一种杨树MYBS2基因及其应用

一种杨树mybs2基因及其应用
技术领域
1.本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种杨树mybs2基因及其应用。


背景技术：

2.杨树(populus trichocarpa)作为全球范围内种植面积最为广泛的一种速生树种，同时也是我国重要的人工林组成树种之一，在为人们创造巨大的经济价值的同时也带来很大的生态和社会效益。前人研究发现mybs2在水稻的生长、胁迫耐受性、粒重和产量方面起重要作用。然而，截止目前，mybs2基因在木本植物中的相关研究未见报道。
3.基于此提出本发明。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种杨树mybs2基因及其应用。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
6.本发明提供了一种杨树mybs2基因，所述杨树mybs2基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
7.本发明还提供了一种扩增干扰所述杨树mybs2基因的引物组，所述引物组的正向引物如seq id no.2所示；
8.所述引物组的反向引物如seq id no.3所示。
9.本发明还提供了所述的引物组扩增得到的干扰片段，所述干扰片段如seq id no.4所示。
10.本发明还提供了所述的干扰片段在提高杨树生物量和抗逆性中的应用。
11.本发明还提供了一种干扰所述的杨树mybs2基因的rnai表达载体，所述rnai表达载体包括所述的干扰片段以及空载载体；
12.所述空载载体为含有35s启动子的pbwa(v)ks载体。
13.本发明还提供了一种所述的rnai表达载体的构建方法，包括如下步骤：
14.(6.1)以野生型杨树cdna为模板，利用所述的引物组进行扩增，得到所述的干扰片段；
15.(6.2)利用t4连接酶将步骤(6.1)得到的干扰片段与空载载体进行连接，得到连接产物；
16.(6.3)将连接产物转化大肠杆菌感受态，之后进行菌斑pcr鉴定试验，选取阳性条带对应的菌液涂布至含有卡那霉素的抗性培养基中，测序正确后，提取所述的质粒即rnai表达载体。
17.本发明还提供了所述的rnai表达载体或所述的构建方法构建得到的rnai表达载体在提高杨树生物量和抗逆性中的应用。
18.本发明还提供了一种重组菌，所述重组菌包括所述的rnai表达载体和受体菌株；
19.所述受体菌株为农杆菌lba4404。
20.本发明还提供了所述的重组菌在提高杨树生物量和抗逆性中的应用。
21.本发明还提供了一种用于提高杨树生物量和抗逆性的育种方法，包括如下步骤：
22.(10.1)将杨树无菌苗叶片和/或茎段置于所述重组菌的菌悬液中，浸泡6～10min，得到携带菌体的杨树外植体；
23.(10.2)将携带菌体的杨树外植体置于共培养培养基中，23～27℃培养2～3d，转接至筛选培养基中培养，得到抗性芽；
24.(10.3)切下抗性芽转接至生根培养基中，继续培养，待根系发育完整得到待移栽的转基因杨树苗；
25.所述共培养培养基以水为溶剂，包括如下浓度的组分:
26.4.0～5.0g/lms、28～32g/l蔗糖、1.5～2.5mg/l玉米素、0.8～1.2mg/l萘乙酸、7.0～8.0g/l琼脂；
27.所述共培养培养基的ph为5.8～6.0；
28.所述筛选培养基以水为溶剂，包括如下浓度的组分：
29.4.0～5.0g/lms、28～32g/l蔗糖、1.5～2.5mg/l玉米素、0.8～1.2mg/l萘乙酸、180～220mg/l特门汀、80～120mg/l卡那霉素、7.0～8.0g/l琼脂；
30.所述筛选培养基的ph为5.8～6.0；
31.所述生根培养基以水为溶剂，包括如下浓度的组分：
32.2.0～2.5g/lms、28～32g/l蔗糖、0.08～0.12mg/l萘乙酸、80～120mg/l特门汀、80～120mg/l卡那霉素、5.5～6.5g/l琼脂；
33.所述生根培养基的ph为5.8～6.0
。
34.本发明提供了一种杨树mybs2基因及其应用。rnai表达载体干涉mybs2表达后，杨树的高度、茎围、分枝数、干重和鲜重均得到提高，rnai杨树的鲜重和干重均是野生型植株的1.2倍；在干旱和盐胁迫条件下，野生型杨树植株生长状态的变化较rnai转基因杨树株系更为显著，其中干旱胁迫条件下的转基因杨树株系ri-2、ri-3比野生型植株生长快，可能杨树通过激发sod酶活性、促进mda、sp和抑制pro含量的积累来提高自身的耐旱能力。耐旱性较强的杨树其cat酶活性较高、pod酶活性较低、ss含量较低。ss含量低的原因可能是杨树通过消耗ss来抵抗干旱胁迫对细胞的损害。
附图说明
35.图1为rnai表达载体(a表示rnai表达载体图，b表示质粒酶切电泳图)。
36.图2为转基因杨树的遗传转化及鉴定(a表示杨树共培养；b表示转基因杨树抗性芽分化；c表示ri-1转基因杨树移栽前；d表示ri-1转基因杨树的pcr鉴定结果；maker：dl 1200 marker；p：阳性对照；wt-1：野生型植株；ri-1：第一批次转基因杨树阳性植株)。
37.图3为ri-2、ri-3、ri-4、ri-5、ri-6转基因杨树在移栽前的生长状况以及pcr鉴定结果。
38.图4为ri-1转基因杨树和野生型杨树的生长情况(a表示移栽前；b表示移栽第107天的表型；c表示移栽第107天的根系)。
39.图5为ri-1转基因杨树和野生型杨树农艺性状的测量情况(a表示转基因植株的株高；b表示转基因植株的直径；c表示转基因植株的分枝数；d表示转基因植株的节间数)。
40.图6为转基因杨树和野生型杨树mybs2在根、茎、叶中的相对表达量(a表示mybs2在根中的相对表达量；b表示mybs2在茎中的相对表达量；c表示mybs2在叶中的相对表达量)。
41.图7为转基因植株和野生型植株干旱处理20d的生长表型和株高(a表示处理前后的表型；b为处理前后株高)。
42.图8为转基因植株和野生型植株盐处理20d的生长表型和株高(a表示处理前后的表型；b为处理前后株高)。
43.图9为转基因植株和野生型植株干旱处理20d的sod、cat、pod活性(a表示sod活性；b表示cat活性；c表示pod活性)。
44.图10为转基因植株和野生型植株干旱处理20d的mda含量。
45.图11为转基因植株和野生型植株干旱处理20d的ss、sp、pro含量(a表示ss含量；b表示sp含量；c表示pro含量)。
46.图12为转基因植株和野生型植株盐处理20d的sod、cat、pod活性(a表示sod活性；b表示cat活性；c表示pod活性)。
47.图13为转基因植株和野生型植株盐处理20d的mda含量。
48.图14为转基因植株和野生型植株盐处理20d的ss、sp、pro含量(a表示ss含量；b表示sp含量；c表示pro含量)。
49.图15为转基因植株和野生型植株干旱处理20d后mybs2在根、茎、叶中的相对表达量(a表示mybs2在根中的相对表达量；b表示mybs2在茎中的相对表达量；c表示mybs2在叶中的相对表达量)。
50.图16为转基因植株和野生型植株盐处理20d后mybs2在根、茎、叶中的相对表达量(a表示mybs2在根中的相对表达量；b表示mybs2在茎中的相对表达量；c表示mybs2在叶中的相对表达量)。
具体实施方式
51.本发明实施例中所用的杨树为毛白杨无菌苗。
52.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
53.实施例1
54.转基因杨树苗的获得
55.(1)设计扩增干扰杨树mybs2基因的引物组：
56.所述mybs2基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
57.seq id no.1：
58.atggtaaaagaggcagcaagaaagtgctcccattgtggccaaaatggccataactcaagaacatgtactaaggattgtatcaaattgtttggggttagcattgaaaaacgtgaacaaacaattaaaggaagtgctagcttagataacatagcgtccttagatgacattcacggtgcacatcatgtcgatcccggctatagttccgacggcgttatcggttctaagagaggcagaacagcgtatacacggaagaaaggcaagccatggaccgaggaggagcatagaacatttttatccggtctaagcaatcttggcaagggcgattggagaggcatttcgaagaaatttgtgattactaggaccccaagtcaggttgctagtcatgcacagaagtattttctgagacagcaggcttcaaatgagaagaagaaacgtagatcaagcctctttgacatgaccttcaaaggaactgatctggcttctcatcaggatgctccgaaactgcctttaattaagacttgtgg
gagttcatcacaggctagcacctcttcagcttcaccattgaggaaagctggcgaggatatcccatcacaagctatcagcccattacacctcatcaaccaatttcctttgctttgcttgcacaatccccaggtcatgagtcctactgtcgcagccggtactggcgtttcaaactacaatccttgcatgcaacgagtccttgccaatggacggcggagctttccggcaagtaaagcagcaccctttgtctccatgatgaactatccaagggcctaccatccttacatgcttaacagccctgcaagcctggctggttgcgcaccttgtattgcccatcaaccatccggtatcccttcaccaagttcatttcctcagagcttttctccacaaggtgcttcaacttcattagcaaaaatggaagaccctcttgagcttaaaattggacaaccccctaaatccccccaaggagcaaatatatcatccccagcatctggtgccattagtgttatatga。
59.正向引物的两端加上bsal和eco31i酶切位点，反向引物的两端也加入bsal和eco31i酶切位点，并在引物5’端均加上cgat保护碱基。具体的引物序列如seq id no.2～3所示。
60.seq id no.2的序列为：ctcgtcaagaaggcgatagaag；
61.seq id no.3的序列为：cgttggctacccgtgatatt。
62.(2)rnai表达载体的构建
63.以野生型毛白杨的dna为模板(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)，用上述设置得到的seq id no.2～3的引物进行扩增，1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，得到204bp的扩增产物，该扩增产物即为干扰片段，所述干扰片段如seq id no.4所示。干扰片段水溶解后用t4连接酶和含35s启动子的pbwa(v)ks载体进行连接，将连接产物转化大肠杆菌感受态，转化涂kan(卡那霉素)抗性平板，之后进行菌斑pcr鉴定实验，目的条带是744bp的片段。选取阳性条带所对应的菌液涂布到含8mlkan抗性的lb培养基中，测序正确后所提取的质粒即为pbwa-35s-mybs2rnai表达载体，-20℃保存备用。rnai表达载体如图1a所示，质粒酶切电泳图如图1b所示。
64.seq id no.4：cagcaagaaagtgctcccattgtggccaaaatggccataactcaagaacatgtactaaggattgtatcaaattgtttggggttagcattgaaaaacgtgaacaaacaattaaaggaagtgctagcttagataacatagcgtccttagatgacattcacggtgcacatcatgtcgatcccggctatagttccgacggcgttatc。
65.(3)转基因杨树的获得
66.将pbwa-35s-mybs2 rnai表达载体转入农杆菌lba4404中，得到重组菌。采用农杆菌介导法遗传转化杨树，卡那霉素进行筛选。具体结果如下：
67.将重组菌接种到yep固体培养基(20mg/l rif、100mg/lkan)上，并将平板倒放在28℃恒温箱中培养2d。用无菌枪头挑选单菌落接种到10mlyep液体培养基(20mg/l rif、100mg/lkan中，于28℃，200rpm条件下振荡培养24h，吸取上述菌液1ml接种到20mlyep液体培养基(20mg/l rif、100mg/lkan)中，28℃，200rpm继续扩大培养。根据菌液浑浊度测定菌液od
600
值，将od
600
在0.3～0.5的菌液分装在离心管(10ml)中，4℃，5000rpm，离心10min，倒掉上清液，用重悬液重悬菌体得到重组菌的菌悬液。
68.rif表示利福平(称取5.0g rif粉末置于小烧杯中，加入少量甲醇和naoh(10mol/l)溶液充分溶解，去离子水定容至50ml，分装于无菌离心管中-20℃冷蔵贮存，待用)；
69.重悬液为：4.432g/l ms+30g/l蔗糖+100μmol/l乙酰丁香酮，使用酸碱调整ph至5.90
70.以毛白杨无菌苗叶片和茎段作为外植体，用无菌手术刀将叶片切成0.5cm
×
0.5cm小方块，浸没于重组菌的菌悬液中，浸泡8min(期间连续震荡，使菌液与叶片充分接触)，之
后用无菌吸水纸将杨树叶片上的菌液吸干，叶背朝上紧密排列于共培养培养基上，共培养如图2a所示，做好标记并用封口膜密封后放于25℃暗培养箱中共培养3d。留一些没有侵染重组菌的叶片和茎段作为对照，培养条件不变。
71.将经过暗培养的杨树叶片和茎段转接到筛选培养基中，25℃光照组培室中培养；培养基更换的频率是14d更换一次，及时将污染的培养基取走；将生长到1～2cm左右的抗性芽切下并转移到生根培养基中继续培养，抗性芽在生根培养基中分化如图2b所示。待杨树组培苗根系发育完整时进行炼苗2～3d后得到待移栽的转基因杨树苗，移栽前的生长状况如图2c所示。
72.所述共培养培养基以水为溶剂，包括4.43g/lms、30g/l蔗糖、2.00mg/l玉米素(zt)、1mg/l萘乙酸(naa)、7.5g/l琼脂粉。共培养培养基的ph为5.9。
73.所述筛选培养基以水为溶剂，包括4.43g/lms、30g/l蔗糖、2.00mg/l玉米素(zt)、1mg/l萘乙酸(naa)、200mg/l特门汀、100mg/lkan、7.5g/l琼脂粉。筛选培养基的ph为5.9。
74.所述生根培养基以水为溶剂，包括2.21g/lms、30g/l蔗糖、0.1mg/lnaa 100mg/l特门汀、100mg/lkan、6.0g/l琼脂粉。生根培养基的ph为5.90。
75.(4)pcr法检测转基因杨树
76.使用ctab法提取杨树dna，利用卡那霉素序列设计引物进行pcr鉴定，得到351bp的为转基因植株。pcr引物序列、反应体系和反应程序分别如表1、2、3所示：
77.表1 pcr引物序列
78.引物名称引物序列(5
’‑3’
)forwardgaatcgggagcggcgataccreverseccaccaagcgaaacatcgcat
79.forward如seq id no.5所示，reverse如seq id no.6所示。
80.表2 pcr扩增反应体系
[0081][0082][0083]
表3pcr扩增反应程序
[0084][0085]
pcr结果如图2～3所示，ri-1为第一个批次得到的转基因杨树；第二批次得到的转基因杨树为：ri-2、ri-3、ri-4、ri-5、ri-6。
[0086]
从图2～3的结果可以看出，ri-1和ri-2、ri-3、ri-4、ri-5、ri-6并没有差异。ri-1和ri-2、ri-3、ri-4、ri-5、ri-6中的mybs2基因均得到了干涉。
[0087]
实施例2
[0088]
转基因杨树农艺性状测定
[0089]
将上述得到的待移栽的转基因杨树苗进行移栽，从移栽后的第30天开始每隔7天对所获得的ri-1转基因杨树和野生型植株进行农艺性状的测量，用米尺测量其株高(cm)，游标卡尺测量植株10cm处的茎粗(mm)，并记录节间数和分枝数。第107d时将所获得的ri-1转基因杨树和野生型植株伐倒，测量其根、茎、叶的鲜重(根在称重前需用水洗净，后于恒温干燥箱中80℃干燥60h，当各个组织的重量恒定时，测量根、茎、叶的干重。实验结果如图4～5以及表4所示。
[0090]
表4rnai转基因杨树的干、鲜重
[0091][0092][0093]
图4～5以及表4显示，获得的ri-1转基因杨树株系在移栽前相对于野生型植株较矮小，但转基因杨树株系的高度在第65天超过野生型植株；10cm处的茎粗在第51天超过野生型植株；野生型植株在移栽第39天出现分枝，转基因株系在第42天出现分枝，且转基因株系的分枝数比野生型的多；转基因杨树的鲜重和干重均是野生型植株的1.2倍。这说明干涉mybs2基因的表达可提高转基因杨树株系的高度、茎围、分枝数、干重和鲜重。
[0094]
实施例3
[0095]
定量pcr检测
[0096]
分别采集野生型和转基因杨树叶片、茎段和根系，在液氮中速冻后采用ctab法提取杨树总rna。
[0097]
cdna的合成：
[0098]
提取获得的rna经第一链cdna合成试剂盒反转录为cdna，用于后期的定量分析，反应体系如表5所示。
[0099]
表5第一链cdna的合成
[0100]
试剂体积(μl)total rna50ng-5μgoligo(dt)18(0.5μg/μl)4μl5
×
true reaction mix4μlrnase free h2o to final volume20μl
[0101]
轻轻混匀，42℃孵育20min，85℃加热5min失活truescript h-rtase。所得cdna产物放到-80℃冰箱保存备用。
[0102]
real特门汀e-pcr反应：
[0103]
通过在线软件idt设计mybs2基因定量扩增引物，以毛白杨肌动蛋白基因(actin)作为内参基因。引物序列如表6和seq id no.7～10所示。荧光定量pcr实验在bio rad cfx connecttm实时定量pcr仪上进行操作。荧光定量pcr所用为南京诺唯赞通用型高灵敏度染料法定量pcr检测试剂盒，根据试剂盒上的使用说明，进行荧光定量pcr反应体系配置，10μl体系如下表7所示，荧光定量pcr反应程序如表8所示。每个cdna样品进行3次平行重复实验，相对表达量的计算使用2-δδct
。结果如图6所示。
[0104]
表6荧光定量pcr引物序列
[0105][0106]
表7荧光定量pcr反应体系
[0107]
组分体积(μl)cdna2引物f0.4引物r0.4evagreen 2
×
qpcr master mix10nuclease-free h2o7.2总体积20
[0108]
表8荧光定量pcr反应程序
[0109]
温度时间循环次数95℃3min195℃10sec4060℃20sec4072℃30sec40
[0110]
图6所示显示，与野生型植株相比，转基因植株根、茎、叶中mybs2基因的相对表达量均下调。其中野生型植株根、茎、叶中mybs2的相对表达量分别是ri-1株系根、茎、叶中的1.7倍、2.1倍和2.4倍，且在根中的相对表达量差异显著(0.01《p《0.05)。
[0111]
实验结果表明：通过抑制mybs2基因的表达，可使转基因植株中mybs2基因的相对表达量下调。
[0112]
实施例4
[0113]
非生物胁迫处理及生理指标测定
[0114]
选取移栽第56d的转基因杨树ri-2、ri-3、ri-4、ri-5和移栽56d的野生型株系，分成2组，干旱和盐胁迫处理组。每组包括1株野生型和2株转基因植株。干旱和盐胁迫处理的具体方法是每盆浇灌300ml 25％peg6000溶液和150mm nacl溶液，每隔5d浇灌一次。测量处理前后的植株株高，并在处理的第20d提取同一部位的叶片，测定超氧化物歧化酶(sod)、过氧化氢酶(cat)、过氧化物酶(pod)、丙二醛(mda)、可溶性糖(ss)、可溶性蛋白(sp)、脯氨酸(pro)活性或含量。具体结果如图7～14所示。
[0115]
图7～8显示，干旱和盐处理20d后，转基因杨树植株生长状态较野生型植株更好。野生型植株和转基因植株均出现叶片卷曲现象，但野生型植株的叶片卷曲较为严重，发生叶片卷曲的转基因植株中ri-2较ri-3严重，ri-4较ri-5严重。测量处理前后的植株株高发现，在干旱胁迫条件下，转基因株系ri-2和ri-3株高的生长比野生型的快，其中ri-3株高的生长比ri-2更快一些；在盐胁迫条件下，转基因株系ri-4和ri-5株高的生长比野生型的慢。
[0116]
实验结果表明：与野生型植株相比，转基因杨树植株在对干旱和高浓度盐环境的耐受能力更强，其中ri-3对干旱环境的耐受性较ri-2而言更高；ri-5对高浓度盐环境的耐受性较ri-4而言更高。而转基因株系ri-4和ri-5株高的生长比野生型的慢，其原因可能是ri-4和ri-5在在处理前的生长状态比较弱所导致。
[0117]
图9～11显示，干旱处理20d后，转基因植株ri-2、ri-3的sod酶活性高于野生型；ri-3株系的cat酶活性略高于野生型，ri-2株系低于野生型，差异均显著(0.01《p《0.05)；ri-2株系的pod酶活性高于野生型，ri-3的低于野生型，且差异也均显著(0.01《p《0.05)。转基因植株ri-2、ri-3的mda含量相对于野生型植株均增多，且差异显著(0.01《p《0.05)。转基因植株ri-2的ss含量高于野生型，ri-3植株的ss含量低于野生型，sp含量高于野生型，差异均显著(0.01《p《0.05)；ri-2和ri-3植株的pro含量均低于野生型，且差异极显著(p《0.01)。
[0118]
图12～14显示，盐处理20d后，转基因植株ri-4的sod酶活性高于野生型，ri-5植株的低于野生型；ri-4和ri-5植株的cat酶活性均低于野生型，差异极显著(p《0.01)；ri-4和ri-5的pod酶活性高于野生型，且差异显著(0.01《p《0.05)。转基因植株ri-4的mda含量有所增高，ri-5植株的mda含量有所降低，差异均显著(0.01《p《0.05)。转基因植株ri-4、ri-5的ss和sp含量都高于野生型植株，差异分别为显著(0.01《p《0.05)和极显著(p《0.01)；ri-4植株的pro含量高于野生型植株，ri-5植株的低于野生型植株。
[0119]
实验结果表明：在干旱胁迫条件下，抑制mybs2基因的表达可能影响了sod、cat和pod抗氧化酶活性、细胞膜透性mda含量、ss、sp和pro渗透调节物质的调节途径，具体表现在胁迫期间植物可能激发sod酶活性来提高自身的耐旱性。耐旱性较强的植物其cat酶活性较高、pod酶活性较低，促进mda和sp含量和抑制pro含量的积累来提高自身的耐旱性。耐旱性较强的植株其ss含量较低，可能是植物通过消耗ss来抵抗干旱胁迫对自身的损害。在盐胁迫条件下，抑制mybs2基因的表达可能影响了sod、cat和pod抗氧化酶活性、细胞膜透性mda含量、ss、sp和pro渗透调节物质的调节途径，具体表现在胁迫期间植物可能激发pod酶活性和抑制cat酶活性来提高自身的耐盐性。耐盐性较高的植物其sod酶活性降低幅度较小。耐盐性较强的植物其mda含量较低。大量促进ss和sp含量的积累来提高其耐盐性，且耐盐性较高的植物体内ss和sp含量积累较少。耐盐性较高的植物pro含量降低，耐盐性较低的植物pro含量小幅度升高。
[0120]
实施例5
[0121]
定量pcr检测
[0122]
按照实施例3的方法，反应体系、反应程序等步骤设置实施例5的方案。检测结果如图15～16所示。
[0123]
图15～16显示：干旱处理20d后，和野生型植株相比，两个转基因杨树ri-2、ri-3根、茎、叶片中mybs2的相对表达量均降低了，其中在茎中的相对表达量差异极显著(p《0.01)。盐处理20d后，和野生型植株相比，两个转基因杨树ri-4、ri-5根、茎、叶片中mybs2的相对表达量均降低了，其中在根中的相对表达量差异极显著(p《0.01)，在茎和叶中的相对表达量差异均显著(0.01《p《0.05)。
[0124]
实验结果表明：干旱和盐胁迫条件下，转基因杨树植株的耐受能力比与野生型植株强，且转基因杨树植株根、茎、叶中mybs2基因的相对表达量较低。
[0125]
由以上实施例可知，本发明提供一种杨树mybs2基因及其应用。rnai表达载体干涉mybs2表达后，杨树的高度、茎围、分枝数、干重和鲜重均得到提高，rnai杨树的鲜重和干重均是野生型植株的1.2倍；在干旱和盐胁迫条件下，野生型杨树植株生长状态的变化较rnai转基因杨树株系更为显著，其中干旱胁迫条件下的转基因杨树株系ri-2、ri-3比野生型植株生长快，可能杨树通过激发sod酶活性、促进mda、sp和抑制pro含量的积累来提高自身的耐旱能力。耐旱性较强的杨树其cat酶活性较高、pod酶活性较低、ss含量较低。ss含量低的原因可能是杨树通过消耗ss来抵抗干旱胁迫对细胞的损害，为后期转基因杨树的制备提供依据。
[0126]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种杨树mybs2基因，其特征在于，所述杨树mybs2基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。2.一种扩增干扰权利要求1所述杨树mybs2基因的引物组，其特征在于，所述引物组的正向引物如seq id no.2所示；所述引物组的反向引物如seq id no.3所示。3.权利要求2所述的引物组扩增得到的干扰片段，其特征在于，所述干扰片段如seq id no.4所示。4.权利要求3所述的干扰片段在提高杨树生物量和抗逆性中的应用。5.一种干扰权利要求1所述的杨树mybs2基因的rnai表达载体，其特征在于，所述rnai表达载体包括权利要求3所述的干扰片段以及空载载体；所述空载载体为含有35s启动子的pbwa(v)ks载体。6.一种权利要求5所述的rnai表达载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(6.1)以野生型杨树cdna为模板，利用权利要求2所述的引物组进行扩增，得到权利要求3所述的干扰片段；(6.2)利用t4连接酶将步骤(6.1)得到的干扰片段与空载载体进行连接，得到连接产物；(6.3)将连接产物转化大肠杆菌感受态，之后进行菌斑pcr鉴定试验，选取阳性条带对应的菌液涂布至含有卡那霉素的抗性培养基中，测序正确后，提取所述的质粒即rnai表达载体。7.权利要求5所述的rnai表达载体或权利要求6所述的构建方法构建得到的rnai表达载体在提高杨树生物量和抗逆性中的应用。8.一种重组菌，其特征在于，所述重组菌包括权利要求5所述的rnai表达载体和受体菌株；所述受体菌株为农杆菌lba4404。9.权利要求8所述的重组菌在提高杨树生物量和抗逆性中的应用。10.一种用于提高杨树生物量和抗逆性的育种方法，其特征在于，包括如下步骤：(10.1)将杨树无菌苗叶片和/或茎段置于权利要求8所述重组菌的菌悬液中，浸泡6～10min，得到携带菌体的杨树外植体；(10.2)将携带菌体的杨树外植体置于共培养培养基中，23～27℃培养2～3d，转接至筛选培养基中培养，得到抗性芽；(10.3)切下抗性芽转接至生根培养基中，继续培养，待根系发育完整得到待移栽的转基因杨树苗；所述共培养培养基以水为溶剂，包括如下浓度的组分:4.0～5.0g/lms、28～32g/l蔗糖、1.5～2.5mg/l玉米素、0.8～1.2mg/l萘乙酸、7.0～8.0g/l琼脂；所述共培养培养基的ph为5.8～6.0；所述筛选培养基以水为溶剂，包括如下浓度的组分：4.0～5.0g/lms、28～32g/l蔗糖、1.5～2.5mg/l玉米素、0.8～1.2mg/l萘乙酸、180～220mg/l特门汀、80～120mg/l卡那霉素、7.0～8.0g/l琼脂；
所述筛选培养基的ph为5.8～6.0；所述生根培养基以水为溶剂，包括如下浓度的组分：2.0～2.5g/lms、28～32g/l蔗糖、0.08～0.12mg/l萘乙酸、80～120mg/l特门汀、80～120mg/l卡那霉素、5.5～6.5g/l琼脂；所述生根培养基的ph为5.8～6.0。

技术总结
本发明涉及一种杨树MYBS2基因及其应用，属于基因工程技术领域。本发明提供了杨树MYBS2基因，所述杨树MYBS2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。利用RNAi技术降低杨树MYBS2基因表达后，杨树的高度、茎围、分枝数、干重和鲜重均得到提高；在干旱和盐胁迫条件下，野生型杨树植株生长状态的变化较转基因杨树株系更为显著，其中干旱胁迫条件下的RNAi转基因杨树比野生型植株生长快。表明杨树MYBS2基因的表达量和杨树生物量及抗逆性呈负相关，因此可以通过干涉杨树MYBS2基因的表达获得高产和抗逆性强的杨树新品种，具有良好的市场前景和经济价值。济价值。济价值。


技术研发人员：姚新转 吕立堂 田松群 唐湖 韦德兰
受保护的技术使用者：贵州大学
技术研发日：2023.08.03
技术公布日：2023/9/22