一组用于预测卵巢浆液性囊腺癌预后的微生物标志物及其应用

1.本发明涉及领域医学肿瘤领域，具体是一组用于预测卵巢浆液性囊腺癌预后的微生物标志物及其应用。


背景技术：

2.卵巢癌是全球女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，据2020年数据统计新增病例313,959例，死亡207,252例，近10年发病呈逐年上升趋势。由于起病隐匿，早期无明显症状，70％的患者就诊时已为晚期，5年卵巢癌患者的生存率约为30％。最常见的卵巢癌是卵巢浆液性囊腺癌，约占所有卵巢恶性肿瘤的90％。
3.即使在卵巢浆液性囊腺癌的早期，通过充分筛查其血清生物标志物ca-125提高患者的生存率，但绝经后妇女早期疾病筛查的敏感性也仅为50-60％。
4.近年来，微生物失调与癌症的发生越来越受到关注。微生物可通过调节宿主的多种生理变化，包括免疫系统激活、代谢调节，从而在肿瘤的发生和发展中发挥重要作用，说明肿瘤内的微生物群已经演变成一种新型的肿瘤发生调节剂和潜在的生物标志物。
5.为此，医学上结合阴道超声等影像学方法，联合多种血清生物标志物的使用，可以提高卵巢浆液性囊腺癌患者的筛查敏感性。因此迫切需要检测可靠的肿瘤标志物以早期诊断卵巢浆液性囊腺癌。


技术实现要素：

6.针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供
7.为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
8.第一个方面，本发明提供了一组用于预测卵巢浆液性囊腺癌预后的微生物标志物组合物，所述组合由halolamina、mitsuokella、terasakiella、magnetospirillum、brachymonas、simiduia、erwinia、salinisphaera和luteimonas组成。
9.优选地，所述组合由halolamina、simiduia和luteimonas组成。
10.第二个方面，本发明提供了如上所述的微生物标志物组合物在预测卵巢浆液性囊腺癌预后制剂或试剂盒中的应用。
11.第三个方面，本发明提供了一种预测卵巢浆液性囊腺癌患者预后的模型，所述预测模型为如下的计算公式：
12.riskscore＝simiduia
×
(-0.0711)+halolamina
×
(-0.0511)+luteimonas
×
0.1634式2，其中，riskscore每个卵巢浆液性囊腺癌样本的风险评分，simiduia、halolamina、luteimonas微生物名称，-0.0711、-0.0511、0.1634为对应微生物的丰度。
13.第四个方面，本发明提供了一种如上所述的预测卵巢浆液性囊腺癌患者预后的模型的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
14.s1.从tcga数据库中下载卵巢浆液性囊腺癌患者的癌组织或癌旁正常组织样本的
微生物组丰度数据、微生物组临床数据、患者生存周期数据、样本表型数据以及对应患者的临床信息数据；
15.s2.将s1的样本分为训练集和验证集，训练集用于建模，验证集用于验证；
16.s3.结合生存周期数据对训练集样本的特征微生物的丰度值进行差异分析，以p《0.05为阈值，筛选癌症样本和癌旁样本中的差异微生物；
17.s4.将s3筛选出的特征微生物进行单因素cox回归分析，筛选与生存显著相关的微生物标记物；
18.s5.对s4筛选出的特征微生物进行lassocox回归分析，并基于如下计算公式计算每个样本的风险得分：
[0019][0020]
其中，abundance表示对应微生物的丰度，β表示对应微生物在lasso回归结果中的回归系数，rscore表示每个样本风险评分，i表示样本，j表示微生物标志物；
[0021]
s6.绘制roc曲线以及构建列线图nomogram验证s5构建的风险评分模型。
[0022]
优选地，所述步骤s4筛选出的微生物标记物包括halolamina、mitsuokella、terasakiella、magnetospirillum、brachymonas、simiduia、erwinia、salinisphaera或/和luteimonas。
[0023]
优选地，所述步骤s6构建的风险评分模型为如下公式：
[0024]
riskscore＝simiduia
×
(-0.0711)+halolamina
×
(-0.0511)+luteimonas
×
0.1634式2，
[0025]
其中，riskscore每个卵巢浆液性囊腺癌样本的风险评分，simiduia、halolamina、luteimonas微生物名称，-0.0711、-0.0511、0.1634为对应微生物的丰度。
[0026]
第五个方面，本发明提供了一种列线图，所述列线图根据cox回归分析得到的独立临床因素结合预测卵巢浆液性囊腺癌患者预后模型绘制得到，所述模型具体如下：
[0027]
riskscore＝simiduia
×
(-0.0711)+halolamina
×
(-0.0511)+luteimonas
×
0.1634式2，
[0028]
其中，riskscore每个卵巢浆液性囊腺癌样本的风险评分，simiduia、halolamina、luteimonas微生物名称，-0.0711、-0.0511、0.1634为对应微生物的丰度。
[0029]
第六个方面，本发明提供了如上所述的列线图在制备用于预测卵巢浆液性囊腺癌患者预后的试剂盒中的应用。
[0030]
第七个方面，本发明提供了如上所述的列线图在预测卵巢浆液性囊腺癌患者预后中的应用，所述应用非用于疾病的诊断和治疗目的。
[0031]
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
[0032]
本发明通过tcga数据库对卵巢浆液性囊腺癌的瘤内微生物进行分析，发现在癌症样本和癌旁样本中的差异微生物共计308个，其中在肿瘤组中处于高丰度的微生物共计157个，在正常组中处于高丰度的微生物共计151个，对308个差异微生物进行界、门、纲、目、科、属等级分类，共得到197个属级差异微生物。基于197个属级差异微生物的丰度，结合总生存期的数据进行单因素cox回归分析，筛选与生存显著相关的微生物标记物，其中共得到9个与预后显著相关的微生物标记物，其中有5个风险比大于1，说明其丰度的增加可能会造成
卵巢浆液性囊腺癌患者临床不良预后(magnetospirillum,luteimonas,salinisphaera,mitsuokella和erwinia)；剩余4个风险比小于1，说明其丰度升高可能会改善卵巢浆液性囊腺癌患者临床预后(simiduia,halolamina,terasakiella和brachymonas)，进一步对微生物标志物进行生存曲线展示，微生物标志物高丰度和低丰度之间的显着预后差异表明了卵巢浆液性囊腺癌患者预后的独特临床价值。
附图说明
[0033]
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
[0034]
图1为微生物标记物差异示意；图a：差异微生物标记物的丰度预后情况火山图；图1b：单因素cox回归结果森林；
[0035]
图2为微生物标志物(具有显著性p值)的生存曲线图；
[0036]
图3为卵巢浆液性囊腺癌的预后风险评分模型的构建示意图；
[0037]
图4为训练集高低风险组生存曲线(a)和roc曲线(b)示意图；
[0038]
图5为验证集高低风险组生存曲线(a)和roc曲线(c)示意图；
[0039]
图6.构建临床列线图展示，图a-b：训练集和验证集的临床列线图；图c-d.训练集和验证集的临床列线图roc曲线图；
[0040]
图7为训练集和验证集中临床列线图和riskscore的c-index情况示意图。
具体实施方式
[0041]
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0042]
实施例1微生物预后特征模型构建
[0043]
1、数据获取及处理
[0044]
tcga-ov肿瘤样本临床数据如表1：
[0045][0046]
(1)tcga卵巢浆液性囊腺癌微生物组丰度数据下载：http://ftp.microbio.me/pub/cancer_microbiome_analysis/tcga/kraken/kraken-tc ga-voom-snm-plate-center-filtering-data.csv
[0047]
(2)tcga卵巢浆液性囊腺癌微生物组临床数据下载：
[0048]
http://ftp.microbio.me/pub/cancer_microbiome_analysis/tcga/kraken/metad ata-tcga-kraken-17625-sample.csv
[0049]
(3)tcga卵巢浆液性囊腺癌患者生存周期数据下载：
[0050]
https://tcga-xena-hub.s3.us-east-1.amazonaws.com/download/survival％2fov_survival.txt
[0051]
(4)tcga卵巢浆液性囊腺癌样本表型数据下载：
[0052]
https://tcga-xena-hub.s3.us-east-1.amazonaws.com/download/tcga.ov.sampl emap％2fov_clinicalmatrix
[0053]
将上述tcga卵巢浆液性囊腺癌的样本按照5:5进行划分，其中50％的数据用于建模(训练集)，50％的数据用于验证(验证集)，进一步结合生存周期数据，利用r包survival(v3.2-7)和survminer(v0.4.8)对训练集样本的特征微生物标志物的丰度值进行批量cox单因素回归分析，回归分析后，以p《0.05为阈值筛选与生存周期显著相关的特征微生物标志物。
[0054]
结果显示，癌症样本和癌旁样本中的差异微生物共计308个，其中在肿瘤组中处于高丰度的微生物共计157个，在正常组中处于高丰度的微生物共计151个，对308个差异微生物进行界、门、纲、目、科、属等级分类，共得到197个属级差异微生物。进一步基于197个属级差异微生物的丰度，结合总生存期的数据进行单因素cox回归分析，筛选与生存显著相关的微生物标记物，其中共得到9个与预后显著相关的微生物标记物(图1)。
[0055]
该9个微生物标记物分别为：halolamina、mitsuokella、terasakiella、
magnetospirillum、brachymonas、simiduia、erwinia、salinisphaera、luteimonas。其中有5个(magnetospirillum,luteimonas,salinisphaera,mitsuokella和erwinia)的风险比大于1，说明其丰度的增加可能会造成卵巢浆液性囊腺癌患者临床不良预后；剩余4个(simiduia,halolamina,terasakiella和brachymonas)的风险比小于1，说明其丰度升高可能会改善卵巢浆液性囊腺癌患者临床预后。
[0056]
2、lassocox回归分析
[0057]
进一步对预后相关特征微生物标志物进行lasso回归降维，并构建风险评分模型，该过程主要依赖于r包glmnet(v4.0-2)。为了构建更加准确的回归模型，首先利用了交叉验证的方式进行lambda筛选，然后选择lamdba.min对应的模型，进一步提取模型中相关特征微生物标志物的丰度矩阵，并基于以下公式计算每个样本的风险得分：
[0058][0059]
上述式1中abundance表示对应微生物marker的丰度，β表示对应marker在lasso回归结果中的回归系数(coef)，rscore表示每个样本中显著相关marker的丰度乘以对应marker的coef再求和，i表示样本，j表示微生物marker。
[0060]
进一步对微生物标志物halolamina、terasakiella、magnetospirillum、simiduia、salinisphaera、luteimonas、mitsuokella、erwinia、brachymonas进行生存曲线展示(图2)，微生物标志物高丰度和低丰度之间的显着预后差异表明了卵巢浆液性囊腺癌患者预后的独特临床价值。
[0061]
将上述微生物标志物纳入lassocox回归，建立预后模型来计算风险评分。进一步利用lasso回归对单因素cox回归结果进行降维，结果得到3个微生物标记物(simiduia、halolamina、luteimonas)，并以此构建风险评分模型(图3)，即得出：
[0062]
riskscore＝simiduia
×
(-0.0711)+halolamina
×
(-0.0511)+luteimonas
×
0.1634式2
[0063]
式2即为本发明构建的风险评分模型。
[0064]
实施例2微生物预后特征模型验证
[0065]
1、绘制roc曲线
[0066]
为了验证实施例1构建的风险评分模型效能，基于训练集样本的风险得分，以中位数为节点划分高低风险组，结合生存周期数据，绘制生存曲线，计算p值，p-value《0.05判断为高低风险组的差异显著，然后进一步用样本风险得分作为模型预测结果，并结合生存数据计算模型的auc值，进而绘制roc曲线。结果显示(图4)，高低风险两组的生存曲线差异显著(图4a；p《0.05)1年、3年和5年的auc值均大于0.6，说明模型效能良好(图4b)
[0067]
在验证集中对模型效能进行验证，按照公式2计算样本风险得分，基于样本的风险得分，以中位数为节点划分高低风险组，结合总生存期数据，绘制生存曲线，结果显示(图5)，两组的生存曲线差异显著(图5a；p《0.05)；然后进一步用样本风险得分作为模型预测结果，并结合生存数据计算模型1年、3年和5年的auc均大于0.6，说明模型效能良好(图5b)。
[0068]
2、构建临床列线图(nomogram)
[0069]
利用训练集和验证集数据中riskscore、age、grade、clinical_stage绘制列线图(nomogram)指导临床决策。同时绘制基于列线图的roc曲线。结果显示(图6)，无论训练集还
是验证集，1年、3年和5年的auc均大于0.65，说明列线图的预后效能优于单独的riskscore。
[0070]
最后分别统计训练集和验证集中列线图和riskscore的c-index情况(c指数)，结果显示，两类模型的c-index均大于0.5，说明有正预测效能，但是列线图的c-index明显高于riskscore(图7)，说明多因素临床列线图的预测优于单因素风险评分模型。
[0071]
综上，本发明基于tgca的卵巢微生物组数据，构建了基于差异微生物丰度的卵巢浆液性囊腺癌生存模型，且模型预后效能良好，为之后微生物与卵巢浆液性囊腺癌之间关系的深入探究提供了新线索。
[0072]
本发明利用tcga卵巢浆液性囊腺癌微生物组数据建立基于微生物丰度的生存模型，该模型预后良好，并利用卵巢浆液性囊腺癌内部微生物群差异分析和lasso回归筛选变量建立cox回归临床预测模型，绘制列线图nomogram图，为之后微生物与卵巢浆液性囊腺癌之间关系的深入探究提供了新靶点。
[0073]
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

技术特征：
1.一组用于预测卵巢浆液性囊腺癌患者预后的微生物标志物组合物，其特征在于，所述组合由halolamina、mitsuokella、terasakiella、magnetospirillum、brachymonas、simiduia、erwinia、salinisphaera和luteimonas组成。2.如权利要求1所述的微生物标志物组合物，其特征在于，所述组合由halolamina、simiduia和luteimonas组成。3.如权利要求1或2所述的微生物标志物组合物在预测卵巢浆液性囊腺癌患者预后制剂或试剂盒中的应用。4.一种预测卵巢浆液性囊腺癌患者预后的模型，其特征在于，所述预测模型为如下的计算公式：riskscore＝simiduia
×
(-0.0711)+halolamina
×
(-0.0511)+luteimonas
×
0.1634式2，其中，riskscore每个卵巢浆液性囊腺癌样本的风险评分，simiduia、halolamina、luteimonas微生物名称，-0.0711、-0.0511、0.1634为对应微生物的丰度。5.一种如权利要求4所述的预测卵巢浆液性囊腺癌患者预后的模型的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：s1.从tcga数据库中下载卵巢浆液性囊腺癌患者的癌组织或癌旁正常组织样本的微生物组丰度数据、微生物组临床数据、患者生存周期数据、样本表型数据以及对应患者的临床信息数据；s2.将s1的样本分为训练集和验证集，训练集用于建模，验证集用于验证；s3.结合生存周期数据对训练集样本的特征微生物的丰度值进行差异分析，以p<0.05为阈值，筛选癌症样本和癌旁样本中的差异微生物；s4.将s3筛选出的特征微生物进行单因素cox回归分析，筛选与生存显著相关的微生物标记物；s5.对s4筛选出的特征微生物进行lassocox回归分析，并基于如下计算公式计算每个样本的风险得分：其中，abundance表示对应微生物的丰度，β表示对应微生物在lasso回归结果中的回归系数，rscore表示每个样本风险评分，i表示样本，j表示微生物标志物；s6.绘制roc曲线以及构建列线图nomogram验证s5构建的风险评分模型。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤s4筛选出的微生物标记物包括halolamina、mitsuokella、terasakiella、magnetospirillum、brachymonas、simiduia、erwinia、salinisphaera或/和luteimonas。7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤s6构建的风险评分模型为如下公式：riskscore＝simiduia
×
(-0.0711)+halolamina
×
(-0.0511)+luteimonas
×
0.1634式2，其中，riskscore每个卵巢浆液性囊腺癌样本的风险评分，simiduia、halolamina、
luteimonas微生物名称，-0.0711、-0.0511、0.1634为对应微生物的丰度。8.一种列线图，其特征在于，所述列线图根据cox回归分析得到的独立临床因素结合预测卵巢浆液性囊腺癌患者预后模型绘制得到，所述模型具体如下：riskscore＝simiduia
×
(-0.0711)+halolamina
×
(-0.0511)+luteimonas
×
0.1634式2，其中，riskscore每个卵巢浆液性囊腺癌样本的风险评分，simiduia、halolamina、luteimonas微生物名称，-0.0711、-0.0511、0.1634为对应微生物的丰度。9.如权利要求8所述的列线图在制备用于预测卵巢浆液性囊腺癌患者预后的试剂盒中的应用。10.如权利要求8所述的列线图在预测卵巢浆液性囊腺癌患者预后中的应用，所述应用，所述应用非用于疾病的诊断和治疗目的。

技术总结
本发明提供了一组用于预测卵巢浆液性囊腺癌患者预后的微生物标志物组合物，所述组合由Halolamina、Mitsuokella、Terasakiella、Magnetospirillum、Brachymonas、Simiduia、Erwinia、Salinisphaera和Luteimonas组成。该微生物标志物的高丰度和低丰度之间的显着预后差异表明了卵巢浆液性囊腺癌患者预后的独特临床价值。由该微生物标志物组合物构建的模型可用于预测卵巢浆液性囊腺癌患者预后风险。型可用于预测卵巢浆液性囊腺癌患者预后风险。型可用于预测卵巢浆液性囊腺癌患者预后风险。


技术研发人员：秦浩 闫一芳 刘捷 瞿仪
受保护的技术使用者：北京大学第三医院（北京大学第三临床医学院） 中国人民解放军空军特色医学中心
技术研发日：2023.07.25
技术公布日：2023/9/22