一种将猪内源KDR基因替换为mCherry的新型报告系统

一种将猪内源kdr基因替换为mcherry的新型报告系统
技术领域
1.本发明公开了一套可以将猪内源kdr基因替换为mcherry的新型报告系统，属于生物技术领域。


背景技术：

2.血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor ，vegf）是一个包括vegf-a、vegf-b、vegf-c、vegf-d、vegf-e和胎盘生长因子（pgf）的家族，对内皮细胞的生长极为重要。与vegf进行特异性结合的受体称为血管内皮生长因子受体（vascular endothelial growth factor receptor，vegfr），主要分为vegfr-1、vegfr-2和vegfr-3三类，其中vegfr-2也称为kdr。在血管生成和发育、通透性和造血功能的调节中扮演着重要的角色，能够促进内皮细胞的增殖、存活、迁移和分化以及肌动蛋白细胞骨架的重组。由于基因组不同位点的表观遗传差异，传统的异位报告系统尚不能真实地准确反映kdr基因的表达水平。此外，内源kdr的异常激活将导致下游基因表达谱的改变，影响机制研究的准确性。建立一套将猪内源kdr基因表达替换为荧光信号的实时报告系统对后续的科学研究至关重要。由于猪源细胞基因编辑等基本技术体系的不成熟与对kdr阳性细胞进行基因操作的难度较大，尚无相关的稳定可靠的报告系统被报道。本发明在已有基础上，建立了可以将猪内源kdr替换为mcherry的新型载体系统。本发明提供了可以实时监测hme诱导过程中内源kdr基因激活程度的新方法，避免了kdr基因激活带来的基因表达网络的改变。本发明具有创新性强、报告精确、安全性好、操作简便等特点。


技术实现要素：

3.一、名词定义。
4.本专利所指kdr（kinase insert domain receptor ），亦称为flk-1和vegfr2，是一种蛋白质，在猪基因组中由kdr基因编码。kdr是vegf的一种受体，有助于造血细胞的发育。kdr表达标志着造血中胚层细胞类型的形成。
5.本专利所指mcherry是一种来自于蘑菇珊瑚（mushroom coral）的红色荧光蛋白，是一个由约237个氨基酸组成的蛋白质，从绿光使其激发，激发波长为532 nm并发出红色萤光，可以被荧光显微镜直接观测到，该蛋白对细胞状态几乎不产生其它影响。
6.本专利所指的报告系统，是基于crispr/cas9的基因编辑平台，构建的kdr基因座定点编辑系统。该系统可以精确反应猪内源kdr表达情况。包含一条可以特异性靶向kdr翻译终止位点的sgrna和配套的将mcherry表达框通过同源重组的方式精确整合到猪内源kdr终止密码子前的dna供体质粒。
7.二、构建可以将猪内源kdr基因替换为mcherry的载体系统。
8.利用crispr/cas9技术对猪源细胞进行基因定向改造的基础上，研究了猪kdr基因座的序列特征。在猪kdr终止密码子taa附近设计特异性sgrna。
9.sgrna序列： 5
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cgtgggtggctcctttaaac
ꢀ‑
3；
sgrna作用位点的序列： 5
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cgtgggtggctcctttaaac
ꢀ‑
3；依据crispr/cas9的工作特性，构建了含有两侧分别为951 bp和965 bp长度的同源臂的供体质粒（donor）。该供体质粒可以将位于两侧同源臂中间的mcherry-p2a-h2b-mcherry-sv40(ploya)-ef1-t2a-puror-wpre序列精确整合到猪内源kdr的终止密码子之前，实现内源kdr基因的替换。
10.三、构建将猪内源kdr替换为mcherry的ips细胞株。
11.根据本发明前期构建的载体系统。我们构建了一株含有将猪内源kdr替换成mcherry的epscs细胞。
12.具体而言，通过电转，将两个质粒导入猪epscs中。培养7天后，挑取生长状态良好的单细胞克隆。通过提取细胞基因组，设计特异性引物做pcr鉴定，检测这些细胞的内源kdr基因左右两侧的编辑情况。结果表明，这些细胞株均发生了我们所预期的编辑。选择状态最好的一株细胞扩增进行下一步实验，其余细胞被按照相关规定做销毁处理。
13.四、利用猪hme（hematopoietic mesoderm）诱导来验证该载体系统的功能。
14.为了验证本发明的工作能力，我们将上一步得到的将内源kdr替换为mcherry的猪epscs进行诱导hme试验。实验结果表明，在猪hme中出现了mcherry荧光，并且通过定量检测，相关hme标志基因均上调。我们获得了可以将猪内源kdr替换为mcherry的载体系统，这个载体系统可以很好的实时报告kdr基因的表达，并可通过流式准确筛选出hme。
15.五、将猪内源kdr基因替换为mcherry的新型报告系统有以下优势。
16.发明创新性强，猪内源kdr的激活会影响下游基因的表达，将猪内源kdr通过crispr/cas9介导的基因编辑技术插入mcherry，在精确报告kdr表达量的同时，避免因为kdr激活而带来的细胞状态的改变。
17.2.从实际实验数据看，本发明可以实现kdr基因的mcherry替换，对kdr的表达指示效果明显。
18.3. 本发明精确性强。技术方案上看，相比于传统的慢病毒启动子报告方案，本发明的mcherry与内源kdr的表达水平相同，避免了多拷贝插入所带来的表达水平的波动。本发明在kdr基因座的原位进行报告，避免了基因组不同位置带来的空间效应。
19.4.本发明操作简单，相比于传统的慢病毒侵染等途径繁琐的操作步骤，本发明只需要将目的质粒通过转染的方式导入细胞后即可进行报告系统整合阳性细胞的筛选。
20.5.本发明技术方案安全性良好，操作过程中不产生可能对人类健康产生危险的病毒毒液。
21.本专利文本中相关载体的构建、猪epscs的使用和猪hme诱导验证仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术策略范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换，也应视为本发明的保护范围。
22.另外，本专利不存在知识产权纠纷。
附图说明
23.图1是通过基因编辑将猪内源kdr基因替换为mcherry的具体原理模式图。
24.图2 是基因基因编辑阳性的epscs及向hme诱导结果。kdr基因表达的细胞呈现
mcherry阳性（红色）。结果表明该报告系统成功实现了kdr基因的替换与报告。
具体实施方式
25.1、通过直接合成的方式构建px459-sgrna打靶载体与将kdr基因替换为mcherry的同源重组donor载体。
26.2、通过电转，将500 ng的px459-sgrna打靶载体和500 ng的donor载体与事先准备好培养48 h的105个epscs按说明书进行电转。37
°ꢀ
5% co2培养至出现直径1000 μm以上的单细胞克隆。用接种针挑取单细胞克隆至12孔板。
27.3、取12孔板长满后的一半细胞，进行基因型鉴定。用天根dna提取试剂盒（货号dp336）按说明书进行dna提取。用takara公司的 primerstar max dna polymerase（货号r045a）试剂按说明书进行pcr基因型鉴定，筛选出基因替换阳性猪epscs。
28.4、将基因编辑阳性猪epscs进行hme诱导。在37
°ꢀ
5% co2培养箱中孵育2天后，其即可检测到mcherry阳性（红色荧光）的细胞，证明本报告系统指示精确，工作良好。

技术特征：
1.本发明提供了一种将猪内源kdr基因替换为mcherry的新型报告系统；其特征在于提供了一条能有效打靶猪kdr基因终止密码子的sgrna序列如：seq id 1所示，和配套的将猪内源kdr替换为mcherry的同源重组载体。2.如权利要求1所述的配合上述sgrna，将猪内源kdr替换为mcherry同源重组载体，其特征如下：1）在该sgrna位点上游50个核苷酸以内为起点，长度约为800-1000个核甘酸的上游同源臂；2）在该sgrna位点下游50个核苷酸以内为起点，长度约为800-1000个核甘酸的下游同源臂；3）在两侧同源臂中间插入多克隆位点或具有指示能力的基因包括但不限于荧光蛋白基因；4）通过直接合成、同源重组、吉布森装配或酶切连接等方式构建成的包含以上元素的基因敲入同源重组载体。3.如权利要求1所述的利用，其特征在于使用与本专利相同的sgrna核心序列，对猪kdr基因座进行改造，包括但不限于截短、加长等方式。4.如权利要求1与权利要求2所述的利用，其特征在于以基因编辑技术，靶向猪kdr终止子位点附近，将kdr替换为不限于mcherry的其它蛋白来实现对kdr表达量的指示。5.如权利要求1与权利要求2所述的利用，其特征在于将本发明开发为某种产品，包括但不限于kdr报告系统试剂盒。6.如权利要求1与权利要求2所述的利用，其特征在于将本发明用于构建基因编辑细胞株的应用。

技术总结
本发明公开了一套可以将猪内源KDR（Kinase Insert Domain Receptor）基因替换为mCherry的载体系统。通过研究猪内源KDR翻译终止位点的基因组序列特征，设计了可以将猪内源KDR替换为mCherry的新型载体系统。利用该载体系统，成功实现了猪EPSC细胞的基因替换，并通过诱导HME（Hematopoietic Mesoderm）实现了该报告系统的功能。进而，本发明提供了可以实时监测HME诱导过程中内源KDR基因激活程度的新方法，避免了KDR基因激活带来的基因表达网络的改变。本发明具有创新性强、报告精确、安全性好、操作简便等特点。为后续内源KDR激活的机制研究提供了可靠的技术平台。研究提供了可靠的技术平台。


技术研发人员：华进联 李文豪 吴晓龙 杨昕淳 李娜
受保护的技术使用者：西北农林科技大学
技术研发日：2023.08.01
技术公布日：2023/9/22