对类胡萝卜素具有高亲和性的核酸适配体及其应用

1.本发明涉及对类胡萝卜素具有高亲和性的核酸适配体及其应用，属于类胡萝卜素检测技术领域。


背景技术：

2.类胡萝卜素是一类四萜结构的化合物及其衍生物的总称，它是由8个类异戊二烯单位组成，呈黄色、橙红色或红色的色素。类胡萝卜素分为胡萝卜素和叶黄素两大类，胡萝卜素只含有碳、氢两种元素，而叶黄素是指含有含氧官能团的衍生物。类胡萝卜素是广泛存在于植物中的天然有机化合物，是植物生长和发育过程中的重要色素之一。类胡萝卜素在人类生长发育过程中发挥着重要的营养功能，天然的叶黄素是视网膜中黄斑色素的重要组成部分，可以过滤蓝光，防止视网膜受损。类胡萝卜素还具有较强的抗氧化能力，可以有效清除体内的自由基减缓细胞氧化损伤，延缓衰老，能预防和治疗许多由于细胞或组织内过量的氧自由基所导致疾病的发生，对于预防慢性疾病如心脑血管疾病、癌症等具有潜在作用。类胡萝卜素在人体自身无法合成，也很难通过化学方法合成，人体每天须靠摄入一定量外源类胡萝卜素补充消耗的类胡萝卜素。
3.高效液相色谱法和紫外吸收光谱法是目前针对类胡萝卜素的传统检测方法，但这些方法通常需要复杂的样品前处理步骤，时间长、耗费成本高，且易受其他物质的影响，导致检测结果有较大误差；同时，这些检测方法对不同类胡萝卜素的检测灵敏度不一，难以全面准确地评估样品中类胡萝卜素的含量。因此，为实现对多种类胡萝卜素的有效检测，有必要研发对类胡萝卜素具有高亲和性的核酸适配体。
4.核酸适配体是通过体外筛选技术selex（systematic evolution of ligands by exponential enrichment）得到的，是一类具有特定识别能力的单链核苷酸，可以实现对各种靶标的高特异性和高亲和性结合。核酸适配体能够折叠形成特定的三维空间结构，例如发夹、假结和g-四链体等，进而可以与靶标进行高特异性和亲和性结合。基于核酸适配体的生物传感技术已被广泛应用在生物医药研究、生物加工过程产物分析等诸多领域。目前尚未见到关于针对多种类胡萝卜素的适配体的研究报道。


技术实现要素：

5.针对上述现有技术，本发明提供了对类胡萝卜素具有高亲和性的核酸适配体及其应用，属于类胡萝卜素检测技术领域。在现存适配体大多以截短的方式对适配体进行优化改造的基础上，本发明提供了一种新的改造方法，通过对原适配体β-5裂开、二倍嵌合，然后进行末端锁定的改造方式，得到了对靶标具有更高亲和力的适配体，并赋予了适配体“类特异性”，能特异性地与多种类胡萝卜素相结合。
6.本发明是通过以下技术方案实现的：一种对类胡萝卜素具有高亲和性的核酸适配体，为两段裂开型适配体tf-2a、tf-2b，其核苷酸序列如seq id no.2、seq id no.3所示。
7.进一步地，所述类胡萝卜素选自岩藻黄素、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、玉米黄质和叶黄素中的任意一种或两种以上。
8.所述对类胡萝卜素具有高亲和性的核酸适配体在检测、分离、富集类胡萝卜素中的应用。
9.本发明还提供了另外一种对类胡萝卜素具有高亲和性的核酸适配体，为两段裂开型适配体β5-2a、β5-2b，其核苷酸序列如seq id no.4、seq id no.5所示。
10.进一步地，所述类胡萝卜素为岩藻黄素。
11.所述对类胡萝卜素具有高亲和性的核酸适配体在检测、分离、富集类胡萝卜素中的应用。
12.适配体tf-2a的核苷酸序列如下所示（方向5
’‑3’
，如seq id no.2所示）：cggcgggttcagctcagaagcttgatcctcccacaattatcacgtagtgcagctcagaagcttgatcctcccacaattatcacgtagtgttcccgccg；共计98个碱基。
13.适配体tf-2b的核苷酸序列如下所示（方向5
’‑3’
，如seq id no.3所示）：ggcgggtttgcgggtcacgcaatctgacgactcgaagtcgtgcatctgtgcgggtcacgcaatctgacgactcgaagtcgtgcatctgttcccgcc；共计96个碱基。
14.适配体β5-2a的核苷酸序列如下所示（方向5
’‑3’
，如seq id no.4所示）：cagctcagaagcttgatcctcccacaattatcacgtagtgcagctcagaagcttgatcctcccacaattatcacgtagtg；共计80个碱基。
15.适配体β5-2b的核苷酸序列如下所示（方向5
’‑3’
，如seq id no.5所示）：tgcgggtcacgcaatctgacgactcgaagtcgtgcatctgtgcgggtcacgcaatctgacgactcgaagtcgtgcatctg；共计80个碱基。
16.本发明对原适配体β-5进行了改造，得到了对类胡萝卜素具有更高亲和性的核酸适配体。本发明根据对原适配体β-5二级结构的预测，在简单裂开的基础上，进一步对原适配体β-5进行二倍嵌合及末端锁定，使得改造后的适配体对靶标有了更好的亲和性，并且对多种类胡萝卜素都具有识别能力。本发明提出的全新的适配体改造方法，为同时检测多种类胡萝卜素开辟了新的途径，对实现类胡萝卜素的检测、分离、富集等具有重要意义。
17.本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。
附图说明
18.图1：岩藻黄素原适配体β-5的二级结构示意图。
19.图2：适配体β5-a的二级结构示意图。
20.图3：适配体β5-b的二级结构示意图。
21.图4：适配体β5-2a的二级结构示意图。
22.图5：适配体β5-2b的二级结构示意图。
23.图6：适配体tf-2a的二级结构示意图。
24.图7：适配体tf-2b的二级结构示意图。
25.图8：原适配体β-5、各适配体与岩藻黄素的亲和性检测结果示意图，其中，a为原适配体β-5的测定结果；b为适配体β5-a、5-b的测定结果；c为适配体β5-2a、β5-b的测定结果；d为适配体β5-a、β5-2b的测定结果；e为适配体β5-2a、β5-2b的测定结果；f为适配体tf-2a、
tf-2b的测定结果。
26.图9：适配体tf-2a、tf-2b分别对α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、玉米黄质、叶黄素、虾青素、番茄红素的生物膜干涉分子相互作用仪测定结果示意图，其中，a、b、c、d、e、f依次表示α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、玉米黄质、叶黄素、虾青素、番茄红素的测定结果。
具体实施方式
27.下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域技术人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
28.下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法、检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法、检测方法。
29.本发明测定适配体序列对靶标的亲和性，采用的是生物膜干涉分子相互作用仪。生物膜干涉分子相互作用仪是一种常见的用来定量描述分子之间相互作用强弱的分析仪器。其原理是生物膜相互干涉技术，在目前研究生物分子间的相互作用中占据着重要的地位。
30.通过生物素与链霉亲和素的结合将适配体固定在传感器表面。将反应的缓冲溶液、生物素标记的不同浓度适配体、不同浓度的靶标加入96孔板中，仪器设定的程序为传感器平衡120 s，适配体固定180 s，传感器平衡120 s，靶标结合300 s，靶标解离300 s，温度25℃，频率为2 hz。对得到的结合-解离曲线进行拟合可以得到亲和力常数（kd值）。
31.实施例1 岩藻黄素原适配体β-5的优化岩藻黄素原适配体β-5的核苷酸序列如下所示（方向5
’‑3’
，如seq id no.1所示）：cagctcagaagcttgatcctcccacaattatcacgtagtgtgcgggtcacgcaatctgacgactcgaagtcgtgcatctg；共计80个碱基。
32.通过在线分析工具the mfold web server预测原适配体β-5的二级结构，发现二级结构中含有4个茎环结构，从5’端开始依次进行编号，如图1所示。
33.生物膜干涉分子相互作用仪的实验结果表明，原适配体β-5与岩藻黄素之间的亲和力常数为34μm。为了得到更加优化的适配体，对适配体序列进行裂开处理。
34.茎环结构对适配体和靶标的结合起着重要的作用，根据对适配体二级结构的模拟，选择在尽量不破坏茎环结构的原则下对原适配体β-5进行裂开，最终选择在原适配体β-5的40号g和41号t之间裂开，裂开后得到的两段裂开型适配体为β5-a、β5-b（如seq id no.6、seq id no.7所示）。图2、图3显示了在线工具the mfold web server对适配体β5-a、5-b的二级结构预测图，适配体β5-a、β5-b各包含2个茎环。
35.适配体β5-a的核苷酸序列如下所示（方向5
’‑3’
，如seq id no.6所示）：cagctcagaagcttgatcctcccacaattatcacgtagtg；共计40个碱基；适配体β5-b的核苷酸序列如下所示（方向5
’‑3’
，如seq id no.7所示）：tgcgggtcacgcaatctgacgactcgaagtcgtgcatctg；共计40个碱基。
36.生物膜干涉分子相互作用仪的实验结果表明，适配体β5-a、5-b与岩藻黄素之间的亲和力常数为34.3μm，可见，将原适配体β-5裂开后，仍保持和原适配体β-5相似的亲和力。
这种变化是因为在裂开时保留了与结合相关的茎环部分，裂开后对两个茎环的结构几乎没有产生影响。
37.基于上述实验结果，对适配体β5-a、β5-b进行二倍嵌合优化，得到嵌合型适配体β5-2a、β5-2b（如seq id no.4、seq id no.5所示），图4、图5显示了在线工具the mfold web server对适配体β5-2a、β5-2b的二级结构预测图，各包含4个茎环。
38.生物膜干涉分子相互作用仪的实验结果表明，适配体β5-2a、β5-2b与岩藻黄素之间的亲和力常数为16.5μm，亲和力得到显著的提升。
39.基于上述实验结果，为了提高适配体在溶液环境中的稳定性，进一步对适配体进行末端锁定优化，得到了两条末端锁定式适配体tf-2a、tf-2b（如seq id no.2、seq id no.3所示），图6、图7显示了在线工具the mfold web server 对适配体tf-2a、tf-2b的二级结构预测图，各包含4个茎环。
40.生物膜干涉分子相互作用仪的实验结果表明，适配体tf-2a、tf-2b与岩藻黄素之间的亲和力常数为3.12μm，相较于原适配体β-5提升了近11倍。
41.原适配体β-5、各适配体组合与岩藻黄素的亲和性检测结果如图8所示。
42.结论：原适配体β-5裂开后得到的适配体β5-a、β5-b，对岩藻黄素的亲和力几乎没有变化，说明裂开后对适配体与靶标的结合没有产生太大的影响。在此基础上，进行二倍嵌合，得到的适配体β5-2a、β5-2b对岩藻黄素的亲和力提高了2倍，说明二倍嵌合协同作用对适配体和靶标的亲和力提高有帮助，这可能是因为经过嵌合后的适配体拥有了更多的茎环结构，结合位点增加，使得适配体与靶标的亲和力提高。随后为了稳定适配体的构象，通过增加gc碱基对实现末端锁定策略锁定适配体的构象，经过末端锁定的适配体tf-2a、tf-2b对岩藻黄素的亲和力得到了显著提升，为3.12μm，推断末端锁定改造限制了适配体的过度折叠，促进关键碱基参与折叠成稳定位点，提高了对靶标的亲和力。
43.实施例2 适配体tf-2a、tf-2b的特异性实验为了验证适配体tf-2a、tf-2b的特异性，使用在检测过程中可能会出现的几种类胡萝卜素做特异性实验。
44.利用适配体tf-2a、tf-2b分别对α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、玉米黄质、叶黄素、虾青素和番茄红素进行生物膜干涉分子相互作用仪测定，结果如图9所示，适配体tf-2a、tf-2b与α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、玉米黄质、叶黄素之间的亲和力常数分别为1.34μm、8.01μm、50μm、2.24μm。结果表明：适配体tf-2a、tf-2b对α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、玉米黄质、叶黄素均有良好的亲和力；适配体tf-2a、tf-2b与虾青素无法产生特异性结合；适配体tf-2a、tf-2b与番茄红素无法产生特异性结合。
45.给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。

技术特征：
1.一种对类胡萝卜素具有高亲和性的核酸适配体，其特征在于：为两段裂开型适配体tf-2a、tf-2b，其核苷酸序列如seq id no.2、seq id no.3所示。2.根据权利要求1所述的对类胡萝卜素具有高亲和性的核酸适配体，其特征在于：所述类胡萝卜素选自岩藻黄素、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、玉米黄质和叶黄素中的任意一种或两种以上。3.权利要求1所述的对类胡萝卜素具有高亲和性的核酸适配体在检测、分离、富集类胡萝卜素中的应用。4.一种对类胡萝卜素具有高亲和性的核酸适配体，其特征在于：为两段裂开型适配体β5-2a、β5-2b，其核苷酸序列如seq id no.4、seq id no.5所示。5.根据权利要求4所述的对类胡萝卜素具有高亲和性的核酸适配体，其特征在于：所述类胡萝卜素为岩藻黄素。6.权利要求4所述的对类胡萝卜素具有高亲和性的核酸适配体在检测、分离、富集类胡萝卜素中的应用。

技术总结
本发明公开了对类胡萝卜素具有高亲和性的核酸适配体及其应用，属于类胡萝卜素检测技术领域。所述对类胡萝卜素具有高亲和性的核酸适配体，为两段裂开型适配体TF-2A、TF-2B，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示。或为两段裂开型适配体β5-2A、β5-2B，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示。所述对类胡萝卜素具有高亲和性的核酸适配体在检测、分离、富集类胡萝卜素中的应用。本发明通过对原适配体β-5裂开、二倍嵌合，然后进行末端锁定的改造方式，得到了对靶标具有更高亲和力的适配体，对实现类胡萝卜素的检测、分离、富集具有重要意义。有重要意义。有重要意义。


技术研发人员：王赛 魏凯悦 毛相朝
受保护的技术使用者：中国海洋大学
技术研发日：2023.08.22
技术公布日：2023/9/22