培养皿中于4℃保存)
63.tae缓冲液(10
×
)：tris 24.2g，edta 5.71g，冰乙酸5.71ml(定容至1l)
64.fluoromount-g封片剂(southern biotech)
65.sanprep质粒抽提试剂盒及胶回收试剂盒(上海生工)
66.表1分子克隆用酶及试剂
[0067][0068][0069]
表2免疫荧光染色所用一抗和二抗
[0070][0071]
本发明提供三种鉴别性sgrna(sgmut-nm21、sgmut-nm23及sgmut-nm24)序列，其可特异与tor1a
δe
等位基因序列结合，继而被nmcas9结合，导致tor1a
δe
突变序列被切割而丧失编码能力。
[0072]
sgmut-nm21为识别nmcas9的pam位点之前21个核苷酸，其序列与野生型tor1a核苷酸序列相比存在3-nt的错配，上述核苷酸序列如seq id no:1所示。
[0073]
sgmut-nm21核苷酸序列与tor1a
δe
核苷酸序列完全匹配。
[0074]
sgmut-nm24为识别nmcas9的pam位点之前24个核苷酸，其序列与野生型tor1a核苷
酸序列相比存在3-nt的错配，上述核苷酸序列如seq id no:2所示。
[0075]
sgmut-nm24核苷酸序列与tor1a
δe
核苷酸序列完全匹配。
[0076]
sgmut-nm23为识别nmcas9的pam位点之前23个核苷酸，其序列与野生型tor1a核苷酸序列相比存在3-nt的错配，上述核苷酸序列如seq id no.16所示。
[0077]
野生型tor1a(5号外显子)基因组核苷酸序列如seq id no:3所示。
[0078]
突变型tor1a
δe
(5号外显子)基因组核苷酸序列如seq id no:4所示。
[0079]
野生型tor1a(全长)蛋白质氨基酸序列如seq id no:5所示。
[0080]
突变型tor1a
δe
(全长)蛋白质氨基酸序列如seq id no:6所示。
[0081]
nmcas9核苷酸序列如seq id no:7所示。
[0082]
nmcas9蛋白质氨基酸序列如seq id no:8所示。
[0083]
sgmut-kkh1为识别sacas9-kkh的pam位点之前21个核苷酸，其序列与野生型tor1a核苷酸序列相比存在3-nt的错配，核苷酸序列如seq id no:9所示。
[0084]
sgmut-kkh1核苷酸序列与tor1a
δe
核苷酸序列完全匹配。
[0085]
sacas9-kkh核苷酸序列如seq id no:10所示。
[0086]
sacas9-kkh蛋白质氨基酸序列如seq id no:11所示。
[0087]
sgmut-vqr1为识别spcas9-vqr的pam位点之前20个核苷酸，其序列与野生型tor1a核苷酸序列相比存在3-nt的错配，核苷酸序列如seq id no:12所示。
[0088]
sgmut-vqr1核苷酸序列与tor1a
δe
核苷酸序列完全匹配。
[0089]
sgmut-vqr2为识别spcas9-vqr的pam位点之前20个核苷酸，其序列与野生型tor1a核苷酸序列完全匹配，但tor1a
δe
突变引入了新的pam位点(nga)，其较经典的pam位点(ngg)介导cas9切割的效率稍低。核苷酸序列如seq id no:13所示。
[0090]
sgmut-vqr2核苷酸序列与tor1a
δe
核苷酸序列完全匹配。
[0091]
spcas9-vqr核苷酸序列如seq id no:14所示。
[0092]
spcas9-vqr蛋白质氨基酸序列如seq id no:15所示。
[0093]
实施例1利用crispr开展等位基因特异性靶向tor1a
δe
的策略分析
[0094]
利用ascrispr网站进行in silico分析结果，选取的用于等位基因特异性编辑的候选sgrna序列(表3)。具体来说，在ascrispr网站(http://www.genemed.tech/ascrispr)中输入query序列：
[0095]
tgatgaagacattgtaagcagagtggctgag[gag/-]atgacatttttccccaaagaggagagagttt
[0096]
选取四大类cas酶(cas9、cpf1、cas12b、casx)，其中每大类含若干亚型或变体，总共24种cas酶，它们分别识别特异的pam位点。网站分析结果后得到可以特异靶向wt和突变tor1a的sgrnas以及off-target情况(表3；图1)。
[0097]
表3特异靶向wt和突变tor1a的sgrnas以及off-target情况
[0098]
[0099][0100]
选取可以特异靶向突变tor1a的候选sgrna，已知针对spcas9设计的sgrna的长度为21nt效果最好，针对sacas9设计的sgrna的长度为22nt效果最好，但针对nmcas9不确定。因此针对nmcas9分别设计了不同长度的sgrna(18～24nt)以评估其最高效率的sgrna形式(表4)。
[0101]
表4in silico分析后选取候选sgrnas
[0102][0103][0104]
实施例2实验验证sgrna的切割效率和靶向特异性
[0105]
1.pcag-egxxfp载体切割：
[0106]
利用pcag-egxxfp(addgene 50716)载体为backbone，使用bamhi及ecori双酶切，酶切体系(20μl)如下表，37℃酶切3小时，酶切体系如下：
[0107]
表5双酶切体系
[0108]
添加加入量pcag-egxxfp(addgene 50716)载体3μg(xxxμl)10
×
cutsmart buffer2μlbamhi-hf0.5μlecori-hf0.5μlddh2o至20μl
[0109]
酶切之后得到的产物跑1％琼脂糖凝胶(160v，20分钟)，1％琼脂糖凝胶制备如下：在1
×
tae buffer中加入1％琼脂糖，在微波炉加热至完全溶解，待稍冷却后加入1
×
gel-red，摇匀后倒入插好梳子的制胶盒，待自然凝固后使用。切取含长片段载体的胶块，采用试剂盒sanprep核酸纯化套件进行回收备用。
[0110]
2、pcr片段的获取
[0111]
具体过程如下：
[0112]
首先使用以下引物进行pcr扩增tor1a
wt/δe
基因组dna(从杂合病人的成纤维细胞提取)：
[0113]
egxxfp-f:cggggatccgaccggaacctcattgattat(seq id no.36)
[0114]
egxxfp-r:ccggaattcttggtgaacaccgttttgc(seq id no.37)
[0115]
pcr扩增体系如下：
[0116]
表6 pcr扩增体系
[0117]
添加加入量tor1a
wt/δe
基因组dna100ngegxxfp-f(10μm)1.25μlegxxfp-r(10μm)1.25μl5
×
primestar buffer10μldntp(2.5mm)4μlprimestar enzyme0.5μlddh2o至50μl
[0118]
pcr扩增程序如下，共35个循环：
[0119]
表7 pcr扩增程序
[0120]
预热94℃1min变性98℃10s退火56℃15s延伸72℃1min/1kb72℃10min
[0121]
得到的pcr产物跑1％琼脂糖凝胶中电泳，后于紫外分析仪上分析并切胶回收大小正确的条带(197bp)。再使用bamhi及ecori双酶切，酶切体系(20μl)如下表，37℃酶切1小
nls pcr后酶切胶回收产物室温连接3小时后转化至stbl3感受态细胞中并涂布于lb平板上，次日，挑取单克隆菌落扩大培养后，抽取质粒并sanger测序验证。该步得到a2b2 pxpr206-lenti-u6-nm grna scaffold-sacas9-puro载体(后称a2b2载体)。酶切体系、胶回收、连接转化、质粒提取流程同前。
[0140]
将a2b2载体使用agei/bamhi双酶切后胶回收备用；以psimpleii-u6-sgrna-bsmbi-nls-nmcas9-ha-nls(addgene 115694)载体为模板pcr扩增出nmcas9-ha片段(3382bp)，跑1％琼脂糖胶回收。酶切体系、胶回收、连接转化、质粒提取流程同前。
[0141]
pcr引物序列为：0415-f:cgccagaacacaggaccggtgccaccatggtgcctaagaaga(seq id no.40)；
[0142]
0415-r:aagttggtggccccggatccctcgagatccagcttctttttcttcgctg(seq id no.41)。
[0143]
将a2b2载体酶切产物及psimpleii-u6-sgrna-bsmbi-nls-nmcas9-ha-nls(addgene 115694)pcr酶切产物用gibson assembly连接，体系如下：
[0144]
表10 gibson连接体系
[0145][0146][0147]
其中50-100ng载体以及3倍量的片段混匀；连接体系于50℃反应30分钟，尔后进行转化、挑单克隆、抽提质粒以及sanger测序。转化、挑单克隆、抽提质粒以及sanger测序的步骤同上。该步得到pxpr206-lenti-u6-grna-nmcas9-puro(图4)。
[0148]
将pxpr206-lenti-u6-grna-sacas9-puro(addgene 96920)载体使用agei/bamhi双酶切后胶回收备用；以sacas9-kkh msp1830(addgene 70708)载体为模板pcr扩增出sacas9-flag片段(3308bp)，跑1％琼脂糖胶回收。
[0149]
pcr引物序列为：0414-f：cgccagaacacaggaccggtcgccaccatggg(seq id no.42)；
[0150]
0414-r：aagttggtggccccggatccctcgagcttgtcatcgtcatccttgtaatcgatgt(seq id no.43)。
[0151]
将pxpr206-lenti-u6-grna-sacas9-puro(addgene 96920)载体酶切产物及sacas9-kkh msp1830(addgene 70708)pcr酶切产物用gibson assembly连接，体系同前。尔后进行转化、挑单克隆、抽提质粒以及sanger测序。转化、挑单克隆、抽提质粒以及sanger测序的步骤同上。该步得到pxpr206-lenti-u6-grna-sacas9-kkh-puro(图5)。
[0152]
将lenticrispr v2-puro(addgene 52961)载体使用agei/bamhi双酶切后胶回收备用；以p459spcas9-vqr-puro(addgene 101715)载体为模板pcr扩增出flag-spcas9-vqr片段(4315bp)，跑1％琼脂糖胶回收。
[0153]
pcr引物序列为：0416-f：cgccagaacacaggaccggtgccaccatggac(seq id no.44)；
[0154]
0416-r：aagtttgttgcgccggatccctttttcttttttgcctggccgg(seq id no.45)。
[0155]
将lenticrispr v2-puro(addgene 52961)载体酶切产物及p459 spcas9-vqr-puro(addgene 101715)pcr酶切产物用gibson assembly连接，体系同前。尔后进行转化、挑单克隆、抽提质粒以及sanger测序。转化、挑单克隆、抽提质粒以及sanger测序的步骤同上。
该步得到lenticrispr v2-spcas9-vqr-puro(图6)。
[0156]
我们将前面构建的三种crispr载体：pxpr206-lenti-u6-grna-nmcas9-puro(图4)、pxpr206-lenti-u6-grna-sacas9-kkh-puro(图5)以及lenticrispr v2-spcas9-vqr-puro(图6)分别用fastdigest bsmbi酶切，经胶回收长片段载体。酶切体系如下：
[0157]
表11 crispr载体酶切体系
[0158]
添加加入量crispr载体3μg10
×
fast digest buffer3μlfastdigest bsmbi1.5μlfastap1.5μldtt(100mm)0.3μlddh2o至30μl
[0159]
于37℃酶切45分钟，酶切完成后加入dna上样缓冲液，于1％琼脂糖凝胶中电泳160v，20分钟，后于紫外分析仪上分析并切胶回收载体条带，胶回收采用试剂盒sanprep核酸纯化套件进行回收三种长片段载体。
[0160]
针对设计的sgrna(表4)，分别合成正反dna单链(表12)。
[0161]
表12正反dna单链
[0162][0163][0164]
分别将每对单链在37℃中孵育30分钟，之后在95℃中变性5分钟，然后以5℃/分钟的速度降至室温以退火形成双链dna(sgmut)。
[0165]
表13退火体系
[0166]
添加加入量正向dna单链(100μm)1μl反向dna单链(100μm)1μl10
×
t4连接缓冲液1μlt4 pnk0.5μlddh2o至10μl
[0167]
分别将得到的双链dna(稀释200倍)与酶切跑胶回收后的三种长片段载体使用t4连接酶于室温对应连接1小时，后转化至大肠杆菌stbl3中。对应关系为：
[0168]
sgnc、sgmut-nm18、sgmut-nm19、sgmut-nm20、sgmut-nm21、sgmut-nm22、sgmut-nm23、sgmut-nm24与酶切后pxpr206-lenti-u6-grna-nmcas9-puro(图4)连接，分别得到0425～0432载体(结构如图16、图17、图18、图19、图20、图21、图22、图23所示)；sgnc、sgmut-kkh1与酶切后pxpr206-lenti-u6-grna-sacas9-kkh-puro(图5)连接，分别得到0423～0424载体(结构如图14、图15所示)；sgnc、sgmut-vqr1、sgmut-vqr2与酶切后lenticrispr v2-spcas9-vqr-puro(图6)连接，分别得到0420～0422载体(结构如图11、图12、图13所示)。
[0169]
表14 t4连接酶连接体系
[0170]
添加加入量稀释的双链dna1μlbsmbi酶切的crispr载体50 ngt4连接酶0.5μl10
×
t4连接缓冲液1μlddh2o至10μl
[0171]
次日，挑取单菌落至lb液体培养基中过夜摇菌，之后抽取质粒并使用sanger测序验证，确认了sgrna插入crispr载体中。转化、胶回收以及质粒抽提过程同前。
[0172]
3.细胞验证：
[0173]
293t细胞使用dmem完全培养基培养，定期以1:10的比例传代备用。将前面构建的所有cas9/sgrna载体(0420～0432载体)与tor1a
wt/δe
基因组dna的载体分别组合(图7a,b)(即全部的cas9/sgrna载体分别与tor1a
wt
和tor1a
δe
基因组dna的载体组合)，使用pei转染到293t细胞中。转染过程为：提前传代293t细胞，以2x 105细胞接种到12孔板的细胞爬片上。次日，把0.25μg cas9/sgrna质粒和0.25μg pcag-egxxfp质粒与opti-mem混合，后添加3倍体积的pei并混匀，室温静置20分钟。混合物缓缓加入培养液中，轻轻摇匀，于37℃细胞培养中继续培养过夜。次日，用pbs清洗细胞一遍，并更换为新鲜的dmem完全培养基继续培养。在转染48小时后，吸弃培养基，用pbs清洗细胞并更换为新鲜的dmem完全培养基。在荧光显微镜(leica dmi8)下观察gfp荧光并计数统计。
[0174]
具体地，如果转入的cas9/sgrna可以切割pcag-egxxfp载体(wt和突变tor1a序列)中的dna，将会引发pcag-egxxfp载体中tor1a两侧overlap元件发生同源重组，进一步使得两侧的gfxxfp组件形成一个完整可编码绿色荧光的gfp蛋白。根据gfp产生的情况可以知道cas9/sgrna是否发生dna切割的作用。结果显示，spcas9-vr/sgmut-vqr-2以及sacas9-kkh/samut-kkh-1可同时切割wt和突变tor1a序列，并产生gfp荧光，对切割tor1a突变序列的特异性不高；而nmcas9/sgmut-nm21以及nmcas9/sgmut-nm24可以特异只切割tor1a突变序列，
几乎不切割wt，导致gfp荧光的产生，结果及统计分析如图7c,d。nmcas9/sgmut-nm23可以特异切割tor1a突变序列，但同时也会少量的切割wt。该结果证明，鉴别性sgmut-nm21/cas9及sgmut-nm24/nmcas9均能特异性靶向tor1a突变序列。
[0175]
实施例3鉴别性sgrna/nmcas9减少dyt1病人成纤维细胞中核周ubiquitin的聚集
[0176]
为了验证鉴别性sgmut-nm21/cas9及sgmut-nm24/nmcas9特异性靶向tor1a突变的潜在功能意义，将0425、0429以及0432载体(图8a)分别包装成慢病毒，并转导至dyt1病人的成纤维细胞(携带tor1a
wt/δe
杂合变异)中。通过免疫荧光染色观察鉴别性sgmut-nm21/cas9及sgmut-nm24/nmcas9特异性靶向tor1a突变后对核周ubiquitin聚集的影响。
[0177]
慢病毒包装方法为：取6μg构建好的0425、0429以及0432载体、4.5μg pspax2载体(包装质粒，如图9所示)和3μg pmd2.g(包膜蛋白质粒，如图10所述)载体混合，用3倍体积的pei转染培养于10-cm培养皿的293t细胞中。转染过程为：把质粒与pei的混合物缓缓加入培养液中，轻轻摇匀，37℃温箱置12-16小时，更换培养液继续培养。转染过夜后，用pbs清洗两次，更换新鲜的10％ dmem完全培养基继续培养。转染48小时和72小时后，分别收集培养液至离心管中，用0.45μm孔径的滤器过滤去除细胞及其他碎片，得到病毒液置于4℃备用。
[0178]
成纤维细胞日常使用dmem(含15％ fbs)培养。转导实验时，将一个10-cm培养皿的成纤维细胞传至(1:5)t-25培养瓶中。次日，分别加入30ml病毒液以及6μg/ml polybrene过夜。次日，更换新的完全培养基。三天后，传细胞至细胞爬片上生长过夜，尔后用4％ pfa常温固定细胞20分钟，存于pbs中用于免疫染色实验。
[0179]
免疫染色过程为：吸弃pbs，用含3％ bsa和0.3％ triton-x-100的封闭液封闭30分钟。去除封闭液，分别加一抗稀释液(ha 1:100；ubiquitin 1:100)于4℃孵育过夜。第二天，用pbst洗3次，每次洗10min。加入相应的荧光二抗alexa fluor 488/555(1:500；invitrogen)，室温下避光孵育1小时。pbst洗3次，每次10min。最后加入dapi染核液染色5分钟，用pbs洗5分钟，并使用防褪色fluoromount-g封片剂封片。后于荧光显微镜(leica dmi8)下观察免疫染色情况。
[0180]
免疫荧光染色显示，sgrnas所在载体表达ha(绿色荧光染色)，证明载体已转入细胞中(图8b)。dyt1病人细胞中，核周ubiquitin(红色荧光染色)在sgnc组中有聚集，而sgmut-nm21及sgmut-nm24可以明显减少这种聚集(图8b,c)。该结果显示，鉴别性sgrna/nmcas9具有潜在治疗dyt1肌张力障碍病理特征的潜力。
[0181]
上述实施例阐明的内容应当理解为这些实施例仅用于更清楚地说明本发明，而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本实施例的各种等价形式的修改均落入本发明所附权利要求所限定的范围。

技术特征：
1.一种靶向tor1a蛋白的sgrna，其特征在于，该sgrna可特异与tor1a
δe
等位基因序列结合，继而被nmcas9结合。2.根据权利要求1所述的靶向tor1a蛋白的sgrna，其特征在于，所述sgrna的核苷酸序列如seq id no.1、seq id no.2或seq id no.16所示。3.一种重组质粒或重组病毒，其特征在于，包括如seq id no.1、seq id no.2或seq id no.16所示的sgrna。4.一种大肠杆菌，其特征在于，包括如seq id no.1、seq id no.2或seq id no.16所示的sgrna，或重组质粒、或重组病毒。5.如权利要求1或2所述的靶向tor1a蛋白的sgrna、如权利要求3所述的重组质粒或重组病毒、或如权利要求4所述的大肠杆菌在制备治疗dyt1肌张力障碍的药物中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，如权利要求1或2所述的靶向tor1a蛋白的sgrna、如权利要求3所述的重组质粒或重组病毒、或如权利要求4所述的大肠杆菌特异性与tor1a
δe
等位基因序列结合，继而被nmcas9结合，导致tor1a
δe
突变序列被切割而丧失编码能力。7.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括nmcas9和如权利要求1或2所述的靶向tor1a蛋白的sgrna、如权利要求3所述的重组质粒或重组病毒、或如权利要求4所述的大肠杆菌。8.如权利要求7所述的试剂盒在制备治疗dyt1肌张力障碍的试剂中的应用。

技术总结
本发明属于生物医学领域，公开了一种靶向TOR1A蛋白的sgRNA，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.16所示。所述sgRNA可特异性地与TOR1A


技术研发人员：唐宇 吴俊娇
受保护的技术使用者：中南大学湘雅医院
技术研发日：2023.07.13
技术公布日：2023/9/22