一种肿瘤局部急性炎症诱导剂及其制备方法和应用

1.本发明属于生物医药技术领域，具体为一种新型肿瘤局部急性炎症诱导剂，即载细菌外膜囊泡的温度敏感型水凝胶的制备方法及其在制备临床治疗原位实体瘤制剂中的应用。


背景技术：

2.肿瘤是严重影响人类健康的重大疾病。近年来，肿瘤免疫疗法逐渐兴起，但其临床疗效受限于实体瘤的免疫抑制微环境，其中，肿瘤慢性炎症环境的存在是关键因素，其可以促进肿瘤的发生发展、血管生成、转移和耐药。而在肿瘤中诱导急性炎症可以迅速招募免疫细胞，触发抗肿瘤免疫，从而克服慢性炎症引起的免疫抑制。细菌外膜囊泡(outer membrane vesicles,omvs)是由革兰氏阴性菌分泌的一种具有脂质双分子层的球形囊泡，粒径为20
–
250nm，含有来自亲本细胞的各种内源性免疫刺激成分和病原相关分子模式，可作为急性炎症的有效激活剂，但其全身毒性作用大，静脉注射易引起细胞因子风暴。
3.基于此，本发明用局部的温度敏感型水凝胶包载大肠埃希菌dh5α分泌的细菌外膜囊泡，构建了一种新型肿瘤原位疫苗omvs-gel，激活有效的抗肿瘤免疫应答，诱发局部急性炎症消除肿瘤，并将炎症限制在肿瘤局部，避免了全身毒性，具有较高的可行性和应用前景。目前，还未见利用诱导局部急性炎症治疗临床实体瘤的研究报道。


技术实现要素：

4.本发明提供了一种新型肿瘤急性炎症诱导剂，可以在肿瘤局部释放细菌外膜囊泡，局部招募大量中性粒细胞，通过分泌弹性蛋白酶选择性杀伤肿瘤细胞，并释放大量细胞因子放大急性炎症反应，激活后续的非特异性和特异性抗肿瘤免疫；细菌外膜囊泡诱发肿瘤血管破裂和红细胞外渗并凝血，导致肿瘤外观变黑，联合光热疗法进一步根除实体瘤并预防肿瘤转移。
5.在阐述本发明的技术方案之前，定义本文中所使用的缩写如下：
6.缩写“omvs”全称为：细菌外膜囊泡。
7.缩写“blank gel”全称为：空白的温度敏感型水凝胶。
8.缩写“omvs-gel”全称为：新型肿瘤局部急性炎症诱导剂，即载细菌外膜囊泡的温度敏感型水凝胶。
9.为了解决上述技术问题，本发明的目的之一是提供一种肿瘤局部急性炎症诱导剂的制备方法，包括细菌外膜囊泡和温度敏感型水凝胶制备而成；所述的细菌外膜囊泡由大肠埃希菌dh5α分泌。
10.所述的制备方法，每1000μl的温度敏感型水凝胶中含有细菌外膜囊泡10
9-10
12
个。进一步优选为：10
10
个粒子/ml。
11.所述的制备方法，所述的细菌外膜囊泡的制备过程为：培养大肠埃希菌dh5α16-24小时后，将细菌培养液在10000g下离心10-20分钟，弃去沉淀，0.22μm滤膜过滤上清液，滤液
后在150000g-200000g下离心4-6小时，弃去上清，使用pbs洗涤沉淀，再次在150000g-200000g下离心4-6小时，弃去上清，沉淀即为纯化的大肠埃希菌dh5α细菌外膜囊泡。
12.所述的制备方法，所述的温度敏感型水凝胶由pluronicf-127和海藻酸钠组成。
13.所述的制备方法，所述的温度敏感型水凝胶是将15-20wt％的pluronic f-127和1-2wt％的海藻酸钠和余量的纯水在4-10℃下搅拌混匀溶解即得。
14.构成温度敏感型水凝胶的材料pluronicf-127和海藻酸钠的质量分数比例包括：25:2，20:2，18:2，15:2，25:1，20:1，18:1，15:1，进一步优选为：20:1。
15.所述的制备方法，取细菌外膜囊泡加入温度敏感型水凝胶，将二者混匀、孵育、静置去除气泡；则得。
16.优选细菌外膜囊泡和温度敏感型水凝胶混匀、孵育，静置至少12小时，全程处于4-10℃低温环境中。
17.本发明所述的制备方法，优选具体包括以下步骤：
18.(a)培养大肠埃希菌dh5α，通过差速超高速离心方法提取纯化细菌培养液中的omvs，并通过动态光散射仪测定其粒径和浓度，通过透射电子显微镜观察其微观形态、凝胶电泳分析其蛋白组成，于-80℃长期保存备用。
19.结果表明，提取纯化的omvs平均粒径为101.2
±
2.2nm，粒子浓度为1.49
×
10
11
个粒子/ml，透射电镜显示其具有球形囊泡结构，可见明显的脂质双分子层。总蛋白在17kda、35kda、60kda等处有明显的条带分布。
20.(b)温度敏感型水凝胶由pluronicf-127(wt％20％)和海藻酸钠(wt％1％)在4℃下，于纯水中搅拌混匀12小时形成。通过扫描电子显微镜观察其微观形态，倒置试管法检测其成胶温度和成胶时间，transwell板法绘制其药物缓释曲线。结果表明，该温度敏感型水凝胶的成胶温度为18
±
1℃，成胶时间为39s
±
2s，扫描电镜结果显示其微观结构为多孔的网状结构，在体外72小时内逐步释放药物。
21.(c)将(a)中提取纯化得到的与(b)中gel在4℃下混匀、孵育并静置去除气泡，omvs浓度调整至10
10
个粒子/ml，即得到所述新型肿瘤局部急性炎症诱导剂，于4℃保存备用。
22.本发明的第二个目的是提供制备得到的肿瘤局部急性炎症诱导剂。
23.本发明omvs-gel，包括：由大肠埃希菌dh5α分泌的omvs，由pluronicf-127、海藻酸钠和余量的水组成的温度敏感型水凝胶。omvs的平均粒径为101.2
±
2.2nm，温度敏感型水凝胶的成胶温度为18
±
1℃，成胶时间39
±
2s。
24.本发明的第三个目的是提供所述的肿瘤局部急性炎症诱导剂的一种应用，用于制备诱导肿瘤部位急性炎症，进一步招募中性粒细胞分泌弹性蛋白酶，选择性杀灭肿瘤细胞，并分泌大量促炎因子放大急性炎症，诱发特异性抗肿瘤免疫，治疗原发肿瘤并防止其转移的制剂，尤其是用于制备临床常见实体瘤的原位注射治疗的制剂或者抑制原发性肿瘤的肺转移的制剂。
25.本发明的第四个目的是提供所述的肿瘤局部急性炎症诱导剂的另外一种应用，用于制备诱发肿瘤血管破裂和红细胞外渗，导致肿瘤外观变黑的制剂，进一步制备用于联合光热疗法治疗临床实体瘤的制剂。
26.进一步地，所述的实体瘤包括：乳腺癌、黑色素瘤、结直肠癌。
27.本发明选择了温度敏感型水凝胶在体温下转换为凝胶态，从而使细菌外膜囊泡滞
留在肿瘤内部诱发急性炎症，而不会发生全身性细胞因子风暴。此外，还考察了omvs-gel的瘤内分布和降解性，具体步骤如下：
28.本发明验证了该新型肿瘤局部急性炎症诱导剂对实体瘤的急性炎症诱导作用和潜在机制：以三阴性乳腺癌为例。具体步骤如下：
29.建立balb/c小鼠三阴性乳腺癌原位模型，在肿瘤体积生长至200mm3时，瘤内注射dir标记的omvs-gel，分别在24、48、72、96小时使用小动物活体成像系统记录荧光强度，发现omvs-gel长期滞留在肿瘤内部，omvs-gel的瘤内滞留和缓释效应良好。
30.同时，建立balb/c小鼠三阴性乳腺癌原位模型，在肿瘤体积生长至200mm3时，在瘤内注射载omvs的温度敏感型水凝胶，24小时后处死部分小鼠，将肿瘤组织进行包埋、切片、染色以及瘤内炎性因子分析，发现有大量中性粒细胞浸润，明显的弹性蛋白酶分泌和炎性因子水平上调；并且在24小时后小鼠体表观察到肿瘤变软，表面变黑，48小时后结痂，7～14天脱落，肿瘤消失。
31.本发明的优点在于：本发明中使用的dh5a-omvs具有多重抗肿瘤机制，自身可作为外源性免疫激活剂激活肿瘤急性炎症，触发抗肿瘤免疫，招募中性粒细胞至肿瘤部位，分泌弹性蛋白酶选择性杀伤肿瘤细胞，并释放大量细胞因子放大急性炎症，并激活特异性抗肿瘤免疫；同时引起肿瘤血管破裂，外观变黑，结合光热疗法根除肿瘤，预防转移；本发明使用的温度敏感型水凝胶具有良好的瘤内滞留和降解能力，能将急性炎症限制在肿瘤内部，极大地提高了生物安全性，拓展了细菌外膜囊泡的应用场景。本发明在抗肿瘤免疫疗法方面具有巨大的转化价值和应用前景。
附图说明
32.图1：本发明实施例1、2中omvs、blankgel、omvs-gel的表征结果图；
33.图2：本发明实施例3中omvs-gel的瘤内滞留性能图；
34.图3：本发明实施例4和5中omvs-gel增强的体内安全性和诱导肿瘤血管破裂作用的评价结果图；
35.图4：本发明实施例6中omvs-gel联合光热疗法的可行性验证结果图；
36.图5：omvs-gel引发肿瘤急性炎症后的中性粒细胞浸润图；
37.图6：omvs-gel引发肿瘤急性炎症后的瘤内弹性蛋白酶和促炎因子水平；
38.图7：omvs-gel引发肿瘤急性炎症后激活特异性抗肿瘤免疫的评价结果；
39.图8：omvs-gel联合光热疗法对4t1乳腺肿瘤的抗肿瘤药效统计结果，为本发明实施例的实验结果；
40.图9：omvs-gel联合光热疗法对4t1乳腺肿瘤的抗肿瘤药效的照片记录；
41.图10：omvs-gel联合光热疗法对b16f10黑色素瘤和ct26结直肠肿瘤的抗肿瘤药效统计结果；
42.图11：omvs-gel联合光热疗法对b16f10黑色素瘤的抗肿瘤药效的照片记录；
43.图12：omvs-gel联合光热疗法对ct26结直肠肿瘤的抗肿瘤药效的照片记录；
44.图13：omvs-gel联合光热疗法抑制4t1乳腺肿瘤的肺转移评价结果。
具体实施方式
45.以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
46.为更为确切地描述本发明的目的、特征和作用，下面结合较佳的实例进一步说明本发明，但是，这些实施例仅用于更详细具体地说明，但本发明的保护范围并不限于下列具体实施例。
47.本发明附图所示的结构、比例、大小等，均仅配合发明内容供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非限定本发明的条件。任何比例关系的改变或大小的调整、修饰的选择，在不影响本发明主要功能及目的的情况下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容所能涵盖的范围内。同时，本发明中所引用的关系词，仅为便于叙述，并非限定本发明的实施范围，其顺序和相对关系的调整，在技术层面无实质变更的情况下，亦属于本发明的范畴。
48.本部分所称的“实施例”是指包含于本发明中的至少一个实现方式中的方法及所得特定结果的特征。本发明中不同地方出现的“实施例”并非同一个实施例，同时非互相排斥的实施例。
49.本部分对本发明中所使用到的材料以及实验方法进行一般性的描述。虽然本发明中所使用的许多材料和操作方法是领域内公知的，但本发明仍作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，如果未作特别说明，本发明在上下文中所用材料均为常规市售产品，操作方法是本领域公知的。
50.实施例中使用的试剂和仪器如下：
51.大肠杆菌dh5α购于北纳生物，lb肉汤培养基购于杭州微生物，bca蛋白试剂盒、sds-page凝胶制备试剂盒购于博士德生物，考马斯亮蓝购于索莱宝生物，甲醇、冰醋酸、磷钨酸购于国药集团，pluronic f-127购于西格玛公司，海藻酸钠购于阿拉丁公司，dir染料购自上海昱圣生物。
52.生物安全柜购自力康公司，生化培养箱购自上海跃进公司，低温超速离心机购自贝克曼公司，纳米粒径跟踪分析仪ns300购自马尔文公司，小动物活体成像购自赛默飞公司，扫描电子显微镜购自捷克fei公司，透射电子显微镜购于日立公司，酶标仪购自瑞士帝肯。
53.具体步骤如下：
54.实施例1
55.本实施例用于大肠杆菌dh5α-omvs的提取纯化和表征。
56.(1)omvs的提取纯化：将保存于-80℃的大肠埃希菌dh5α甘油菌复苏后接种至哥伦比亚血琼脂培养板，在37℃生化培养箱中培养24小时，传代2次后，用一次性接种环挑取1个单克隆菌落接种到20ml的lb肉汤培养基中，37℃生化培养箱中过夜培养12小时，再用lb肉汤培养基以1：100稀释，转移到500ml灭菌锥形瓶中，37℃生化培养箱继续培养24小时。当用酶标仪检测到细菌培养液的od
600
为1时，即可用来提取omvs。将od
600
值为1的dh5a的菌液800ml收集后，分装至50ml高速圆底离心管中，以10,000g在4℃下离心10分钟，除去绝大部分细菌碎片；用0.22μm滤膜过滤离心后的上清液，除去残留细菌；再将收集到的滤液经100kda滤膜超滤浓缩，除去大部分非omvs蛋白质组分并浓缩体积。最后将浓缩得到的滤液以150000g在4℃下超高速离心4小时，弃去上清液，用pbs重悬omvs，再次于150000g在4℃下超高速离心4小时，pbs溶解沉淀即得纯化omvs，置于-80℃冰箱中保存备用。
57.(2)omvs的粒径、浓度经粒子跟踪分析仪nta测定，电势经动态光散射仪(dls)确定，形态经透射电子显微镜表征，蛋白表达情况经凝胶电泳表征。
58.在粒径分布图中(图1a)，显示omvs粒径为101.2
±
2.2nm，浓度为1.49
×
10
11
个粒子/ml(图中结果为稀释100倍后测定)，电势为-30.25
±
0.85mv(图1a)，透射电镜结果显示omvs为具有脂质双分子层的球状结构(图1b)，凝胶电泳结果显示omvs的蛋白表达在17kda，35kda，60kda附近有明显条带分布(图1c)。
59.实施例2
60.本实施例用于说明本发明中空白温度敏感型水凝胶和肿瘤局部急性炎症诱导剂的制备。
61.(1)空白温度敏感型水凝胶(blank gel)的制备：准确称取2g pluronicf-127粉末和200mg海藻酸钠粉末，置于洁净烧杯中，加入16ml，用1000μl一次性tip头充分润湿粉末。在4℃下充分搅拌4小时至粉末完全溶解，无肉眼可见团块，置于4℃下至少12小时，待气泡完全去除。在超净工作台冰浴下，使用0.22μm滤膜过滤上述液体，去除细菌，置于15ml离心管中，封口备用。
62.(2)肿瘤局部急性炎症诱导剂omvs-gel的制备：按实施例1中所述方法提取纯化omvs，得到omvs母液；用pbs调整omvs母液的浓度为1
×
10
11
个粒子/ml作为omvs工作液。在超净工作台中，准确量取100μlomvs工作液和900μl空白温度敏感型水凝胶，在冰浴条件下，将100μlomvs工作液先置于10ml无菌ep管中，再加入900μl温度敏感型水凝胶，混匀、共孵育2小时，再静置至少12小时去除气泡，即得omvs-sol(4℃)，在37℃转变为omvs-gel。用扫描电子显微镜观察blankgel和omvs-gel的微观形态，倒置试管法测定二者成胶温度(lcst)和成胶时间。omvs-gel中omvs的累计释放用transwell板法测定。
63.制备完成的肿瘤局部急性炎症诱导剂在4℃条件下为透明澄清溶液(omvs-sol)，37℃条件下为透明澄清凝胶(omvs-gel)(图1d)。倒置试管法测得blank gel成胶温度为18
±
1℃，成胶时间39
±
2s；omvs-gel成胶温度为18
±
1℃，成胶时间为38
±
1s(图1e)。扫描电镜结果显示制备的blankgel和omvs-gel微观结构为多孔网状结构(图1f)。药物缓释曲线显示72小时内omvs-gel基本将omvs释放完毕(图1g)。
64.实施例3
65.本实施例用于说明本发明omvs-gel的瘤内滞留性能。
66.(1)将10μl膜染料dir(1mg/ml)与实施例3中所述omvs工作液(10
10
个粒子/ml)1000μl在避光条件下共孵育30分钟，在2500g下用100kda超滤管离心10分钟，去除未结合的游离dir，得到dir标记的游离omvs(dir-omvs)，置于4℃保存备用。用此dir-omvs制备上述omvs-gel，得到载dir标记的omvs的温度敏感型水凝胶。
67.(2)以4t1乳腺癌细胞系构建原位移植瘤模型：balb/c小鼠(
♀
，6周龄)在左侧乳腺脂肪垫下注射2
×
105个4t1细胞；待肿瘤体积生长至150mm3后，随机分为2组：对照组(dir-omvs组)和载dir标记的omvs的温度敏感型水凝胶组(dir-omvs-gel组)。瘤内注射不同制剂各100μl(omvs浓度为10
10
个粒子/ml)后，经小动物活体成像系统观测0，24，48，72，96小时的荧光分布。
68.成像结果显示，dir-omvs-gel在瘤内的滞留效果最强，降解最慢，约为4天；dir-omvs则在一天之内降解完毕，4天后在肿瘤部位没有荧光分布(图2a-e)。但观察到肿瘤引流
淋巴结有荧光信号(图2f-g)，说明有omvs会进入肿瘤引流淋巴结，刺激后续免疫反应。且dir-omvs-gel组在肝脏无荧光分布，证明了其安全性。
69.实施例4
70.本实施例用于说明omvs-gel增强了omvs的体内安全性。
71.(1)构建实施例3中4t1乳腺肿瘤原位荷瘤小鼠模型，待肿瘤生长至150mm3后，随机分为4组，每组6只：对照组(pbs组)，游离omvs溶液尾静脉注射组(freeomvsi.v.组)，omvs溶液瘤内注射组(freeomvsi.t.组)和omvs-gel瘤内注射实验组(omvs-geli.t.组)。在瘤内注射不同制剂(omvs浓度均为10
10
个粒子/ml)，给药后24小时内统计所有小鼠体温变化和死亡率，24小时后每组处死3只小鼠，取血清进行促炎因子水平分析(il-6、tnf-α)；72小时后处死每组剩余小鼠，取出主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)，4％多聚甲醛、切片、石蜡包埋并进行h&e染色。
72.死亡率统计结果显示，omvs溶液经尾静脉注射后毒性最大，该组小鼠体温剧烈变化，12小时后全部死亡；瘤内注射游离omvs组次之；omvs-gel毒性最低，小鼠无死亡，且体温无明显变化(图3a-b)。切片染色结果显示主要脏器无病变(图3c)；血清炎性因子水平分析表明，经尾静脉注射后的小鼠体内炎性因子水平最高，omvs-gel组最低(图3d)，结合死亡率统计结果，可证明omvs-gel极大提高了生物安全性。
73.实施例5
74.本实施例用于说明本发明omvs-gel诱发肿瘤血管破裂的能力。
75.构建实施例3中的4t1乳腺癌原位荷瘤小鼠模型，待肿瘤体积生长至150mm3后，随机分为2组：对照组(pbs组)，实验组(omvs-gel组)。瘤内注射不同制剂各100μl(omvs浓度为10
10
个粒子/ml)后，在0、12、24小时分别拍照观察肿瘤外观颜色变化，并于24小时后处死小鼠，取出肿瘤，用4％多聚甲醛固定后，石蜡包埋、切片，使用cd31抗体进行免疫荧光染色，观察血管完整性情况。
76.结果显示，实验组比对照组发生明显的肿瘤外观变黑(图3e)；切片染色结果显示实验组肿瘤血管完整性受到明显破坏(图3f)，证明了omvs可引起肿瘤血管破裂。由此引发的肿瘤外观变黑可联合光热疗法进一步治疗肿瘤。
77.实施例6
78.本实施例用于说明本发明omvs-gel联合光热疗法的可行性。
79.(1)构建实施例3中4t1乳腺肿瘤原位荷瘤小鼠模型，待肿瘤生长至150mm3后，随机分为2组，每组6只小鼠：对照组(pbs+nir
808
组)，实验组(omvs-gel+nir
808
组)。瘤内注射不同制剂各100μl(omvs浓度为10
10
个粒子/ml)，24小时后肿瘤外观变黑，此时施加808nm近红外光照射5分钟(功率0.8w/cm2)，使用红外成像仪每分钟监测一次肿瘤表面温度，并进行统计分析。
80.结果显示，与对照组相比，omvs-gel+nir
808
组的小鼠肿瘤表面温度随时间可逐渐升高至55℃，达到有效肿瘤杀伤温度(图4a，4b)；且升温区域集中在肿瘤变黑部位，对周边正常组织无损伤(图4a)。
81.实施例7
82.本实施例用于说明本发明omvs-gel对肿瘤的急性炎症诱导效果和抗肿瘤机制。应特别指出，本实施例中以4t1乳腺癌、b16f10黑色素瘤、ct26结直肠肿瘤为模型，但本发明对
其他实体瘤，均具有显著的抑瘤作用。
83.(1)构建实施例3中4t1乳腺肿瘤原位荷瘤小鼠模型，待肿瘤生长至150mm3后，随机分为2组，每组6只：对照组(pbs组)、实验组(omvs-gel组)。实验组瘤内注射实施例2制备的omvs-gel 100μl(omvs浓度为10
10
个粒子/ml)，对照组给予等体积pbs(100μl)，只给药一次。
84.(2)24小时后每组处死3只小鼠，取肿瘤进行4％多聚甲醛、包埋、切片、h&e染色，中性粒细胞弹性蛋白酶elane和组蛋白h1.0的免疫组化染色；以及对瘤内炎性因子水平(il-1β，il-6，tnf-α，ifn-γ，il-12p70，il-17a)和趋化因子水平(cxcl1，ccl2)进行测定。72小时后处死每组剩余小鼠，取出小鼠脾脏和肿瘤引流淋巴结，制备成单细胞悬液后使用流式细胞术进行dc细胞(cd80
+
cd86
+
)和t细胞(cd3
+
cd8
+
)表型分析。
85.h&e染色结果显示，在瘤内注射omvs-gel 24小时后，可观察到大量的中性粒细胞浸润，可观察到明显的肿瘤细胞死亡(图5)；免疫组化染色结果表明，肿瘤微环境中存在大量弹性蛋白酶elane和组蛋白h1.0(图6a)；瘤内炎性因子水平分析证明，在注射了omvs-gel后，肿瘤内发生了显著的急性炎症反应，促炎因子和趋化因子水平显著升高(图6b)；脾脏、肿瘤引流淋巴结中的dc细胞和t细胞成熟比例在omvs-gel组中最高，证实了后续的特异性抗肿瘤免疫已被激活。可观察到经omvs-gel处理后，脾脏和肿瘤引流淋巴结的dc细胞比例与对照组相比分别提高了24％和20％(图7a，7b)，t细胞比例提高了35％(图7c)。
86.实施例8
87.本实施例用于说明本发明omvs-gel联合光热治疗瘤药效。应特别指出，本实施例中以4t1乳腺癌肿瘤、b16f10黑色素瘤、ct26结直肠肿瘤为模型，但本发明对其他实体瘤，均具有显著的抑瘤作用。
88.(1)构建实施例3中4t1乳腺肿瘤原位荷瘤小鼠模型，并使用4t1-luc细胞构建另一批生物发光小鼠原位肿瘤模型，使用b16f10细胞(用于c57bl6j小鼠)、ct26细胞(用于balb/c小鼠)构建皮下瘤模型。待肿瘤体积生长至150mm3，所有肿瘤模型随机分为5组：对照组(pbs组)、空白温度敏感型水凝胶组(blankgel组)、单一光热治疗组(blank gel+nir
808
组)，omvs-gel组、光热治疗联用组(omvs-gel+nir
808
组)。瘤内注射100μl相应制剂，24小时后分别对单一光热治疗组和光热治疗联用组施予808nm近红外光照射肿瘤部位5分钟(功率0.8w/cm2)。
89.(2)给药后使用小动物活体成像系统监测4t1-luc肿瘤生长情况(生物发光)，测量其他肿瘤体积变化，统计各组肿瘤体积变化，14天后处死小鼠，取出肿瘤进行4％多聚甲醛、石蜡包埋、切片、h&e染色、tunel染色、ki67染色，取出肺组织进行4％多聚甲醛、石蜡包埋、切片、h&e染色观察omvs-gel对4t1肿瘤肺转移的抑制作用。
90.药效结果显示，不同模型的omvs-gel组和omvs-gel+nir
808
组小鼠的肿瘤生长受到了明显抑制。在4t1肿瘤原位模型中，按照图8a的给药方案，不论是带荧光基因的肿瘤细胞还是正常肿瘤细胞模型，给药后14天内肿瘤体积迅速减小(图8b，图9)，而对照组的体积则持续增大(图8c，8d)，处死小鼠取出的肿瘤体积显著减小，肿瘤生长被明显抑制甚至完全消除(图8e，8f)；治疗后小鼠的体重无明显变化(图8g)，生存期显著延长(图8h)。每组小鼠的肿瘤体积变化和肿瘤治疗后切片染色都显示omvs-gel强大的疗效(图8i，8j)。omvs引起肿瘤表面变黑后联用光热疗法，使omvs-gel消除肿瘤的能力进一步提高。在黑色素瘤和结直肠肿瘤模型中，按照图10a方案给药，发现小鼠的肿瘤体积(图10b，10c)、重量(图10d，10e)
变化趋势均与4t1模型一致，显著降低；小鼠生存期明显延长(图10f，10g)；并且肿瘤外表同样变黑(图11，12)。此外，omvs-gel引起的免疫反应可以抑制原发性肿瘤的肺转移(图13)。以上结果有力证明了omvs-gel通过诱导肿瘤局部的急性炎症，能有效根除原位实体肿瘤。
91.尽管本发明中对实施例进行了一定程度的描述，但在不脱离本发明的精神和范围的条件下，实施例中的各个条件和参数可适当变化。可以理解，本发明不限于实施例所述实施方案和测试条件，而归于权利要求的范围，包括所述每个因素或参数的替换。

技术特征：
1.一种肿瘤局部急性炎症诱导剂的制备方法，其特征在于，包括细菌外膜囊泡和温度敏感型水凝胶制备而成；所述的细菌外膜囊泡由大肠埃希菌dh5α分泌。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，每1000μl的温度敏感型水凝胶中含有细菌外膜囊泡10
9-10
12
个。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的细菌外膜囊泡的制备过程为：培养大肠埃希菌dh5α16-24小时后，将细菌培养液在10000g下离心10-20分钟，弃去沉淀，0.22μm滤膜过滤上清液，滤液后在150000g-200000g下离心4-6小时，弃去上清，使用pbs洗涤沉淀，再次在150000g-200000g下离心4-6小时，弃去上清，沉淀即为纯化的大肠埃希菌dh5α细菌外膜囊泡。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的温度敏感型水凝胶由pluronicf-127和海藻酸钠组成。5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的温度敏感型水凝胶是将15-20wt％的pluronic f-127和1-2wt％的海藻酸钠和余量的纯水在4-10℃下搅拌混匀溶解即得。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，取细菌外膜囊泡加入温度敏感型水凝胶，将二者混匀、孵育、静置去除气泡，则得；优选细菌外膜囊泡和温度敏感型水凝胶混匀、孵育，静置至少12小时，全程处于4-10℃低温环境中。7.权利要求1-6任一项所述的方法制备得到的肿瘤局部急性炎症诱导剂。8.权利要求7所述的肿瘤局部急性炎症诱导剂的应用，其特征在于，用于制备诱导肿瘤部位急性炎症，进一步招募中性粒细胞分泌弹性蛋白酶，选择性杀灭肿瘤细胞，并分泌大量促炎因子放大急性炎症，诱发特异性抗肿瘤免疫，治疗原发肿瘤并防止其转移的制剂，尤其是制备用于临床常见实体瘤的原位注射治疗的制剂或者抑制原发性肿瘤的肺转移的制剂。9.权利要求7所述的肿瘤局部急性炎症诱导剂的应用，其特征在于，用于制备诱发肿瘤血管破裂和红细胞外渗，导致肿瘤外观变黑的制剂，进一步用于制备联合光热疗法治疗临床实体瘤的制剂。10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的实体瘤包括：乳腺癌、黑色素瘤、结直肠癌。

技术总结
本发明属于生物医药技术领域，公开了一种肿瘤局部急性炎症诱导剂及其制备方法和应用。具体为将提取的细菌外膜囊泡包载入制备好的温度敏感型水凝胶中，用于原位注射治疗临床常见实体瘤，如乳腺癌，黑色素瘤，结直肠癌等。本发明构建的载细菌外膜囊泡温度敏感型水凝胶诱导肿瘤部位的急性炎症，有效激活抗肿瘤免疫，改善免疫抑制微环境；同时引起肿瘤血管破裂，可联合光热治疗进一步根除肿瘤；并且，温度敏感型水凝胶将急性炎症限制在肿瘤内部，提高了生物安全性，为肿瘤原位治疗制剂的开发提供了新的策略。了新的策略。了新的策略。


技术研发人员：向大雄 徐文杰 吴军勇 李泳江 郝欣岩 胡雄彬 邱晓涵
受保护的技术使用者：中南大学湘雅二医院
技术研发日：2023.07.19
技术公布日：2023/9/22