一种预防和/或治疗胃肠道相关疾病的益生菌剂及其应用的制作方法

1.本发明属于微生物技术领域，涉及一种预防和/或治疗胃肠道相关疾病的益生菌剂及其应用。


背景技术：

2.抗菌肽（antimicrobial peptide，amp）是一类具有微生物活性的免疫调节活性的多肽类小分子物质，一般含12-50个氨基酸残基，带正电荷、呈两亲性分子结构，具有抗细菌、抗真菌、抗病毒等作用，同时也能在机体内发挥重要的调控作用，又称为宿主防御肽。目前，已经从昆虫、植物、动物和微生物等中鉴定出多种不同的抗菌肽。
3.乳酸菌如链球菌、双歧杆菌和罗伊氏乳杆菌等乳杆菌能产生种类繁多的amp。乳酸菌产生的细菌素等抗菌肽对病原菌和食品腐败菌具有很强的抑制能力，具有相对固定的抗菌谱，在这类物质中，分子量小、热稳定好的amp被公认在食品、保健品和药品等领域最具有开发和应用前景。
4.抗生素的单一靶点、长期广泛使用导致的耐药性的出现，正成为临床感染管理的一大挑战。相反，amp通过作用于病原菌的质膜和细胞内多个靶点而显示出优势，并且对耐药细菌有很强的活性，为抗生素提供了一种新的替代品，目前关于apm的开发已成为本领域热点之一。如cn112646743a公开了预防和缓解溃疡性结肠炎的罗伊氏乳杆菌ccfm1134及其应用，公开罗伊氏乳杆菌ccfm1134能耐受人体胃肠环境，显著减少溃疡性结肠炎患病期间体重减轻，改善粪便性状和便血情况，改善结肠粘膜损伤，降低mpo活性，减少结肠中促炎因子tnf-α，il-1β，il-6，ifn-γ含量，上调结肠紧密连接相关蛋白claudin-3、zo-1、zo-2和occludin的转录水平，上调抗菌肽reg3g、reg3b的转录水平，上调结肠中黏蛋白muc2的转录水平，提高肠道菌群多样性，可应用于制备改善溃疡性结肠炎症状的功能性发酵食品。
5.综上所述，开发能够产amp的微生态活菌制剂，能够有效改善胃肠道疾病，是目前亟待解决的技术问题之一。


技术实现要素：

6.针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种预防和/或治疗胃肠道相关疾病的益生菌剂及其应用，尤其提供一种预防和/或治疗肠道炎症和结直肠癌的益生菌剂及其应用。
7.为达上述目的，本发明采用以下技术方案：第一方面，本发明提供一种预防和/或治疗胃肠道相关疾病的益生菌剂，所述益生菌剂中的菌株包括罗伊氏乳杆菌和长双歧杆菌；所述罗伊氏乳杆菌为罗伊氏乳杆菌lactobacillus reuteri lr08菌株，于2020年07月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no. 1.12733；所述长双歧杆菌为长双歧杆菌长亚种bifidobacterium longum subsp. longum bl11菌株，于2022年02月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no. 24412，保藏地址为：北
京市朝阳区北辰西路1号院3号。
8.本发明中，发现lactobacillus reuteri lr08菌株和bifidobacterium longum subsp. longum bl11菌株，二者协同配合，其能够抑制验证因子如tnf-a、il-6和il-10水平，缓解肠道炎症；调控肠组织中抗菌蛋白相关基因的表达水平，包括抑制eg3γ和remlβ基因表达水平，上调tff3基因表达水平，对粘液层功能和肠道修复功能具有改善作用；能够调控肠道紧密连接蛋白zo-1、occludin表达量上升，缓解细菌感染小鼠的肠道屏障功能损伤；能够明显抑制结直肠癌细胞的生长；具备广阔的应用前景。
9.优选地，所述罗伊氏乳杆菌lactobacillus reuteri lr08菌株与长双歧杆菌长亚种bifidobacterium longum subsp. longum bl11菌株的活菌数之比为(1~3):(1~3)，例如可以是3:1、2:1或1:1等等。
10.优选地，所述胃肠道相关疾病包括肠道炎症和/或结直肠癌。
11.优选地，所述益生菌剂中活菌数不低于1
×
10
9 cfu/ml。
12.优选地，所述益生菌剂的剂型包括冻干粉剂、胶囊剂、片剂或颗粒剂。
13.优选地，所述益生菌剂中还包括冻干保护剂。
14.优选地，所述冻干保护剂包括脱脂乳、明胶、糊精、阿拉伯胶、右旋糖酐、藻胶钠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、乳糖、海藻糖、山梨醇或木糖醇中的任意一种或至少两种的组合。
15.优选地，所述益生菌剂中还包括功能助剂。
16.优选地，所述功能助剂包括低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、低聚异麦芽糖、大豆低聚糖、菊粉、螺旋藻、节旋藻、云芝多糖、水苏糖、聚葡萄糖、α-乳淸蛋白或乳铁蛋白中的任意一种或至少两种的组合。
17.第二方面，本发明提供一种预防和/或治疗胃肠道相关疾病的制剂，所述制剂包括罗伊氏乳杆菌lactobacillus reuteri lr08菌株生产的抗菌肽和长双歧杆菌长亚种bifidobacterium longum subsp. longum bl11菌株生产的抗菌肽。
18.优选地，所述罗伊氏乳杆菌lactobacillus reuteri lr08菌株生产的抗菌肽和长双歧杆菌长亚种bifidobacterium longum subsp. longum bl11菌株生产的抗菌肽的质量比为(1~3):(1~3)，例如可以是3:1、2:1或1:1等等。
19.第三方面，本发明提供罗伊氏乳杆菌和长双歧杆菌组合在制备预防和/或治疗胃肠道相关疾病的产品中的应用，所述罗伊氏乳杆菌为罗伊氏乳杆菌lactobacillus reuteri lr08菌株，于2020年07月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no. 1.12733，所述长双歧杆菌为长双歧杆菌长亚种bifidobacterium longum subsp. longum bl11菌株，于2022年02月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no. 24412，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
20.本发明中，所述罗伊氏乳杆菌是已被纳入《可用于食品的菌种名单》的一种益生菌，因此，本发明筛选得到的罗伊氏乳杆菌lr08对人体而言，相对安全，且不易产生不良反应。
21.优选地，所述胃肠道相关疾病包括肠道炎症和/或结直肠癌。
22.优选地，所述产品包括药物、功能性发酵食品或功能性菌剂中的任意一种。
23.优选地，所述产品中活菌数不低于1
×
10
9 cfu/ml。
24.优选地，所述产品含有罗伊氏乳杆菌和长双歧杆菌的冻干粉。
25.优选地，所述罗伊氏乳杆菌和长双歧杆菌的冻干粉的制备方法包括：分别将所述罗伊氏乳杆菌或长双歧杆菌接种于液体mrs的培养基中进行培养；培养液离心，得到菌体；将菌体用冻干保护剂重悬，得到重悬液；对重悬液冻干，将两种冻干粉混合；或者，将所述罗伊氏乳杆菌和长双歧杆菌接种于液体mrs的培养基中进行培养；培养液离心，得到菌体；将菌体用冻干保护剂重悬，得到重悬液；对重悬液冻干。
26.优选地，所述mrs培养基以浓度计包括：蛋白胨0-15 g/l、牛肉膏0-15 g/l、葡萄糖15-25 g/l、酵母粉3-7 g/l、柠檬酸氢二铵1-3 g/l、k2po4·
3h2o 2-3 g/l、mgso4·
7h2o 0.05-0.2 g/l、mnso
4 0.01-0.1 g/l、吐温80 0.5-2 ml/l、半胱氨酸氨酸盐0.1-1 g/l。
27.优选地，所述冻干的方法包括真空冷冻法。
28.第四方面，本发明提供lactobacillus reuteri lr08菌生产的抗菌肽和bifidobacterium longum subsp. longum菌生产的抗菌肽组合在制备预防和/或治疗胃肠道相关疾病的产品中的应用，所述lactobacillus reuteri lr08菌于2020年07月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no. 1.12733，所述bifidobacterium longum subsp. longum bl11于2022年02月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no. 24412。
29.优选地，所述胃肠道相关疾病包括肠道炎症和/或结直肠癌。
30.优选地，抗菌肽的制备方法包括：将lactobacillus reuteri lr08菌或bifidobacterium longum subsp. longum bl11菌接种于培养基中进行培养，取发酵液并收集上清液，对上清液进行过滤，将lactobacillus reuteri lr08菌生产的抗菌肽和bifidobacterium longum subsp. longum bl11菌生产的抗菌肽混合；或，将lactobacillus reuteri lr08菌和bifidobacterium longum subsp. longum bl11菌接种于培养基中进行培养，取发酵液并收集上清液，对上清液进行过滤。
31.优选地，所述lactobacillus reuteri lr08菌生产的抗菌肽和bifidobacterium longum subsp. longum bl11菌生产的抗菌肽的质量比为(1~3):(1~3)，例如可以是3:1、2:1或1:1等等。
32.优选地，所述培养基以浓度计包括：蛋白胨0-15 g/l、牛肉膏0-15 g/l、葡萄糖15-25 g/l、酵母粉3-7 g/l、柠檬酸氢二铵1-3 g/l、k2po4·
3h2o 2-3 g/l、mgso4·
7h2o 0.05-0.2 g/l、mnso
4 0.01-0.1 g/l、吐温80 0.5-2 ml/l、半胱氨酸氨酸盐0.1-1 g/l。
33.优选地所述过滤包括使用0.22~0.45 μm孔径滤膜过滤。
34.第五方面，本发明提供第一方面所述的预防和/或治疗胃肠道相关疾病的益生菌剂或第二方面所述的预防和/或治疗胃肠道相关疾病的制剂在制备炎症因子抑制剂中的应用。
35.第六方面，本发明提供第一方面所述的预防和/或治疗胃肠道相关疾病的益生菌剂或第二方面所述的预防和/或治疗胃肠道相关疾病的制剂在制备以非疾病诊断和/或治疗为目的的炎症因子抑制剂中的应用。
36.根据本发明的研究结果，第一方面所述的预防和/或治疗胃肠道相关疾病的益生
菌剂或第二方面所述的预防和/或治疗胃肠道相关疾病的制剂具有显著地抑制炎症因子的作用，因此，该结果表明可以作为一种以非诊断和/或治疗为目的的炎症因子抑制剂，用于科研领域。
37.第七方面，本发明提供第一方面所述的预防和/或治疗胃肠道相关疾病的益生菌剂或第二方面所述的预防和/或治疗胃肠道相关疾病的制剂在制备结直肠癌细胞增殖抑制剂中的应用。
38.第八方面，本发明提供第一方面所述的预防和/或治疗胃肠道相关疾病的益生菌剂或第二方面所述的预防和/或治疗胃肠道相关疾病的制剂在制备以非诊断和/或治疗为目的的结直肠癌细胞增殖抑制剂中的应用。
39.根据本发明的研究结果，第一方面所述的预防和/或治疗胃肠道相关疾病的益生菌剂或第二方面所述的预防和/或治疗胃肠道相关疾病的制剂具有显著地抑制结直肠癌细胞增殖，因此，该结果表明可以作为一种以非诊断和/或治疗为目的的结直肠癌细胞增殖抑制剂，用于科研领域，例如研究更多的结直肠癌细胞生长和代谢机制或行为、筛选治疗结直肠癌的药物等等。
40.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明创造性地发现产抗菌肽的罗伊氏乳杆菌lactobacillus reuteri lr08和bifidobacterium longum subsp. longum bl11菌协同配合，能够显著改善胃肠道相关疾病，具体表现在：（1）显著改善细菌感染导致的肠道炎症；（2）显著改善细菌感染导致的肠道屏障功能受损；（3）能够有效抑制人结直肠癌细胞生长。因此，将其用于制备用于预防和/或治疗胃肠道疾病的产品具有很好的前景。
附图说明
41.图1为实施例2中抗菌肽溶血率结果图；图2为实施例2中细胞存活率结果图；图3为实施例3中小鼠存活率结果图；图4为实施例3中小鼠体重变化结果图；图5为实施例3中小鼠血清细胞因子水平结果图；图6为实施例3中小鼠结肠组织中抗菌蛋白相关基因的表达水平结果图；图7为实施例3中小鼠结肠紧密连接蛋白zo-1、occludin的蛋白表达水平结果图；图8为实施例4中结直肠癌细胞活力结果图；图9为实施例5中小鼠血清细胞因子水平结果图；图10为实施例5中小鼠结肠紧密连接蛋白zo-1、occludin的蛋白表达水平结果图。
具体实施方式
42.为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
43.实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买
获得的常规产品。
44.本发明实施例中涉及的蛋白胨、牛肉膏、葡萄糖、酵母粉、柠檬酸氢二铵、k2po4·
3h2o、mgso4·
7h2o、mnso4、吐温80和半胱氨酸氨酸盐购自国药集团化学试剂有限公司。
45.本发明实施例中涉及的培养基如下：改良mrs培养基（g/l）：蛋白胨10 g/l、牛肉膏10 g/l、葡萄糖20 g/l、酵母粉5 g/l、柠檬酸氢二铵2 g/l、k2po4·
3h2o 2.6g/l、mgso4·
7h2o 0.1g/l、mnso
4 0.05g/l、吐温80 1 ml/l、半胱氨酸氨酸盐0.5 g/l。
46.本发明实施例所涉及的罗伊氏乳杆菌命名为罗伊氏乳杆菌lactobacillus reuteri lr08菌株，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2020年07月20日，保藏编号为cgmcc no. 1.12733；所述长双歧杆菌为长双歧杆菌长亚种bifidobacterium longum subsp. longum bl11，于2022年02月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no. 24412，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
实施例1
47.本实施例制备罗伊氏乳杆菌lr08抗菌肽（plr08）和bifidobacterium longum subsp. longum bl11抗菌肽。
48.将保存的罗伊氏乳杆菌lr08接种到mrs琼脂平板，37℃培养24 h，菌株在mrs培养基上转接两次，以便菌株活力得到恢复，挑取单菌落接种于mrs液体培养基上，37℃培养24 h，于4℃、8000 r/min离心20 min，弃沉淀，上清液用0.22 μm孔径滤膜过滤除菌得到粗提抗菌肽，用冻干法浓缩备用，即为抗菌肽plr08。
49.将保存的长双歧杆菌bl11接种到mrs琼脂平板，37℃培养24 h，菌株在mrs培养基上转接两次，以便菌株活力得到恢复，挑取单菌落接种于mrs液体培养基上，37℃培养24 h，于4℃、8000 r/min离心10 min，弃沉淀，上清液用0.22 μm孔径滤膜过滤除菌得到粗提抗菌肽，用冻干法浓缩备用，即为抗菌肽pbl11。
实施例2
50.本实施例探究产抗菌肽的罗伊氏乳杆菌lr08安全性评价。
51.通常，昆虫源和蛙源的抗菌肽抗菌活性较强，例如蜂毒素，蜂毒素含有26个氨基酸残基，具有典型的两亲性α-螺旋结构，结构稳定。低浓度的蜂毒素即可达到杀菌的效果，然而蜂毒素具有的较高溶血性和细胞毒性等副作用，降低了其使用价值。抗菌肽plr08的安全性以蜂毒素为对照肽。
52.（1）细胞溶血活性的测定：参考已有文献方法（zweytick d, deutsch g, andr
äꢀ
j, blondelle se, vollmer e, jerala r, lohner k. studies on lactoferricin-derived escherichia coli membrane-active peptides reveal differences in the mechanism of n-acylated versus nonacylated peptides. j biol chem. 2011 jun 17;286(24):21266-76.），将1 ml人新鲜血液置于离心机中离心(1000 g，10 min)，pbs缓冲液冲洗收集到的红细胞，用10 ml pbs重悬细胞，96孔板中，前10孔中各添加50 μl红细胞悬液，再分别加入pbs稀释后的10个浓度梯度(256~0.5 μmol/l：0.5、1、2、4、8、16、32、64、128、
256)抗菌肽plr08；阳性对照：分别加入50 μl的0.01%聚乙二醇辛基苯基醚(triton x-100)和红细胞悬液；阴性对照：分别加入50 μl的pbs缓冲液和红细胞悬液；37
°
c培养1 h后，10 min离心取上清液，检测od
570nm
处吸光值。溶血率计算：溶血率(%)=（a-a0）/（at-a0）
×
100%【式中，a：抗菌肽样品试验组吸光值；at：阳性对照组吸光值；a0：阴性对照组吸光值】。
53.结果如图1所示，由图1可知，当肽浓度在1~256 μmol/l之间，plr08溶血率明显小于蜂毒素，蜂毒素的溶血率在0-120%之间，对比蜂毒素，益生菌抗菌肽plr08的溶血率一直小于5%，表明其溶血性很低。
54.（2）细胞毒性测试：使用mtt法，复苏人肾上皮293细胞（北纳生物），置37
°
c下5% co2的培养箱中，用dmem传代培养至对数生长期，制成单细胞悬液，稀释抗菌肽plr08参考（1），加入50 μl制备好的单细胞悬液。阳性对照：只添加单细胞悬液。阴性对照：既不添加单细胞悬液，也不添加抗菌肽。在5% co2培养箱(37
°
c，24 h)中，分别添加40 μl mtt溶液培养4 h后，添加150 μl dmso溶液，振荡10 min，检测od
492nm
值，计算细胞存活率，具体方法为：细胞存活率（%）=（od
样品
ꢀ‑ꢀ
od
背景
）/（od
对照
ꢀ‑ꢀ
od
背景
）
×
100%，其中：od样品是接受处理的细胞样品的吸光度值；od背景是只含培养基或试剂的背景吸光度值；od对照是未经任何处理的对照样品（未受处理的细胞）的吸光度值。
55.细胞存活率结果如图2所示，由图2可知，当肽浓度为1~64 μmol/l时，plr08对细胞的毒性明显小于蜂毒素，说明益生菌所产的抗菌肽plr08对细胞生长的影响很小，细胞存活率较高，使用相同方法对抗菌肽pbl11进行测试，结果相近。
实施例3
56.本实施例探究来源于罗伊氏乳杆菌lr08的抗菌肽plr08对细菌感染小鼠肠道炎症和肠道屏障的影响。
57.（1）动物分组和建立细菌感染小鼠模型：大肠杆菌菌悬液的制备：大肠杆菌e.coli购于北纳生物（菌株号bncc336902），接种环挑取bncc336902划线于lb琼脂平板，37
°
c培养18 h；单菌落接种于4 ml lb液体培养基中，37
°
c，250 rpm，摇床震荡10 h；吸取100 μl菌悬液转接至10 ml lb液体培养基中，37
°
c，250 rpm，摇床震荡2 h，吸光值od
600nm
约为0.5，细菌浓度为3
×
108cfu/ml，再离心（5000 rpm，3 min）去上清；加入3 ml无菌pbs溶液重悬细菌，最后得到bncc336902菌悬液浓度为1
×
109cfu/ml。
58.模型建立：21日龄雌性断奶的c57bl/6j小鼠50只，由上海实验动物中心提供。将小鼠饲养于笼内，环境清洁安静，温度23~25℃，湿度50%~70%。所有涉及小鼠的程序均符合上海市实验动物护理与动物实验中心提供的指导原则（许可证号2022122007），自由摄食饮水，预饲3天。预饲3天后将30只断奶小鼠随机分成5组，每组10只。小鼠饲料均购于上海斯莱克实验动物有限责任公司。对照组（ctl组）：正常饲料；模型组（mc组）：1
×
108cfu bncc336902菌；抗菌肽plr08干预组（p1）：1
×
108cfu bncc336902菌 + plr08（每只小鼠腹腔注射5.0 mg/kg 抗菌肽plr08）；抗菌肽干预组（p2）：1
×
108cfu bncc336902菌 + 长双歧杆菌抗菌肽（每只小鼠腹腔注射5.0 mg/kg 抗菌肽pbl11）；抗菌肽组合干预组（p3）：1
×
108cfu bncc336902菌 + 抗菌肽pbl11和抗菌肽plr08组合（抗菌肽pbl11和抗菌肽plr08质量比为1:3，每只小
鼠腹腔注射5.0 mg/kg 抗菌肽组合）每天干预1次，连续3天；试验期间每天观察记录各组小鼠的精神状态和行为，将染菌小鼠和未染菌小鼠隔离饲养，称重并计算存活率。
59.结果如图3和图4所示，对比mc组，对照组、p1组以及p3组小鼠在整个试验期未出现死亡，p2组仅出现一只死亡，且存活小鼠行为表现正常。使用e.coli感染后，染菌小鼠表现出不同程度的反应迟钝等症状且存活率明显降低至60%，死亡了4只小鼠。在干预期间，小鼠的体重变化各不相同，其中对比对照组，mc组小鼠体重显著下降，抗菌肽pbl11干预后小鼠体重下降得到缓和，而抗菌肽plr08干预后，小鼠体重有所回升，使用抗菌肽pbl11和抗菌肽plr08组合干预后，基本可以恢复正常水平。
60.（2）样品采集：小鼠眼球采血，血液存于离心管中，4
°
c，3000 g离心15 min，收集血清，-20
°
c保存。
61.（3）血清细胞因子测定：采用酶联免疫吸附试剂盒检测血清中细胞因子tnf-a、il-6和il-10，试剂盒购于武汉纯度生物，具体的实验步骤按照试剂盒说明书进行。
62.结果如图5所示，与对照组相比，mc组小鼠被e.coli感染后小鼠血清中促炎细胞因子tnf-a、il-6和il-10含量均显著升高，而抗菌肽plr08或抗菌肽pbl11干预后，小鼠血清中细胞因子tnf-a、il-6和il-10含量显著降低，基本可以恢复正常水平，即抗菌肽能够缓解肠道炎症，此外，使用抗菌肽plr08和抗菌肽pbl11组合干预，利用二者协同配合，缓解效果进一步提高。
63.（4）实时荧光定量pcr检测：利用trizol法提取小鼠结肠组织rna并反转录为cdna，利用实时荧光定量pcr法检测结肠组织中抗菌蛋白相关基因的表达水平。具体方法和引物设计由上海生工有限公司协助。
64.结果如图6所示，利用实时荧光定量pcr检测肠道抗菌相关蛋白reg3γ、remlβ、tff3的基因表达。与对照组相比，mc组小鼠结肠中reg3γ和remlβ基因表达水平明显升高，tff3水平有所下调，而抗菌肽的干预作用下，plr08组小鼠情况有所逆转，reg3γ和remlβ基因表达水平下降，并趋于正常。而tff3基因表达水平明显上升了。reg家族是关键的抗菌蛋白，reg3主要在小鼠和人的小肠组织中表达，同时大肠组织发生病原体感染或炎症时也会条件性表达，该实验结果表明，mc小鼠的reg3γ相对表达量明显升高，而抗菌肽plr08或抗菌肽pbl11治疗后，该表达明显下降，且二者组合使用效果更佳。肠道直接与外环境接触，定植着大量微生物。肠道上皮细胞分泌的抗菌蛋白在维持肠道上皮与正常微生物菌群稳态中扮演着重要角色。remlβ在先天免疫和宿主防御过程中发挥着重要作用，染菌小鼠remlβ基因表达水平异常升高，而抗菌肽治疗后，能够缓解这种异常情况，并趋向正常水平。tff3由粘液分泌细胞产生，其在肠道粘液层功能和粘膜修复功能中发挥重要作用，抗菌肽的干预可以有效提高染菌小鼠的结肠粘液层厚度，粘液层覆盖在肠道上皮表面，是保护肠道上皮完整性的一道重要防线。该实验结果显示，抗菌肽的干预可能对粘液层功能和肠道修复功能具有改善作用。
65.（5）western blot检测：使用免疫学测定方法western blot检测小鼠结肠紧密连接蛋白zo-1、occludin的
蛋白表达水平。
66.结果如图7所示，肠道上皮屏障是动物肠道抵抗细菌入侵的第一道防线，对比对照组，染菌组小鼠肠道紧密连接蛋白zo-1、occludin表达降低，从而会导致肠道通透性上升，严重破坏肠道上皮屏障功能。而益生菌抗菌肽作用后，肠道紧密连接蛋白zo-1、occludin表达量有明显的回升，即抗菌肽plr08或抗菌肽pbl11能够缓解e.coli感染小鼠的肠道屏障功能损伤，且二者组合使用效果更佳。
实施例4
67.本实施例验证抗菌肽plr08对人结直肠癌细胞生长的影响。
68.细胞培养：人结肠腺癌细胞系sw480（bncc100604）购自北纳生物。细胞在添加10%胎牛血清、100 u/ml青霉素和100μg/ml链霉素的leibovitz’s l-15(gibco)培养基中培养。
69.mtt检测：用抗菌肽plr08处理的细胞，用mtt法测定细胞活力。将不同浓度的抗菌肽plr08分别加入或不加入20 μm z-vad-fmk，倒入每个载4
×
104细胞的培养板中，37℃孵育24 h，取出培养液，加入pbs缓冲盐，然后mtt溶液(0.5 mg/ml) (sigma)孵育4h后，取出mtt溶液，加入100 μl dmso继续孵育10 min。以pbs为对照，通过elisa测定od
565nm
值。细胞活力测定为细胞活力%=实验组od值/对照组od值。
70.长双歧杆菌抗菌肽和抗菌肽组合（pc组）处理参考上述操作。
71.结果如图8所示，通过mtt检测法测定了益生菌抗菌肽plr08在处理过的人结肠腺癌细胞sw480上的抗扩散能力，抗菌肽plr08或抗菌肽pbl11的干预能够明显抑制癌细胞的生长，且二者组合使用效果更佳。
实施例5
72.本实施例探究来源于罗伊氏乳杆菌lr08和长双歧杆菌为bl11对细菌感染小鼠症状的改善。
73.（1）动物分组和建立细菌感染小鼠模型同实施例3：大肠杆菌菌悬液的制备同实施例3；罗伊氏乳杆菌lr08、长双歧杆菌长亚种bl11以及lr08和bl11组合组菌悬液的制备：将各菌株分别接种于脱脂乳中，37℃下培养18 h进行活化，得到活化液；将活化液按2%（v/v）的接种量接种于mrs液体培养基中（组合组按lr08和bl11比例3:1接种），37℃下培养18 h，得到菌液；稀释即得。
74.模型建立：21日龄雌性断奶的c57bl/6j小鼠50只，由上海实验动物中心提供。将小鼠饲养于笼内，环境清洁安静，温度23~25℃，湿度50%~70%。所有涉及小鼠的程序均符合上海市实验动物护理与动物实验中心提供的指导原则（许可证号2022122007），自由摄食饮水，预饲3天。预饲3天后将30只断奶小鼠随机分成5组，每组10只。小鼠饲料均购于上海斯莱克实验动物有限责任公司。对照组（ctl组）：正常饲料；模型组（mc组）：1
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108cfu bncc336902菌；lr08干预组（lr08）：1
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108cfu bncc336902菌 + 1
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108cfu lr08；干扰组（bl11）：1
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108cfu bncc336902菌 + 1
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108cfu bl11；组合干扰组（lr08+bl11）：1
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108cfu bncc336902菌 + 1
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108cfu (lr08+bl11) 每天干预1次，连续3天；试验期间每天观察记录各组小鼠的精神状态和行为，将染菌小鼠和未染菌小鼠隔离饲养。采用酶联免疫吸附试剂
盒检测血清中细胞因子tnf-a、il-6和il-10，试剂盒购于武汉纯度生物，具体的实验步骤按照试剂盒说明书进行（参照实施例3）。使用免疫学测定方法western blot检测小鼠结肠紧密连接蛋白zo-1、occludin的蛋白表达水平（参照实施例3）。
75.结果如图9所示，与对照组相比，mc组小鼠被e.coli感染后小鼠血清中促炎细胞因子tnf-a、il-6和il-10含量均显著升高，而益生菌lr08或bl11干预后，小鼠血清中细胞因子tnf-a、il-6和il-10含量显著降低，基本可以恢复正常水平，即益生菌lr08能够缓解肠道炎症。另外，当lr08+bl11组合作用时，逆转的效果更突出。
76.结果如图10所示，肠道上皮屏障是动物肠道抵抗细菌入侵的第一道防线，对比对照组，染菌组小鼠肠道紧密连接蛋白zo-1、occludin表达降低，从而会导致肠道通透性上升，严重破坏肠道上皮屏障功能。而益生菌作用后，肠道紧密连接蛋白zo-1、occludin表达量有明显的回升，即lr08和bl11均能够缓解e.coli感染小鼠的肠道屏障功能损伤。另外，当lr08+bl11组合作用时，修复肠道屏障功能损伤的效果更突出。
77.综上所述，本技术首次发现产抗菌肽的罗伊氏乳杆菌lactobacillus reuteri lr08菌株和长双歧杆菌长亚种bifidobacterium longum subsp. longum bl11菌株能够有效应用于制备改善胃肠道相关疾病的产品，能够显著改善细菌感染导致的肠道炎症、显著改善细菌感染导致的肠道屏障功能受损以及有效抑制人结直肠癌细胞生长，具备广阔的应用前景。
78.申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

技术特征：
1.一种预防和/或治疗胃肠道相关疾病的益生菌剂，其特征在于，所述益生菌剂中的菌株包括罗伊氏乳杆菌和长双歧杆菌；所述罗伊氏乳杆菌为罗伊氏乳杆菌lactobacillus reuteri lr08菌株，于2020年07月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no. 1.12733；所述长双歧杆菌为长双歧杆菌长亚种bifidobacterium longum subsp. longum bl11菌株，于2022年02月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no. 24412。2.根据权利要求1所述的预防和/或治疗胃肠道相关疾病的益生菌剂，其特征在于，所述罗伊氏乳杆菌lactobacillus reuteri lr08菌株与长双歧杆菌长亚种bifidobacterium longum subsp. longum bl11菌株的活菌数之比为(1~3):(1~3)。3.根据权利要求1所述的预防和/或治疗胃肠道相关疾病的益生菌剂，其特征在于，所述益生菌剂中活菌数不低于1
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10
9 cfu/ml。4.根据权利要求1所述的预防和/或治疗胃肠道相关疾病的益生菌剂，其特征在于，所述益生菌剂的剂型包括冻干粉剂、胶囊剂、片剂或颗粒剂。5.根据权利要求1所述的预防和/或治疗胃肠道相关疾病的益生菌剂，其特征在于，所述益生菌剂中还包括冻干保护剂；所述冻干保护剂包括脱脂乳、明胶、糊精、阿拉伯胶、右旋糖酐、藻胶钠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、乳糖、海藻糖、山梨醇或木糖醇中的任意一种或至少两种的组合。6.根据权利要求1所述的预防和/或治疗胃肠道相关疾病的益生菌剂，其特征在于，所述益生菌剂中还包括功能助剂；所述功能助剂包括低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、低聚异麦芽糖、大豆低聚糖、菊粉、螺旋藻、节旋藻、云芝多糖、水苏糖、聚葡萄糖、α-乳淸蛋白或乳铁蛋白中的任意一种或至少两种的组合。7.一种预防和/或治疗胃肠道相关疾病的制剂，其特征在于，所述制剂包括罗伊氏乳杆菌lactobacillus reuteri lr08菌株生产的抗菌肽和长双歧杆菌长亚种bifidobacterium longum subsp. longum bl11菌株生产的抗菌肽。8.根据权利要求7所述的预防和/或治疗胃肠道相关疾病的制剂，其特征在于，所述罗伊氏乳杆菌lactobacillus reuteri lr08菌株生产的抗菌肽和长双歧杆菌长亚种bifidobacterium longum subsp. longum bl11菌株生产的抗菌肽的质量比为(1~3):(1~3)。9.权利要求1-6中任一项所述的预防和/或治疗胃肠道相关疾病的益生菌剂或权利要求7-8中任一项所述的预防和/或治疗胃肠道相关疾病的制剂在制备炎症因子抑制剂中的应用。10.权利要求1-6中任一项所述的预防和/或治疗胃肠道相关疾病的益生菌剂或权利要求7-8中任一项所述的预防和/或治疗胃肠道相关疾病的制剂在制备结直肠癌细胞增殖抑制剂中的应用。

技术总结
本发明公开了一种预防和/或治疗胃肠道相关疾病的益生菌剂及其应用。所述益生菌剂包括罗伊氏乳杆菌LR08菌株和长双歧杆菌BL11菌株。本申请首次发现产抗菌肽的罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri LR08菌株和长双歧杆菌长亚种Bifidobacterium longum subsp.Longum BL11菌株组合能够有效应用于制备改善胃肠道相关疾病的产品，能够显著改善细菌感染导致的肠道炎症、显著改善细菌感染导致的肠道屏障功能受损以及有效抑制人结直肠癌细胞生长，具备广阔的应用前景。具备广阔的应用前景。具备广阔的应用前景。


技术研发人员：方曙光 董瑶 司文瑾 盖忠辉
受保护的技术使用者：微康益生菌（苏州）股份有限公司
技术研发日：2023.08.24
技术公布日：2023/9/22