检测生殖泌尿系统感染病原菌的组合物、试剂盒及用途的制作方法

1.本发明属于分子生物学检测领域，具体地，涉及生殖泌尿系统相关病原菌的检测，更具体地，涉及生殖支原体、人型支原体、阴道毛滴虫，白色念珠菌。


背景技术：

2.支原体引起的泌尿生殖道炎症是最古老、最常见的性传播性疾病之一。生殖支原体(mycoplasma genitalium，mg)，是一种很难培养的性传播病原体，有10-35％的男性急性和慢性非淋菌性尿道炎(ngu)也由生殖支原体引起，也可致女性宫颈炎、子宫内膜炎和盆腔炎。
3.人型支原体(mycoplasma hominis，mh)是生殖泌尿系统中容易引起盆腔炎、细菌性阴道病、产后发热等疾病的病原体，常导致严重的疾病，甚至有研究表明其可能与女性不孕有关。
4.阴道毛滴虫(trichomonas vaginalis，tv)感染是一种十分常见的性传播疾病，该据who报道，全球每年有1.7亿人感染tv。除引起泌尿生殖道感染外，tv也是hⅳ感染和诱发宫颈癌的危险因素之一。女性妊娠中期感染tv常引起胎膜早破、早产、低体重儿等，它也是男性非淋菌性尿道炎的一个重要病因。与其他性传播疾病一样，其临床症状不典型，临床确诊常借助实验检测。
5.白色念珠菌(candida albicans，ca)在肺部以外，常常引起阴道炎、宫颈炎；白色念珠菌为两成女性阴道菌丛的正常成分，并不造成感染，若因激素、服用药物或免疫力下降导致阴道环境改变，而使白色念珠菌大量增殖，便可能导致念珠菌性外阴阴道炎。免疫缺乏、服用避孕药、服用抗生素与妊娠均会增加感染机会，症状包括阴道痛痒、交媾与排尿时有痛感与异常的分泌物，诊断多需取小量样本进行培养，再于显微镜下观察鉴别。念珠菌性外阴阴道炎是第二常见的阴道炎，仅次于细菌性阴道病。有高达75％的女性在其一生中得过至少一次念珠菌性外阴阴道炎，接近半数则超过两次。约5％的女性在一年中被感染三次以上。感染男性生殖器导致龟头炎，感染毛囊导致毛囊炎，在消化道过度生长而造成肠胃不适等。产道存有白色念珠菌的孕妇若发生早期羊膜囊破裂，可能造成新生儿感染先天性皮肤念珠菌病。
6.以上单体感染易引发交叉混合感染，随着性意识的开放和抗生素的大量使用，生殖器白色念珠菌患者的数量在不断增多，除了女性患者之外，男性发病率也在不断上升。据报道，男性白色念珠菌合并人型支原体感染率在37％，女性白色念珠菌合并人性支原体感染率为51.9％。多种病原体的合并感染常导致并发症，mg、mh、tv是男性非淋菌性尿道炎的一个重要病因，其临床症状不典型，临床确诊需借助实验室检测。在女性妊娠期感染mg、mh、tv、ca，可引起胎膜早破、早产、低体重儿等。目前，临床治疗念珠菌和衣原体感染抗菌药物种类较多，但抗生素的滥用使得支原体对其耐药性增加，而高效精准的支原体检测产品可为临床合理用药提供可靠依据与参考，进而提升治疗效果，改善预后结局。
7.因此，本领域需求一种产品能够简单、快速地检测上述病原体，并且灵敏度高，特
异性好。


技术实现要素：

8.有鉴于此，第一方面，本发明提供一种检测生殖泌尿系统感染病原菌的组合物，包括：
9.如seq id no:1～3所示的检测生殖支原体的上游引物、下游引物及探针；
10.如seq id no:4～6所示的检测人型支原体的上游引物、下游引物及探针；
11.如seq id no:7～9所示的检测阴道毛滴虫的上游引物、下游引物及探针；以及
12.如seq id no:10～12所示的检测白色念珠菌的上游引物、下游引物及探针。
13.本发明提供的联检的组合物，主要利用多重荧光pcr分析方法，通过检测不同病原体上的靶点，对不同病原体进行检测，从而在单管反应体系中同时实生殖支原体、人型支原体、阴道毛滴虫，和白色念珠菌的检测和区分，以便为后续治疗提供针对性策略。本发明的组合物，其检测的灵敏度更高，达到200拷贝/ml，特异性好，检测更为准确。
14.进一步地，所述组合物包括检测内标的上游引物、下游引物及探针。
15.在一些具体的实施方案中，内标是人源内标基因。在一个具体的实施方案中，内标是rnase p。
16.进一步地，本发明组合物探针的荧光基团彼此互不相同且互不干扰。
17.在本文中，“互不相同且互不干扰”是指组合物中每个探针所用的荧光基团是不一样的，并且不会影响彼此的检测，即可以利用不同的通道进行检测。例如可以使用atto 425、quasar705、fam、hex、rox和cy5，这些基团吸光值不接近，能选择不同的通道，因而不会互相干扰。
18.在一些具体的实施方案中，生殖支原体探针的荧光报告基团为fam；人型支原体探针的荧光报告基团为hex(或vic)；阴道毛滴虫探针的荧光报告基团为rox；白色念珠菌探针的荧光报告基团为cy5。
19.进一步地，在一些实施方案中，本发明的组合物可以同时包括上述引物和探针对中的一对或多对。在本发明中，“对”是指检测一个靶点的互相匹配的上游、下游引物和探针。
20.本发明的组合物可以任意组合成检测对应4个靶点的任意组合形式。本领域技术人员可以根据需要进行组合，检测哪几个靶点，即把对应靶点的引物和探针对进行组合即可。这些组合形式均包括在本发明中。
21.举例来说，可以包括上述4对引物和探针中的任意3对，可以包括上述4对引物和探针中的任意2对，也可以包括上述4对引物和探针中的任意1对。
22.在一些具体的实施方案中，本发明组合物用于荧光pcr。
23.进一步地，探针的3’末端还具有非荧光淬灭剂。
24.进一步地，探针的3’末端还具有淬灭基团，例如bhq1或bhq2。
25.在一个具体的实施方案中，探针的3’末端为bhq1。
26.在一个具体的实施方案中，本发明的组合物的各成分分别存在于单独包装中。
27.在一个具体的实施方案中，本发明的组合物的各成分存在于同一个包装中。
28.进一步地，本发明的组合物的各成分以混合的形式存在。
29.第二方面，本发明提供了上述本发明的组合物在制备检测生殖泌尿系统感染病原菌的试剂盒中的用途，其中，所述病原体为生殖支原体、人型支原体、阴道毛滴虫、白色念珠菌。
30.第三方面，本发明提供了一种检测生殖泌尿系统感染病原菌的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述本发明的组合物。
31.进一步地，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品。
32.在一个具体的实施方案中，阴性质控品是depc h2o、生理盐水中的至少一种。阳性质控品是生殖支原体、人型支原体、阴道毛滴虫、白色念珠菌的片段质粒或阳性菌株中的至少一种。
33.进一步地，所述试剂盒还包括dntp、pcr缓冲液以及mg
2+
中的至少一种。
34.更进一步地，所述试剂盒还包括：核酸释放试剂、核酸提取试剂，以及dna聚合酶中的至少一种。
35.更进一步地，所述试剂盒还包括核酸释放试剂、核酸提取试剂、dntp、dutp、尿嘧啶糖基化酶(udg)、dna聚合酶、pcr缓冲液以及mg
2+
中的至少一种。
36.进一步地，所述dna聚合酶的浓度为3u/反应～15u/反应，例如dna聚合酶可以是taq酶。
37.在一个具体的实施方案中，本发明试剂盒包括taq酶、mg
2+
、dntp(u)s、引物、探针和pcr缓冲液。
38.常见的pcr缓冲液由tris-hcl、mgcl2、kcl、triton x-100等缓冲体系构成。一般单个pcr反应管中总体积为20μl～200μl。
39.在一个具体的实施方案中，本发明试剂盒可以兼容数字pcr扩增体系，即可以直接用于数字pcr仪上进行扩增。
40.第四方面，提供了一种用于非诊断目的的检测生殖泌尿系统感染病原菌的方法，所述方法包括以下步骤：
41.1)提取或释放待测样本的核酸；
42.2)使用如上所述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量pcr；
43.3)获得并分析结果。
44.在本发明中，用于检测的样本可以是生殖道分泌物，尿道分泌物，尿液等，但不限于此。
45.进一步地，所述荧光定量pcr的反应条件为：
46.cdna预变性，温度为95℃，时间为1～6min，1次循环；变性，温度为95℃，时间为5～20秒，退火，温度为55℃～60℃，时间为10～60秒，30～50次循环，采集荧光。
47.在一个具体的实施方案中，提供了一种用于制备检测生殖泌尿系统感染病原菌的组合物的用途，所述检测包括以下步骤：
48.1)提取或释放待测样本的核酸；
49.2)使用如上述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量pcr；
50.3)获得并分析结果。
51.进一步地，所述荧光定量pcr的反应条件为：
52.cdna预变性，温度为95℃，时间为1～6min，1次循环；变性，温度为95℃，时间为5～20秒，退火，温度为55℃～60℃，时间为10～60秒，30～50次循环，采集荧光。
53.在本文中，术语“非诊断目的”指并非旨在获得个体是否感染上述病原体并罹患生殖道疾病的信息。例如，该方法可以在检测培养物中(例如生殖道分泌物，尿道分泌物，尿液)需求检测是否有上述病原体。
附图说明
54.图1本发明组合物检测结果图(生殖支原体、人型支原体、阴道毛滴虫、白色念珠菌)；
55.图2为本发明组合物灵敏度结果图(生殖支原体)；
56.图3为本发明组合物灵敏度结果图(人型支原体)；
57.图4为本发明组合物灵敏度结果图(阴道毛滴虫)；
58.图5为本发明组合物灵敏度结果图(白色念珠菌)；
59.图6为本发明组合物特异性结果图；
60.图7为本发明组合物精密度结果图(生殖支原体)；
61.图8为本发明组合物精密度结果图(人型支原体)；
62.图9为本发明组合物精密度结果图(阴道毛滴虫)；
63.图10为本发明组合物精密度结果图(白色念珠菌)；
64.图11为本发明对比例组合物检测结果图(生殖支原体单检图)；
65.图12为本发明对比例组合物检测结果图(生殖支原体联检图)；
66.图13为本发明对比例组合物检测结果图(白色念珠菌单检图)；
67.图14为本发明对比例组合物检测结果图(白色念珠菌联检图)。
具体实施方式
68.下文将结合具体实施方案和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方案和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
69.实施例1、本发明所使用的引物及探针
70.本发明所使用的引物及探针如下表1所示：
71.[0072][0073]
其中，mg的荧光报告基团为fam；mh的荧光报告基团为hex(或vic)；tv的荧光报告基团为rox；白色念珠菌探针的荧光报告基团为cy5。
[0074]
实施例2、检测病原体的方法
[0075]
本发明检测样本为尿液、男性尿道分泌物、女性生殖道分泌物，在样本处理室进行如下核酸提取操作：
[0076]
2.1根据待测样本数量取1.5ml离心管若干，每管加入300μl样品；
[0077]
2.2加入500μl提取溶液和50μl蛋白酶k-磁珠混合液；盖上管盖，震荡混匀30s，60℃加热10min。
[0078]
2.3室温静置1min，低速瞬时离心，将离心管置于磁性分离器上，5min后缓慢吸弃废液(*注意不要碰到吸附于管壁内侧的磁珠)；
[0079]
2.4加入200μl洗涤液1和600μl洗涤液2，震荡混匀30s，低速瞬时离心后将离心管置于磁性分离器。磁吸3min，将液体完全吸出丢弃。
[0080]
2.6将离心管至于离心机中低速瞬时离心，将离心管再次置于磁性分离器。磁吸3min，将管底液体完全吸尽。
[0081]
2.7加入30～100μl洗脱液(推荐使用80μl洗脱)，震荡混匀30s，将离心管壁上磁珠洗脱到管底，室温静置3min；低速瞬时离心，将离心管再次置于磁性分离器上磁吸3min，然后将洗脱下来的核酸转移到干净的1.5ml离心管中。
[0082]
2.8吸取上述处理好的样本、阳性对照及阴性对照各20μl分别加入对应的0.2ml pcr反应管中，每管加入30μl pcr混合液，盖上管盖。
[0083]
实时荧光pcr反应体系按照如下进行配置：
[0084]
组份每一个反应中的体积/浓度模板5-10μlmg
2+
4-8mmdntps(100mm)0.2-1.0mmtaq酶(5u/μl)5-45u引物100-800nm探针50-500nmpcr缓冲液(1x)补至50μl
[0085]
pcr扩增程序如下进行设置：
[0086][0087]
结果分析：
[0088]
1)目的检测信号为fam，hex(或vic)，rox，cy5；
[0089]
2)baseline的设置：baseline一般设置为3-15个循环，具体可根据实际情况进行调整。其调整原则为：选择指数扩增前荧光信号较稳定的区域，起点(start)避开荧光采集起始阶段的信号波动，终点(end)比最早出现指数扩增的样本ct减少1-2个循环。threshold的设置：设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品的最高点；
[0090]
3)结果判读
[0091]
a)对于fam通道检测到典型的s型扩增曲线，且ct≤40的样本，报告为mg阳性；对于fam通道未检测到典型的s型扩增曲线，报告为mg阴性。
[0092]
b)对于hex通道检测到典型的s型扩增曲线，且ct≤40的样本，报告为mh阳性；对于hex通道未检测到典型的s型扩增曲线，报告为mh阴性。
[0093]
c)对于rox通道检测到典型的s型扩增曲线，且ct≤40的样本，报告为tv阳性；对于rox通道未检测到典型的s型扩增曲线，报告为tv阴性。
[0094]
d)对于cy5通道检测到典型的s型扩增曲线，且ct≤40的样本，报告为白色念珠菌阳性；对于cy5通道未检测到典型的s型扩增曲线，报告为白色念珠菌阴性。
[0095]
实施例3、本发明组合物测试样本的检测结果
[0096]
将实施例1所示的引物和探针，按照实施例2的方法对生殖支原体、人型支原体、阴道毛滴虫，白色念珠菌，在宏石荧光定量pcr仪器上进行pcr检测，检测结果如图1所示，从图中可以看出，本发明组合物均能对各种病原体进行良好的检测。
[0097]
实施例4、本发明组合物的灵敏度
[0098]
使用本发明实施例1中的组合物，对各个靶标进行lod(灵敏度)检测，浓度分别为5000、1000、500、200拷贝/ml，以模拟临床样本，在宏石荧光定量pcr仪器上进行20次多重pcr检测。结果如图2～5所示，表明对低至200拷贝/ml的样本各通道仍然能够准确检测出，检出率100％，表明本发明组合物的灵敏度为200拷贝/ml。
[0099]
实施例5、本发明组合物的特异性
[0100]
本发明组合物与生殖泌尿系统常见病原体及感染症状相似的其他病原体(如大肠埃希菌、屎肠球菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、解脲脲原体、淋球菌、沙眼衣原体、人乳头瘤病毒16型、人乳头瘤病毒18型、单纯疱疹病毒ⅱ型、梅毒螺旋体、表皮葡萄球菌、阴道加德纳菌、腺病毒、巨细胞病毒、乙型链球菌、干酪乳杆菌等)均无交叉反应。结果如图6所示。
[0101]
实施例6、本发明组合物的精密度
[0102]
选择强阳、弱阳2个浓度水平(分别为10000copies/ml和2000copies/ul)的质控品
进行批内精密度和批间精密度的测定，每个样本重复测定10次。结果显示强阳、弱阳参考品的检出率均为100％，并批内、批间的检测ct值变异系数(cv)小于5％，可以认为本试剂盒批内、批间均有着很好的检测精密度。如图7～10所示。
[0103]
对比例1、本发明设计的其余效果不好的引物和探针
[0104]
由于碱基互补配对原则，引物和(或)探针之间会形成二聚体，但这种概率很少，在设计之初就可以排除掉。但多种病原体联合检测时，引物和探针众多，引物和引物、探针和探针或者引物和探针之间容易发生二聚体，要保证设计的保守性(保守性对检测的准确性至关重要)，又要考虑不同引物探针之间的相互干扰，需要精心对引物探针进行设计。
[0105]
因此，发明人还设计了其余一些引物和探针组成了不同的检测体系(序列未示出)，同样用于检测上述病原体。具体检测结果如图11～14所示，从图中可以看出生殖支原体的对比例引物探针和白色念珠菌的对比例引物探针，单检体系检测效果很好，然而在四联检的体系中检测却受到影响，ct和荧光值均表现较差(为了清楚，联检图中仅出现了单通道，实质是四联检实验)，进一步说明本发明的组合物的优越性。

技术特征：
1.一种检测生殖泌尿系统感染病原菌的组合物，包括：如seq id no:1～3所示的检测生殖支原体的上游引物、下游引物及探针；如seq id no:4～6所示的检测人型支原体的上游引物、下游引物及探针；如seq id no:7～9所示的检测阴道毛滴虫的上游引物、下游引物及探针；以及如seq id no:10～12所示的检测白色念珠菌的上游引物、下游引物及探针。2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物的探针的荧光基团彼此互不相同且互不干扰。3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括检测内标的上游引物、下游引物及探针。4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，生殖支原体的荧光报告基团为fam；人型支原体的荧光报告基团为hex或vic；阴道毛滴虫的荧光报告基团为rox；白色念珠菌探针的荧光报告基团为cy5。5.根据权利要求1～4中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物的各成分以混合的形式存在。6.根据权利要求1～5中任一项所述的组合物在制备检测生殖泌尿系统感染病原菌的试剂盒中的用途，其中，所述病原体为生殖支原体、人型支原体、阴道毛滴虫，白色念珠菌。7.一种检测生殖泌尿系统感染病原菌的试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求1～5中任一项所述的组合物。8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品。9.根据权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：核酸释放试剂、核酸提取试剂、dna聚合酶、dntp、dutp、udg酶、pcr缓冲液以及mg
2+
中的至少一种。10.一种用于制备检测生殖泌尿系统感染病原菌的组合物的用途，所述检测包括以下步骤：1)提取或释放待测样本的核酸；2)使用如权利要求1～5中任一项所述的组合物或权利要求7～9中任一项所述的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量pcr；3)获得并分析结果。

技术总结
本发明属于分子生物学检测领域，具体地，涉及生殖泌尿系统感染相关病原菌的检测，更具体地，涉及生殖支原体、人型支原体、阴道毛滴虫、白色念珠菌的检测。本发明提供的联检的组合物，主要利用多重荧光PCR分析方法，通过检测不同病原体上的靶点，对不同病原体进行检测，从而在单管反应体系中同时实现生殖支原体、人型支原体、阴道毛滴虫、白色念珠菌的检测和区分。本发明的组合物，其检测的灵敏度更高，达到200拷贝/mL，特异性好，检测更为准确。检测更为准确。检测更为准确。


技术研发人员：孙青芝 唐奕昕 王剑 谭德勇 戴立忠
受保护的技术使用者：圣湘生物科技股份有限公司
技术研发日：2023.07.27
技术公布日：2023/9/22