用于猪圆环病毒II型、Ⅲ型检测的试剂盒及其应用的制作方法

用于猪圆环病毒ii型、ⅲ型检测的试剂盒及其应用
技术领域
1.本发明属于生物医药领域，特别涉及一种用于猪圆环病毒ii型、ⅲ型检测的试剂盒及其应用。


背景技术：

2.猪圆环病毒(porcine circovirus,缩写:pcv)是二十面体对称、无囊膜、单股环状dna病毒。病毒粒子直径为17nm，是目前发现的最小的动物病毒。圆环病毒目前分为四种血清型，分别是pcv1,pcv2,pcv3,pcv4，其中pcv1最早在德国被发现，其广泛存在于猪细胞当中，可使血清产生抗体但是不致病；pcv2对猪极为易感，是导致断奶仔猪多系统衰竭综合征的主要病原；pcv3是在2016年发现的，可导致母猪繁殖障碍与猪皮炎肾病综合征；pcv4是2019年发现的新的病原，感染猪表现为呼吸道和消化道症状。目前，pcv2和pcv3己在世界范围内广泛分布和流行，pcv2在澳大利亚、新西兰和非洲等地均有发现，在国内大部分地区广泛流行；pcv3基本上存在于包括北美、南美洲和欧洲在内的所有主要生猪产区，且得到了证实。
3.pcv2或pcv3通常与其他病原体形成混合感染和多重感染，加剧疾病的严重性，使养猪业产生难以估量的损失。ku等人检测的临床样本中pcv2阳性率为62.2％,pcv3阳性率为34.7％,pcv2和pcv3混合感染阳性率为15.8％(35/222)，zhang等报道根据nano-dpcr检测结果显示，pcv2阳性率为14.7％,pcv3阳性率为16.6％,pcv2和pcv3混合感染阳性率为6.8％。在pcv4样品中存在prrsv和pcv2(其他未检测到的病毒或细菌病原体)混合感染。田润博等对河南省和山西省63份样品进行pcv病原学检测，结果显示，只有1份样本单独感染了pcv4，而11份同时感染了pcv3和pcv4的样本也对pcv2呈阳性，这表明pcv4可能对pcv2的发病机理具有协同作用；2份pcv4阳性样品与pcv2,pcv3,prv和pedv混合感染。孙文超等人对2015年-2019年间从中国广西省采集的257份临床样品进行pcv检测，其中9份(69.2％)pcv4阳性样本与pcv2或pcv3混合感染，1份pcv4阳性样本与pcv2,pcv3混合感染。
4.目前oie推荐的had、elisa、ifa等血清学检测方法，耗时长，操作复杂，不适用与猪圆环病毒ii型、ⅲ型的快速检测。猪圆环病毒ii型、ⅲ型双重荧光pcr快速检测具有操作简单、快速方便、灵敏度高、特异性高、污染率低的优点，被广泛应用于基因检测领域，但是，如何通过引物的设计，提高检测的灵敏度和特异性，仍然是本领域技术人员亟待解决的技术问题。


技术实现要素：

5.本发明目的在于克服现有技术检测猪圆环病毒ii型、ⅲ型方法存在的灵敏度低、特异性差、操作繁琐、检测成本高、花费时间长等问题，本发明提供了一种用于检测猪圆环病毒ii型、ⅲ型的试剂盒及其应用，包括检测猪圆环病毒ii型、ⅲ型选择capsid protein基因组序列的特异性pcr引物对和taqman探针。为了实现本发明的目的，本发明提供技术方案如下：
6.本发明提供的用于检测猪圆环病毒ii型、ⅲ型的引物对和探针及其应用，其特征在于：根据pcvii和pcvⅲ的保守基因，同时经过软件对基因同源序列进行对比分析，进一步确定了pcv2和pcv3基因的保守区，包括检测猪圆环病毒ii型选择capsid protein基因组序列的pcr引物对和taqman探针，capsid protein基因组序列的pcr引物对pcv ii-f和pcv ii-r分别为seq id no.1和seq id no.2所示的核苷酸序列，taqman探针pcv ii-p为seq id no.3所示的核苷酸序列，分别用fam和mgb标记5’端和3’端；猪圆环病毒ⅲ型选择capsid protein基因组序列的pcr引物对和taqman探针，capsid protein基因组序列的pcr引物对pcv
ⅲ‑
f和pcv
ⅲ‑
r分别为seq id no.4和seq id no.5所示的核苷酸序列，taqman探针pcv
ⅲ‑
p为seq id no.6所示的核苷酸序列，分别用hex和mgb标记5’端和3’端；
7.pcv ii-f:5
’‑
ttgtacatacatggttacacggat-3’；seq id no.1pcv ii-r:5
’‑
tgctggaaatgtagaccacgt-3’；seq id no.2pcv ii-p:5
’‑
fam-ctgttttcgaacgcagtgccg-3
’‑
mgb；seq idno.3
8.pcv
ⅲ‑
f:5
’‑
tgaaagttacactcagccctgt-3’；seq id no.4pcv
ⅲ‑
r:5
’‑
gtcttggagccaagtgtttg-3’；seq id no.5pcv
ⅲ‑
p:5
’‑
hex-aactatgttcgggcacacagccatag-3
’‑
mgb；seq id no.6
9.(2)本发明还提供了用于检测猪圆环病毒ii型、ⅲ型的引物对和探针及其应用，其特征在于：各组分含量分别为：
[0010][0011]
所述pcr混合液:2
×
aceq universal u probe master mix终浓度为1
×
、depc水；
[0012]
所述引物探针：pcr引物对的pcv ii-f、pcv ii-r的终浓度均为150nm，pcr引物对的pcv
ⅲ‑
f、pcv
ⅲ‑
r的终浓度均为200nm；pcr探针pcv ii-p对应的taqman探针终浓度为100nm，pcr探针pcv
ⅲ‑
p对应的taqman探针终浓度为200nm；
[0013]
所述阳性对照是通过构建puc57-capsid protein载体，对capsid protein基因进行序列测定；测序结果正确的菌株扩大培养，提取质粒，得到的质粒为阳性对照，阳性对照终浓度为1.0e+006cp/μl；
[0014]
所述阴性对照为depc水。
[0015]
(3)本发明还提供了用于检测猪圆环病毒ii型、ⅲ型的引物对和探针及其应用，包括以下步骤:
[0016]
用于检测猪圆环病毒ii型、ⅲ型的引物对和探针及其应用，包括以下步骤：
[0017]
核酸的提取：提取待测样本的核酸。
[0018]
反应组分配制：
[0019][0020]
按照上述比例提前将pcr混合液及引物探针分装于八连管中，并且用石蜡进行封存，最终形成预分装试剂给予用户，直接加5μl样品待检。
[0021]
扩增：分别将预分装试剂八连管加入提取的样本核酸放置荧光定量pcr仪中进行扩增，反应条件为：37℃ung酶处理2min，1个循环；95℃预变性1min，1个循环；95℃变性8s，60℃退火并延伸20s，40个扩增循环。
[0022]
(4)本发明还提供了用于检测猪圆环病毒ii型、ⅲ型的引物对和探针及其应用，其特征在于根据检测混合物的ct值定性判定，依据为：fam通道ct＞38且hex通道ct＞38时，待测样本中无检测猪圆环病毒ii型、ⅲ型；fam通道与hex通道为36≤ct≤38时，待测样本可疑，需重检一次，重检结果如ct＞38或无扩增曲线，则为待测样本中无检测猪圆环病毒ii型或者ⅲ型，反之则为待测样本中有检测猪圆环病毒ii型或者ⅲ型；仅fam通道ct﹤36时，待测样本中有检测猪圆环病毒ii型或者仅hex通道ct﹤36时，待测样本中有检测猪圆环病毒ⅲ型；fam通道ct﹤36且hex通道ct﹤36，待测样本中有检测猪圆环病毒ii型、ⅲ型(混合感染)。
[0023]
所述的检测猪圆环病毒ii型、ⅲ型的方法是：qpcr，该技术基于rt-real-time pcr平台，结合pcr突变富集技术。利用pcr引物对对猪圆环病毒ii型、ⅲ型capsid protein基因组序列进行pcr扩增，taqman探针对扩增产物进行特异性位点检测，在real-time pcr基础上鉴定。
[0024]
技术优势：
[0025]
①
相比于同类的试剂盒，本发明通过对引物的设计，能够显著提高灵敏度，因此，本发明的试剂盒具有特异性强、灵敏度高、扩增效率高、时间短速度快等优点。
[0026]
②
无需用户进行试剂分装，直接将提取后的样本核酸加入预分装的八联管中上荧光pcr仪中检测，操作简单快捷；
[0027]
③
同一管试剂可以检测区分猪圆环病毒ii型、ⅲ型亚型病原；
[0028]
④
检测过程为闭管反应，添加ung酶处理减少污染的可能性，操作简单快速；
[0029]
⑤
还具有安全性高，整个体系不包含有毒有害物质，无需pcr产物的开管，对试验人员以及环境都无危害。
附图说明
[0030]
图1为以含有检测猪圆环病毒ii型、ⅲ型capsid protein基因组的质粒为模板，猪圆环病毒ii型不同探针浓度qpcr检测结果图。
[0031]
图2为以含有检测猪圆环病毒ii型、ⅲ型capsid protein基因组的质粒为模板，猪圆环病毒ⅲ型不同探针浓度qpcr检测结果图。
[0032]
图3为以含有检测猪圆环病毒ii型、ⅲ型capsid protein基因组的质粒为模板，猪圆环病毒ii型不同引物对浓度qpcr检测结果图。
[0033]
图4为以含有检测猪圆环病毒ii型、ⅲ型capsid protein基因组的质粒为模板，猪圆环病毒ⅲ型不同引物对浓度qpcr检测结果图。
no.4和seq id no.5所示的核苷酸序列，其各自浓度分别为0.2、0.2mmol/μl；taqman探针pcv
ⅲ‑
p为seq id no.3所示的核苷酸序列并用hex和mgb标记5’端和3’端，其终浓度分别为0.2mmol/μl
[0053]
seq id no.1
[0054]
pcv ii-f:5
’‑
ttgtacatacatggttacacggat-3’(length 24)seq id no.2
[0055]
pcv ii-r:5
’‑
tgctggaaatgtagaccacgt-3’(length 21)
[0056]
seq id no.3
[0057]
pcvii-p:5
’‑
fam-ctgttttcgaacgcagtgccg-3
’‑
mgb(length21)
[0058]
seq id no.4
[0059]
pcv
ⅲ‑
f:5
’‑
tgaaagttacactcagccctgt-3’(length 22)seq id no.5
[0060]
pcv
ⅲ‑
r:5
’‑
gtcttggagccaagtgtttg-3’(length 20)seq id no.6
[0061]
pcv
ⅲ‑
p:5
’‑
hex-aactatgttcgggcacacagccatag-3
’‑
mgb；(length 26)
[0062]
3、阳性对照100μl
[0063]
阳性对照是通过构建puc57-capsid protein载体(猪圆环病毒ii型、ⅲ型在capsid protein基因中特异性序列)，分别对capsid protein基因进行序列测定；测序结果正确的菌株扩大培养，提取质粒，得到含猪圆环病毒ii型、ⅲ型在capsid protein基因中靶序列的质粒混合后为阳性对照，将制得的阳性对照为备用。阳性对照终浓度为1.0e+006cp/μl。
[0064]
4、阴性对照100μl
[0065]
阴性对照为depc水。
[0066]
5、反应体系：
[0067][0068]
5、反应条件：37℃ung酶处理2min，1个循环；95℃预变性1min，1个循环；95℃变性8s，60℃退火并延伸20s，40个扩增循环。
[0069]
实验例2
[0070]
以试剂盒内seq id no.1、no.2、no.3作为引物对和探针，以上面制备的阳性对照为模板进行qpcr，pcr反应中pcvii-p探针浓度分别为50nm、100nm、150nm、200nm，其余成分浓度相同(在20μl体系中各组分的终浓度分别为pcr混合液、150nm引物对(pcv ii-f、pcv ii-r)、0.1～10ng/μl的阳性对照品)。pcr反应条件为：37℃ung酶处理2min，1个循环；95℃预变性1min，1个循环；95℃变性8s，60℃退火并延伸30s，40个扩增循环。结果如图1所示，由图1可知，在pcvii-p探针浓度为50nm～200nm范围内均有扩增曲线，当pcvii-p探针浓度为100nm时其结果最佳。
[0071]
实施例3：
[0072]
以试剂盒内seq id no.1、no.2、no.3作为引物对和探针，以上面制备的阳性对照
为模板进行qpcr，pcr反应中引物对(pcv ii-f、pcv ii-r)浓度分别为100nm、150nm、200nm、250nm，其余成分浓度相同(在20μl体系中各组分的终浓度分别为pcr混合液、100nm pcvii-p探针、0.1～10ng/μl的阳性对照品)。pcr反应条件为：37℃ung酶处理2min，1个循环；95℃预变性1min，1个循环；95℃变性8s，60℃退火并延伸20s，40个扩增循环。结果如图2所示，由图3可知，在探针浓度为50nm～200nm范围内均有扩增曲线，当引物浓度为150nm时其结果最佳。
[0073]
实施例4
[0074]
以试剂盒内seq id no.4、no.5、no.6作为引物对和探针，以上面制备的阳性对照为模板进行qpcr，pcr反应中pcv
ⅲ‑
p探针浓度分别为100nm、150nm、200nm、250nm，其余成分浓度相同(在20μl体系中各组分的终浓度分别为pcr混合液、200nm引物、0.1～10ng/μl的阳性对照品)。pcr反应条件为：37℃ung酶处理2min，1个循环；95℃预变性1min，1个循环；95℃变性8s，60℃退火并延伸20s，40个扩增循环。结果如图3所示，由图3可知，在探针浓度为100nm～250nm范围内均有扩增曲线，当探针浓度为200nm时其结果最佳。
[0075]
实施例5
[0076]
以试剂盒内seq id no.4、no.5、no.6作为引物对和探针，以上面制备的阳性对照为模板进行qpcr，pcr反应中引物对(pcv
ⅲ‑
f、pcv
ⅲ‑
r)浓度分别为150nm、200nm、250nm、300nm，其余成分浓度相同(在20μl体系中各组分的终浓度分别为pcr混合液、200nm探针、0.1～10ng/μl的阳性对照品)。pcr反应条件为：37℃ung酶处理2min，1个循环；95℃预变性1min，1个循环；95℃变性8s，60℃退火并延伸20s，40个扩增循环。结果如图4所示，由图4可知，在引物对浓度为150nm～300nm范围内均有扩增曲线，当探针浓度为200nm时其结果最佳。
[0077]
实施例6
[0078]
以试剂盒内seq id no.1、no.2、no.3、no.4、no.5、no.6作为引物对和探针，以上面制备的阳性对照为模板进行qpcr，pcr反应中引物对的pcv ii-f、pcv ii-r的最佳终浓度均为150nm，pcv
ⅲ‑
f、pcv
ⅲ‑
r的最佳终浓度均为200nm；探针pcv ii-p对应的taqman探针最佳终浓度为100nm，探针pcv
ⅲ‑
p对应的taqman探针最佳终浓度为200nm，其余成分浓度相同(在20μl体系中各组分的终浓度分别为pcr混合液、0.1～10ng/μl的阳性对照品)。pcr反应条件为：37℃ung酶处理2min，1个循环；95℃预变性1min，1个循环；95℃变性8s，60℃退火并延伸20s，40个扩增循环。结果如图5所示，由图5可知，在引物对与探针最佳终浓度时，qpcr扩增曲线最佳。
[0079]
实施例7
[0080]
以试剂盒实际组分(pcr反应液16μl，引物探针4μl)进行提前预分装于八联管中，分装于八联管后用等体积石蜡(固体石蜡与液体石蜡进行混合控制熔点即可)进行封存，促使石蜡将pcr反应液及引物探针封在底部，结果如图6所示。将预分装试剂与普通装试剂进行对比实验，以上面制备的阳性对照及阴性对照为模板进行qpcr。结果如图7所示，预分装试剂与普通装试剂在未产生阴性污染的情况下扩增曲线及结果ct值基本无差异。
[0081]
实施例8
[0082]
以试剂盒内seq id no.1、no.2、no.3、no.4、no.5、no.6作为引物对和探针，使用预分装试剂进行扩增效率测试。以上面制备的标准质粒作为模板进行梯度稀释后进行qpcr，
稀释浓度分别1.0e+005cp/μl、1.0e+004cp/μl、1.0e+003cp/μl、1.0e+002cp/μl，使用这四个梯度做扩增斜率标准曲线。pcr反应条件为：37℃ung酶处理2min，1个循环；95℃预变性1min，1个循环；95℃变性8s，60℃退火并延伸20s，40个扩增循环。双重荧光pcr检测试剂盒pcvii、pcvⅲ扩增效率结果如下图8和图9所示。
[0083]
序号梯度稀释标准质粒pcviipcvⅲ11.0e+005cp/μl25.0025.3921.0e+004cp/μl28.3428.6431.0e+003cp/μl31.4631.8641.0e+002cp/μl34.7335.475neg004点扩增效率103.9％99.0％r21.0000.999
[0084]
实施例9
[0085]
以试剂盒内seq id no.1、no.2、no.3、no.4、no.5、no.6作为引物对和探针(实施例)，使用预分装试剂进行灵敏度测试。
[0086]
作为对照例，以seq id no.7、8、3、9、10、6作为引物对和探针，使用预分装试剂进行灵敏度测试。
[0087]
seq id no.7
[0088]
pcv ii-f:5
’‑
ttgtacatacatggttacacgga-3’(length 23)
[0089]
seq id no.8
[0090]
pcv ii-r:5
’‑
tgctggaaatgtagaccacg-3’(length 20)
[0091]
seq id no.3
[0092]
pcvii-p:5
’‑
fam-ctgttttcgaacgcagtgccg-3
’‑
mgb(length 21)
[0093]
seq id no.9
[0094]
pcv
ⅲ‑
f:5
’‑
tgaaagttacactcagccctgta-3’(length 23)
[0095]
seq id no.10
[0096]
pcv
ⅲ‑
r:5
’‑
gtcttggagccaagtgtttgt-3’(length 21)seq id no.6
[0097]
pcv
ⅲ‑
p:5
’‑
hex-aactatgttcgggcacacagccatag-3
’‑
mgb；(length 26)
[0098]
以上面制备的标准质粒作为模板进行梯度稀释后进行qpcr，稀释浓度分别1.0e+005cp/μl、1.0e+004cp/μl、1.0e+003cp/μl、1.0e+002cp/μl、1.0e+001cp/μl、1.0cp/μl。pcr反应条件为：37℃ung酶处理2min，1个循环；95℃预变性1min，1个循环；95℃变性8s，60℃退火并延伸20s，40个扩增循环。双重荧光pcr检测试剂盒pcv ii、pcvⅲ灵敏度检测结果如下表所示。检测结果表明，本发明实施例的检测试剂盒相比于对照例，对于pcv ii和pcv iii具有更高的检测灵敏度。需要说明的是，申请人还尝试了其它引物组合，其难以实现与本发明实施例相似的检测灵敏度。
[0099][0100]
实施例10
[0101]
以试剂盒内seq id no.1、no.2、no.3、no.4、no.5、no.6作为引物对和探针，使用预分装试剂进行特异性测试。将猪瘟病毒、口蹄疫病毒及猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒等rna病毒提取后进行反转录合成cdna，保存待用；将猪伪狂犬病毒核酸、猪圆环病毒ii型核酸及猪圆环病毒ⅲ型等dna病毒提取后保存待用。使用以上得到核酸作为模板进行qpcr。pcr反应条件为：37℃ung酶处理2min，1个循环；95℃预变性1min，1个循环；95℃变性8s，60℃退火并延伸20s，40个扩增循环。双重荧光pcr检测试剂盒pcv ii、pcvⅲ特异性扩增结果如图10所示。

技术特征：
1.用于检测猪圆环病毒ii型、ⅲ型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测猪圆环病毒ii型选择capsid protein基因组序列的pcr引物对和taqman探针，capsid protein基因组序列的pcr引物对pcv ii-f和pcv ii-r分别为seq id no.1和seq id no.2所示的核苷酸序列，taqman探针pcv ii-p为seq id no.3所示的核苷酸序列，分别用fam和mgb标记5’端和3’端；猪圆环病毒ⅲ型选择capsid protein基因组序列的pcr引物对和taqman探针，capsid protein基因组序列的pcr引物对pcv
ⅲ‑
f和pcv
ⅲ‑
r分别为seq id no.4和seq id no.5所示的核苷酸序列，taqman探针pcv
ⅲ‑
p为seq id no.6所示的核苷酸序列，分别用hex和mgb标记5’端和3’端；pcv ii-f:5
’‑
ttgtacatacatggttacacggat-3’；seq id no.1pcv ii-r:5
’‑
tgctggaaatgtagaccacgt-3’；seq id no.2pcv ii-p:5
’‑
fam-ctgttttcgaacgcagtgccg-3
’‑
mgb；seq id no.3pcv
ⅲ‑
f:5
’‑
tgaaagttacactcagccctgt-3’；seq id no.4pcv
ⅲ‑
r:5
’‑
gtcttggagccaagtgtttg-3’；seq id no.5pcv
ⅲ‑
p:5
’‑
hex-aactatgttcgggcacacagccatag-3
’‑
mgb；seq id no.6。2.根据权利要求1所述的用于检测猪圆环病毒ii型、ⅲ型的试剂盒，其特征在于，所述还包括pcr混合液。3.根据权利要求1所述的用于检测猪圆环病毒ii型、ⅲ型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：所述pcr混合液:2
×
aceq universal u probe master mix终浓度为1
×
、depc水；所述引物探针：pcr引物对的pcv ii-f、pcv ii-r的终浓度均为150nm，pcr引物对的pcv
ⅲ‑
f、pcv
ⅲ‑
r的终浓度均为200nm；pcr探针pcv ii-p对应的taqman探针终浓度为100nm，pcr探针pcv
ⅲ‑
p对应的taqman探针终浓度为200nm；所述阳性对照是通过构建puc57-capsid protein载体，对capsid protein基因进行序列测定；测序结果正确的菌株扩大培养，提取质粒，得到的质粒为阳性对照，阳性对照终浓度为1.0e+006cp/μl；所述阴性对照为depc水。4.根据权利要求1所述的用于检测猪圆环病毒ii型、ⅲ型的试剂盒，其特征在于，所述引物被预分装的八联管中，用石蜡进行封存。5.权利要求1-4任意一项所述的试剂盒在制备同时检测猪圆环病毒ii型、ⅲ型试剂中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，所述应用包括如下步骤：提取待测样本的核酸，提前将pcr混合液及引物探针分装于八连管中，并且用石蜡进行封存，最终形成预分装试剂给予用
户，直接加5μl样品待检；扩增：分别将配置好试剂的八连管放入荧光定量pcr仪中进行扩增，反应条件为：37℃ung酶处理2min，1个循环；95℃预变性1min，1个循环；95℃变性8s，60℃退火并延伸20s，40个扩增循环。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，根据检测混合物的ct值定性判定，依据为：fam通道ct＞38且hex通道ct＞38时，待测样本中无检测猪圆环病毒ii型、ⅲ型；fam通道与hex通道为36≤ct≤38时，待测样本可疑，需重检一次，重检结果如ct＞38或无扩增曲线，则为待测样本中无检测猪圆环病毒ii型或者ⅲ型，反之则为待测样本中有检测猪圆环病毒ii型或者ⅲ型；仅fam通道ct﹤36时，待测样本中有检测猪圆环病毒ii型或者仅hex通道ct﹤36时，待测样本中有检测猪圆环病毒ⅲ型；fam通道ct﹤36且hex通道ct﹤36，待测样本中有检测猪圆环病毒ii型、ⅲ型。

技术总结
本发明提供了一种用于检测猪圆环病毒II型、Ⅲ型的试剂盒及其应用，所述试剂盒包括检测猪圆环病毒II型、Ⅲ型选择capsid protein基因组序列的特异性PCR引物对和TaqMan探针。本发明的试剂盒检测灵敏度高、特异性好、操作简单能够很好的适用于临床的快速检测，具有较好的市场应用前景。的市场应用前景。的市场应用前景。


技术研发人员：张军 陈最鹏 徐增松
受保护的技术使用者：宿迁研祈生物科技有限公司
技术研发日：2023.07.19
技术公布日：2023/9/22