一种sgRNA、CRISPR/Cas9载体及其构建方法和用途与流程

一种sgrna、crispr/cas9载体及其构建方法和用途
技术领域
1.本发明属于分子技术领域，具体涉及一种sgrna、crispr/cas9载体及其构建方法和在apoe和ldlr双等位基因敲除的细胞株中的用途。


背景技术：

2.高脂血症是指血脂水平过高，可直接引起一些严重危害人体健康的疾病，如动脉粥样硬化、冠心病、胰腺炎等。低密度脂蛋白（low density lipoprotein receptor,ldlr），载脂蛋白e（apolipoproteine，apoe）是目前高脂血症的主效基因。近年来通过对apoe和ldlr基因编辑，构建高血脂动物模型，用于高血脂症研究不断取得重大发展。例如南京医科大学制备了apoe编辑巴马小型猪，中国农业科学院动物科学研究所制备了apoe和ldlr编辑巴马小型猪，中国农业科学院北京畜牧兽医研究所制备了pcsk9基因编辑五指山小型猪，这几种编辑猪，在断奶后，自发性血浆胆固醇（tc）水平是野生型的3~5倍，低密度脂蛋白胆固醇（ldl-c）是野生型的2~3倍。
3.基因编辑依赖于经过基因工程改造的crispr/cas9，也称“分子剪刀”，可以用它来清除、添加、激活或抑制其他生物体的目标基因，为治疗人类疾病提供了广阔的前景。在完全实现基于基因编辑的疾病研究愿景之前，研究人员面临的挑战也长期存在。过去的几十年间，在研究如何递送蛋白质和核酸时，科学人员们发明了多种基因传递技术，在基因编辑的过程中发挥了至关重要的作用，包括用于基因治疗的腺相关病毒载体和慢病毒载体，还包括用于递送蛋白质和核酸的脂质纳米粒以及非病毒载体。然而，这些载体的传递效率较为低下，靶向特异组织的能力不足，基因编辑效率低。例如cn113046388a公开了一种用于猪apoe和ldlr基因编辑的crispr/cas9系统，其对apoe编辑效率最高仅61%，对ldlr基因编辑效率最高仅33%。基因编辑效率低，导致高脂血症动物模型费时费力又费钱。


技术实现要素：

4.为解决上述问题，本发明提供了一种sgrna，它包括核苷酸序列如seq id no.2或seq id no.10所示的apoe-sgrna2，和核苷酸序列如seqid no.7或seq id no.15所示的ldlr-sgrna3。
5.本发明还提供了一种crispr/cas9载体，它是连接有与apoe-sgrna2对应的双链dna的载体，和连接有与ldlr-sgrna3对应的双链dna的载体；所述apoe-sgrna2的核苷酸序列如seq id no.2或seq id no.10所示；所述ldlr-sgrna3的核苷酸序列如seq id no.7或seqid no.15所示。
6.进一步地，所述载体为px458质粒载体。
7.本发明连接有与apoe-sgrna2对应的双链dna的载体可以在细胞内表达生成apoe-sgrna2；连接有与ldlr-sgrna3对应的双链dna的载体可以在细胞内表达生成ldlr-sgrna3；其中，apoe-sgrna2是引导cas9对apoe基因定点编辑的sgrna；
ldlr-sgrna3是引导cas9对ldlr基因定点编辑的sgrna。
8.本发明还提供了一种前述crispr/cas9载体的构建方法，它包括如下步骤：取与apoe-sgrna2对应的双链dna，插入到px458质粒载体中；取与ldlr-sgrna3对应的双链dna，插入px458质粒载体中，即得；所述apoe-sgrna2的核苷酸序列如seqidno.2或seqidno.10所示；所述ldlr-sgrna3的核苷酸序列如seqidno.7或seqidno.15所示。
9.本发明还提供了一种前述crispr/cas9载体在制备apoe和ldlr双等位基因敲除的细胞株或动物中的用途。
10.进一步地，所述细胞珠包括五指山猪耳成纤维细胞；所述动物包括五指山猪。
11.本发明还提供了一种apoe和ldlr双等位基因敲除的细胞株的构建方法，它包括如下步骤：取前述crispr/cas9载体共转染五指山猪耳成纤维细胞，富集带绿色荧光细胞并培养，测序鉴定获得apoe和ldlr双等位基因敲除的细胞株。
12.本发明有益效果为：本发明用于apoe和ldlr双等位基因敲除的sgrna及其应用，通过特定的sgrna构建的crispr/cas9系统，在apoe或ldlr双等位基因编辑效率均达60%以上，apoe和ldlr两基因双等位基因编辑效率达30%以上，提高了apoe和ldlr双基因编辑效率，降低了apoe和ldlr双等位基因敲除细胞株的构建成本，具体实际推广应用价值。
13.显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
14.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
15.图1apoe-sgrna编辑效率验证测序结果；图2ldlr-sgrna编辑效率验证测序结果；图35个apoe和ldlr两基因双等位基因编辑的单细胞克隆测序结果；图4apoe和ldlr基因编辑克隆五指山猪耳成纤维细胞第7天爬出情况；图5apoe和ldlr基因编辑克隆五指山猪耳成纤维细胞传后细胞生长情况；图6apoe和ldlr基因编辑克隆五指山猪耳成纤维细胞的发育情况。
具体实施方式
16.实施例1apoe、ldlr双基因编辑细胞系和应用研究1.1设计靶向apoe和ldlr基因的crispr/cas9敲除载体及验证其编辑效率参照ncbi中猪apoe（geneid:396801）和ldlr（geneid:397576）基因序列信息，利用单链导向rna(singleguiderna,sgrna)在线设计网站(http://crispr.mit.edu/)针对apoe第二外显子和ldlr第三外显子分别设计4个sgrna靶向位点，合成sgrna对应的两条（编码链和非编码链）短dna序列并添加粘性末端，退火成双链(94℃,
10min;37℃,10min，4℃，保存)。用bbsⅰ限制性内切酶对px458载体（带gfp荧光标记）做酶切回收，将酶切回收后的线性化载体与退火配对成双链的dna序列进行连接，进一步转化和涂板，经测序确认后，获得连接准确的crispr/cas9载体（如下表1所示）。
17.利用0.1%的胰酶消化生长状态良好的五指山猪耳成纤维细胞（ef），1200rpm离心后，弃上清。用100μl电转液重悬细胞，每5
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105个细胞混合单个crispr/cas9载体，混匀后转移至电转杯中，经lonza核转染仪进行电转染，电击后的细胞接种至100mm细胞培养皿中，用含有20%fbs的dmem继续培养细胞48h。利用0.1%的胰酶消化将电转的细胞分别消化成成单细胞悬液，经流式分选，分别收集带gfp绿色荧光的细胞。分别提取gfp阳性细胞的基因组dna，进行pcr扩增。分别在两个sgrna作用位点两侧设计引物，如下：sus-apoe-id-f（seqidno.17）：5
’‑
ttctaatgcgttgttgcctgg-3’；sus-apoe-id-r（seqidno.18）：5
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acaaggacagaaggaaacccg-3’；产物大小为556bp；sus-ldlr-id-f（seqidno.19）:5
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aaaggggagctcgctactca-3’；sus-ldlr-id-r（seqidno.20）：5
’‑
gagcctcacttcatgaaagacat-3’；产物大小为699bp；pcr扩增体系如下：上、下游引物(10pmol/μl)各1μl；基因组dna0.5μg，premixlataq10μl，灭菌蒸馏水补至20μl。pcr反应条件：95℃5min；(95℃30s,53℃30s,68℃20s)
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32cycles；68℃5min；16℃保存。纯化回收pcr产物进行ta克隆，培养12h后，随机测序25个以上的单菌落，将测序结果与野生型基因序列进行比对，统计各个sgrna的crispr/cas9载体的编辑效率。结果如下表1所示，测序结果见图1和图2。
18.表1apoe和ldlr基因的sgrna及其编辑效率
注：seqidno.1~8是sgrna在载体上的核苷酸序列，seqidno.9~16是sgrna在细胞内的核苷酸序列。
19.1.2细胞转染筛选及单克隆鉴定将有效编辑效率最高的apoe-sgrna2和ldlr-sgrna3载体（带gfp荧光标记）共转染ef，流式细胞仪富集带绿色荧光细胞，按100个细胞/每皿接种到100mm细胞培育皿中，培养15d左右，将单细胞克隆转入48孔细胞培养板中继续进行培养，待细胞增长到80%~90%时，取部分细胞用于基因敲除鉴定。细胞裂解液法提取细胞基因组dna，pcr测序分析基因敲除类型，将apoe和ldlr双等位基因敲除的单细胞克隆冻存，用于后续体细胞核移植实验。鉴定25个克隆点，其apoe和ldlr双等位基因编辑效率和两基因双等位基因编辑编辑效率如表2下所示，apoe和ldlr两基因双等位基因编辑效率为20%，获得的apoe和ldlr两基因双等位基因编辑的单细胞克隆5个，其基因型如表3所示。测序结果见图3。
20.表2apoe和ldlr双等位基因编辑效率和两基因双等位基因编辑效率表3apoe和ldlr双等位基因敲除的单细胞克隆的基因型
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1.3apoe和ldlr基因编辑克隆猪的制备及鉴定随机选择3种apoe和ldlr双基因编辑型细胞（即a19，a3和a4）作为核供体、体外成熟的卵母细胞去核后作为受体，进行体细胞核移植获得重构胚。重构胚培养12-24h后，手术法将发育状态良好的胚胎移入自然发情0-1d的后备母猪输卵管内，在胚胎移28d及60db超检测妊娠情况，受体母猪妊娠114d左右产仔。采集出生仔猪耳组织样品提取基因组dna，pcr扩增产物送测序，鉴定分析仔猪apoe和ldlr基因编辑的类型。
21.3种apoe和ldlr双基因编辑型细胞的胚胎移植和怀孕分娩情况如表4，所示，a19、a3和a4细胞的每头代孕母猪平均胚胎移植数分别为91,83和117，怀孕率大于60%。此外，a19、a3和a4细胞克隆生产的仔猪数量、其对应编号和基因型如表5所示，仔猪基因型和细胞一致。
22.表43种apoe和ldlr双基因编辑型细胞的胚胎移植和怀孕分娩情况表5apoe和ldlr基因编辑型克隆仔猪的编号和基因类型1.4apoe和ldlr基因编辑克隆五指山猪的表型检测：分别采集2月龄和5月龄的apoe和ldlr基因编辑型和野生型（wt）五指山猪血液，3500rpm，15min离心分离并收集血清，检测其血脂指标，即总胆固醇（tc）、甘油三酯（tg）、低密度脂蛋白胆固醇（ldl-c）、高密度脂蛋白胆固醇（hdl-c）。血脂检测结果，如下表6和表7，所示，a3、a4和a19细胞克隆获得的仔猪在2月和5月龄时血清中tc和ldl-c水平均显著高于wt猪，同时其tg和hdl-c与wt猪无显著差异，证明了，a3、a4和a19细胞克隆获得的apoe和
ldlr基因编辑型猪，在没有高脂饮食干扰下，其高血脂表型稳定。特别地，a19细胞克隆获得的apoe和ldlr基因编辑型猪，其tc是wt猪8~9倍，其ldl-c是野生型猪的11~13倍。
23.表62月apoe和ldlr基因编辑型和野生型五指山猪血液血脂指标检测结果表75月apoe和ldlr基因编辑型和野生型五指山猪血液血脂指标检测结果1.5apoe和ldlr基因编辑克隆五指山猪耳成纤维细胞的原代分离培养酒精棉擦拭猪耳，粗剪表皮毛发，大剪刀剪下1-2cm
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耳组织，在猪耳伤口处用碘酒消毒；精剪和刀片刮去耳组织表面毛发，酒精中浸泡2-5min，转移至dmem中，低温带回实验室。将耳组织放入75%酒精中，浸泡清洗2~3min。酒精灯灼烧刀片和眼科镊，在培养皿中进一步刮去耳毛，将处理过的耳组织移入新的培养皿中，将组织从中切开，暴露出组织中的软骨，脂肪等，并刮去，只剩表皮。将表皮反复浸入5%双抗的dmem中（分别放在几个培养皿里），眼科镊轻敲表皮，震荡杂质，直至液体清亮。将表皮移入空皿中，滴入几滴dmem，保持湿润，用眼科剪剪碎表皮至≤1mm。往剪碎的表皮中，加入适量的胎牛血清混匀，将组织碎块平分于t-25瓶（标记好细胞类型和日期）有斜面的一面，并将组织碎块均匀平铺，翻转后，沿t-25另一面加入5ml含20%fbs，5%ps的dmem，使得组织块一面向上，放入培养箱，约8小时翻瓶，即轻轻将t-25瓶上下颠倒，让培养液能够浸泡组织。隔一天换一次完全培养液，一般在翻瓶后7天会有较多细胞爬出（细胞爬出如图4所示），待细胞大量长出时，传代、使用或冻存。
24.（1）apoe和ldlr基因编辑克隆五指山猪耳成纤维细胞的传代培养待步骤(1)中的原代细胞大量长出时，将原液体培养基倒掉，用预热至37.5℃的加1%青链双抗的dpbs（杜氏磷酸缓冲液）洗涤1次，加入0.1%胰蛋白酶消化细胞，再加入2倍体积的完全培养基（含20%fbs的dmem），终止消化，吸打成单细胞悬液，按5*106传代10cm细胞培养皿中，培养于37.5℃、饱和湿度、5%co2的培养箱内，apoe和ldlr基因编辑克隆五指山猪耳成纤维细胞传后细胞生长情况，如图5所示，细胞呈典型长梭形、三角形等。
25.（2）apoe和ldlr基因编辑克隆五指山猪耳成纤维细胞的冻存、复苏与存活率测定待传代细胞的汇合度近达到90%时，去除废弃培养基，dpbs洗涤，0.1%胰酶消化为单细胞悬液，转移到新鲜灭菌的15ml离心管内，在台式离心机上以1200rpm、5min将细胞聚集于管底，彻底去除上清，加入细胞冻存液。冻存液的配方为dmem：胎牛血清：dmso=6:3:1，将细胞与冻存液轻柔混匀后，转移入冻存管中，注意标明日期和样品名称，将冻存管，冻存步骤，按照4℃，30min
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负20℃，30min
→
负80℃超低温冰箱内冻存过夜，第二天将细胞转移到液氮内长期保存。
26.从液氮内取出公母各1管冻存的细胞，迅速置于37.5℃温水浴内不断摇晃使其融化。吸出细胞悬液加到15ml无菌离心管中，补加5倍体积的完全培养基（含20%fbs的dmem），轻轻摇晃混匀，在台式离心机上以1200rpm、5min将细胞聚集于管底，彻底去除上清，加入适量体积的完全培养基（含20%fbs的dmem），轻轻摇晃混匀吸出细胞后加到培养瓶内，培养于37.5℃、饱和湿度、5%co2的培养箱内。采用台盼蓝斥染法计算细胞存活率。取出适量细胞加到台盼蓝染液内，光学显微镜下计数蓝色细胞数，细胞存活率的计算公式为：存活率=(1-蓝色细胞数/总细胞数)
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100%，细胞存活率为：89.2%。
27.（3）apoe和ldlr基因编辑克隆五指山猪耳成纤维细胞的重编程能力将步骤(1)分离到细胞通过核移植的方法，注射到去核的体外成熟猪卵母细胞内，经过融合、激活、体外培养，在显微镜下观察重构胚的卵裂和囊胚发育情况，评价其发育能力，即重编程能力。apoe和ldlr基因编辑克隆五指山猪耳成纤维细胞的发育情况如下图6所示，卵裂率为77.6%，囊胚率为23.7%。
28.综上，本发明通过特定的sgrna构建的crispr/cas9系统，在apoe或 ldlr双等位基因编辑效率均达60%以上，apoe和ldlr两基因双等位基因编辑效率达30%以上，提高了apoe和ldlr双基因编辑效率，及构建apoe和ldlr双等位基因敲除细胞株的动物模型的成功率，降低了apoe和ldlr双等位基因敲除细胞株的构建成本，具体实际推广应用价值。

技术特征：
1.一种sgrna，其特征在于：它包括核苷酸序列如seq id no.2或seq id no.10所示的apoe-sgrna2，和核苷酸序列如seq id no.7或seq id no.15所示的ldlr-sgrna3。2.一种crispr/cas9载体，其特征在于：它是连接有与apoe-sgrna2对应的双链dna的载体，和连接有与ldlr-sgrna3对应的双链dna的载体；所述apoe-sgrna2的核苷酸序列如seq id no.2或seq id no.10所示；所述ldlr-sgrna3的核苷酸序列如seq id no.7或seq id no.15所示。3.根据权利要求2所述的crispr/cas9载体，其特征在于：所述载体为px458质粒载体。4.一种权利要求2或3所述crispr/cas9载体的构建方法，其特征在于，它包括如下步骤：取与apoe-sgrna2对应的双链dna，插入到px458质粒载体中；取与ldlr-sgrna3对应的双链dna，插入px458质粒载体中，即得；所述apoe-sgrna2的核苷酸序列如seq id no.2或seq id no.10所示；所述ldlr-sgrna3的核苷酸序列如seq id no.7或seq id no.15所示。5.权利要求2或3所述crispr/cas9载体在制备apoe和ldlr双等位基因敲除的细胞株中的用途。6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述细胞株包括五指山猪耳成纤维细胞。7.一种apoe和ldlr双等位基因敲除的细胞株的构建方法，其特征在于：它包括如下步骤：取权利要求2所述crispr/cas9载体转染五指山猪耳成纤维细胞，富集带绿色荧光细胞并培养，测序鉴定获得apoe和ldlr双等位基因敲除的细胞株。

技术总结
本发明属于分子技术领域，具体提供了一种sgRNA、CRISPR/Cas9载体及其构建方法和用途，其中sgRNA包括核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.10所示的APOE-sgRNA2，和核苷酸序列如SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.15所示的LDLR-sgRNA3。本发明通过特定的sgRNA构建的CRISPR/Cas9系统，在APOE或LDLR双等位基因编辑效率均达60%以上，APOE和LDLR两基因双等位基因编辑效率达30%以上，提高了APOE和LDLR双基因编辑效率，降低了APOE和LDLR双等位基因敲除细胞株的构建成本，具体实际推广应用价值。具体实际推广应用价值。具体实际推广应用价值。


技术研发人员：杜嘉祥
受保护的技术使用者：成都中科奥格生物科技有限公司
技术研发日：2023.08.18
技术公布日：2023/9/22