一种促进糖尿病溃疡愈合的褐藻多糖的制备及应用

一种促进糖尿病溃疡愈合的褐藻多糖的制备及应用
一、技术领域
1.本发明是涉及一种新型的sargassum kjellmanianum来源的褐藻多糖(sarp)在糖尿病溃疡方面的应用，属于中药领域。
二、

背景技术：

2.糖尿病足溃疡是糖尿病患者最严重的并发症之一，是糖尿病患者致残，甚至致死的重要原因之一，不但给患者造成痛苦，而且使其增添了巨大的经济负担。据统计，糖尿病患者在其一生中有15％的人会发生足溃疡，全球每30秒会有1条腿因糖尿病足而截肢。糖尿病足溃疡的病因复杂，目前尚无有效的治疗手段。现有的治疗药物临床治愈率低，治疗周期长。更为严重的是是糖尿病足溃疡5年复发率高，使得现有的治疗药物的疗效大大降低，因此寻找新型的治疗糖尿病足溃疡的药物迫在眉睫。
3.褐藻多糖，主要来源于褐藻植物细胞壁中，主要存在于海带、泡叶藻、巨藻、墨角藻等海藻中，具有水溶性，没有细胞毒，没有免疫原性等独特优势。据报道，褐藻多糖具有抗炎、抗氧化等非常良好的生物活性，已被广泛应用于食品、药品等领域。本发明中sargassum kjellmanianum来源的褐藻多糖(sarp)是我们分离的一种新型结构的褐藻多糖，具有较高的甘露糖醛酸。我们对其治疗糖尿病足溃疡的作用进行了评价并阐明了其促进糖尿病溃疡愈合的机理。
4.本发明以前并没有sarp在糖尿病足溃疡方面的应用。而且sarp纯化路线简单，可大量制备，能够促进糖尿病大鼠溃疡的愈合，是一种非常有前途的治疗糖尿病足溃疡的新型药物。
三、

技术实现要素：

5.本发明的目的之一是阐述了sarp的纯化制备过程。
6.本发明的目的之二是评价了sarp的理化性质和结构特点。
7.本发明的目的之三是评价了sarp促进糖尿病溃疡愈合的作用。
8.本发明的目的之四是阐明了sarp促进糖尿病溃疡愈合的机制。
9.为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
10.采用现代色谱分离技术，纯化、制备高纯度sarp。
11.采用高效凝胶渗透液相色谱技术，测定sarp的分子量、纯度。
12.采用pmp柱前衍生技术，检测sarp的单糖组成。
13.采用kbr压片技术，检测sarp的红外光谱特征。
14.采用sem技术，检测sarp的形貌表征。
15.采用nmr技术，检测sarp的1h、
13
c特征。
16.采用srb技术，检测sarp体外对h2o2以及高糖引起的huvecs中氧化压力的逆转作用。
17.采用划痕以及transwell法，检测sarp对huvecs细胞迁移的影响。
18.采用小管生成技术，检测sarp对huvecs血管生成的影响。
19.利用糖尿病大鼠伤口模型，检测sarp对糖尿病大鼠溃疡愈合的作用。
20.利用免疫组化技术，检测sarp对糖尿病大鼠伤口血管生成的影响。
21.利用全自动血液生化分析仪，检测sarp对糖尿病大鼠血液生化的影响。
22.与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：本发明从海黍子sargassum kjellmanianum中纯化、制备到一种组成新颖的褐藻胶sarp，首次证明了sarp促进糖尿病溃疡愈合的作用，同时系统性的阐明了其促进糖尿病溃疡愈合的机制。
23.sarp分子量约为45.4kda，由甘露糖醛酸(76.56％)、古洛糖醛酸(18.89％)和少量葡萄糖醛酸(4.55％)组成。sarp与从其他褐藻中分离到的褐藻胶相比，sarp的甘露糖酸含量更高。sarp体外具有明显的抗氧化作用，能够抑制huvecs中由h2o2以及高糖引起的huvecs细胞的损伤。sarp体外能够促进huvec细胞的迁移以及血管生成。我们进一步评价了sarp体内对糖尿病大鼠溃疡愈合的作用，发现sarp能够非常显著的促进糖尿病大鼠溃疡愈合。进一步实验说明sarp能够降低糖尿病大鼠体内的氧化应激、炎症水平、脂质紊乱。以上说明sarp具有良好的治疗糖尿病足溃疡的作用，具有广泛的应用前景。
四、附图说明
24.图1表明本发明中sarp经sephacryl s-300/hr凝胶柱分离、纯化。
25.图2表明本发明中sarp具有较高纯度，分子量约为45.4kda。
26.图3表明本发明中sarp由甘露糖醛酸(76.56％)、古洛糖醛酸(18.89％)和少量葡萄糖醛酸(4.55％)组成。
27.图4表明本发明中sarp中甘露糖醛酸和古洛糖醛酸在1h、
13
c中的化学位移值。
28.图5表明本发明中sarp体外能够清除自由基，能够逆转h2o2以及高糖引起的huvecs细胞的损伤。
29.图6表明本发明中sarp能够促进huvecs的迁移。
30.图7表明本发明中sarp能够促进huvecs的血管生成。
31.图8表明本发明中sarp可以促进糖尿病大鼠皮肤溃疡的愈合。
32.图9表明本发明中sarp可以减轻糖尿病大鼠体内的氧化压力。
33.图10表明本发明中sarp可以促进糖尿病大鼠伤口处的血管生成。
34.图11表明本发明中sarp可以减轻糖尿病大鼠体内的炎症水平。
35.图12表明本发明sarp可以减轻糖尿病大鼠体内的脂质代谢紊乱。
五、具体实施方式
36.下面结合附图和试验例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。
37.试验例1
38.测定了sarp在sephacryl s-300凝胶色谱柱上的洗脱曲线
39.试剂：碳酸氢铵、硫酸、苯酚(国药集团，中国)
40.仪器：sephacryl s-300凝胶色谱柱(2.6
×
100cm)，自动收集器(bio-rad model 2110,美国)
41.方法：粗多糖粉末经蒸馏水溶解后(20mg/ml)，用sephacryl s-400凝胶柱进一步
纯化，以0.2mol/lnh4hco3为洗脱液，流速为0.3ml/min经自动收集齐收集洗脱液，硫酸苯酚法检测糖含量，并绘制洗脱曲线，收集曲线峰尖部分，浓缩、减压除氨、冻干得分子量均一多糖，命名为sarp。
42.试验结果图1表明，sarp是经过收集吸光度较高的峰尖部分浓缩、透析、冻干制备得到的。
43.试验例2
44.测定了sarp的分子量、纯度。
45.试剂：无水na2so4；葡聚糖标准品mw：5.9、9.6、21.1、47.7、107、200、344、708kda(showa denko k.k.公司，日本)。
46.仪器：安捷伦1290高效液相色谱仪；rid-10a示差检测器；shodex ohpak sb-804hq色谱柱。
47.实验方法：以标准品的重均分子量的对数值(logmw)为纵坐标和保留时间(rt)为横坐标作图，绘制标准曲线并得线形回归方程。准确称取多糖2mg，加入400μl na2so4溶液得到5mg/ml多糖样品，经0.22μm滤膜过滤，hpgpc检测得保留时间，根据线形回归方程计算得出样品的重均分子量。
48.试验结果图2表明，sarp为纯度较高，分子量为45.4kda。
49.试验例3
50.测定了sarp的单糖组成
51.试剂：1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(pmp)；三氟乙酸，甲醇(国药集团，中国)；单糖标准品：甘露糖、氨基葡萄糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸，葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖(sigma公司，美国)；甘露糖醛酸和古洛糖醛酸(源叶生物有限公司，中国)；色谱纯乙腈(国药基团，中国)。
52.仪器：安捷伦1290高效液相色谱仪；dad紫外检测器；eclipse xdb-c18(5μm，4.6μm
×
25.0cm)色谱柱。
53.实验方法：多糖降解产物及等单糖标准品用100μl蒸馏水充分溶解，再加入100μl的0.3mol/l naoh以及120μl的0.5mol/l的pmp甲醇溶液，于70℃水浴反应60min。反应结束冷却至室温，加入100μl 0.3mol/lhcl溶液进行中和反应，用二氯甲烷萃取三次，将未反应的pmp除去，上清液经0.22μm微孔滤膜过滤备用。高效液相色谱条件：流动相为乙腈：磷酸盐缓冲液(ph 6.7)＝17：83(v/v体积比)；进样体积：10μl；柱温：35℃；检测器：紫外检测器(254nm)；流速：1.0ml/min。通过与标准品出峰时间和峰面积进行比对，确定sarp的单糖组成及比例。
54.试验结果图3表明，由甘露糖醛酸、古洛糖醛酸和少量葡萄糖醛酸组成，它们的含量分别是76.56％、18.89％和4.55％。
55.试验例4
56.测定了sarp的1h、
13
c特征
57.试剂：氘代重水、氘代丙酮(sigma，美国)
58.仪器：agilent ddz 500mhz核磁共振波谱仪
59.实验方法：将60mg多糖样品用溶于0.5mld2o中，冻干，重复此操作三遍，离心置于核磁管中，加入适量氘代丙酮做内标，采用agilent ddz 500mhz核磁共振波谱仪测定其一
维(1h-nmr、
13
c-nmr)核磁共振波谱。
60.试验结果图4表明，sarp的1h-nmr在5.09ppm和4.67ppm处有两个异头氢，其中5.09ppm归属于α-l-古洛糖醛酸的h-1,4.67ppm的强信号归属为β-d-甘露糖醛酸的h-1。在4.54ppm的共振是由α-l-古洛糖醛酸的h-5引起的。此外，根据的1h nmr数据可以推导出m和g的比值。所得结果与hplc单糖组成分析结果一致，为4.02:1.00。sarp的
13
c核磁共振谱包括三个区域:异头碳区为100.2-101.9ppm，c2-c6区为65.3-80.7ppm，176.6ppm处为羧基的碳信号区域。
61.试验例5
62.探究了sarp自由基清除能力以及不同浓度的sarp在氧化压力存在下对细胞的保护作用。
63.细胞：人脐静脉内皮细胞(huvecs)，购自中国典型培养物保藏中心。
64.试剂：dmem干粉培养基(gibco公司，美国)；pbs；srb(上海索莱宝生物科技有限公司)；h2o2、葡萄糖(碧云天生物技术公司)。
65.仪器：co2培养箱(heraeus公司，德国)；倒置显微镜(奥林巴斯公司，日本)；超净工作台(heraeus公司，德国)；酶标仪(bio-tek公司，美国)。
66.实验方法体外总抗氧化能力检测：用蒸馏水或样品配制溶液稀释标准品，96孔板的每个检测孔中加入20微升过氧化物酶工作液。空白对照孔中加入10微升蒸馏水；标准曲线检测孔内加入10微升各种浓度的trolox标准溶液；样品检测孔内加入10微升各种样品。轻轻混匀。每个孔内加入170微升abts工作液，轻轻混匀。室温孵育6分钟后测定414nm处od值，根据标准曲线测出sarp的抗氧化能力。
67.实验方法srb法：取处在对数生长期的huvecs接种到96孔板中，细胞贴壁后实验组加入不同浓度的sarp，对照组加入等比例稀释的dmso，设置阿霉素为阳性对照(浓度为1μm)。将96孔板置于37℃，co2浓度为5％的培养箱中培养24h。培养结束后，每孔加入500μm h2o2作用3h，结束后将上层培养液甩掉，加入10％预冷的tca固定细胞，100μl/孔，静置5min，放于4℃冰箱固定1h以上。用自来水冲洗5
–
6次，空气自然干燥或放于37℃培养箱烘干。加入已配好的srb染料，100μl/孔，室温染色15min，用1％冰乙酸洗5
–
6次，洗去多余的染料，自然风干或放于37℃培养箱烘干。最后加入150μl/孔的10mm tris-hcl溶液，37℃孵育10min。用微量振荡器震荡3
–
5min，用酶标仪于515nm或540nm波长处测定吸光(od)值。
68.实验方法高糖细胞模型建立：取处在对数生长期的huvecs接种到96孔板中，细胞贴壁后去除培养基，用pbs洗2遍，高糖组培养基更换为含有300mm的葡萄糖，同时加入不同浓度的sarp培养24h，培养结束后采用srb法检测细胞活力。
69.根据图5实验结果发现，sarp体外能够明显清除自由基。在h2o2以及高糖诱导的氧化压力细胞模型中，sarp可以显著的逆转由于h2o2以及高糖引起的细胞损伤，以上结果表明sarp可以保护细胞免受氧化压力损伤。
70.试验例6
71.探究sarp对huvec细胞迁移的影响。
72.细胞：人脐静脉内皮细胞(huvecs)，购自中国典型培养物保藏中心。
73.试剂耗材：dmem干粉培养基(gibco公司，美国)；pbs；ros试剂盒(碧云天生物技术公司)；transwell小室(corning公司，美国)
74.仪器：co2培养箱(heraeus公司，德国)；倒置显微镜(奥林巴斯公司，日本)；超净工作台(heraeus公司，德国)。
75.实验方法划痕法：取对数生长期的细胞，调整密度3～4
×
104×
105/ml，按照每孔100μl细胞悬液接种于96孔板，37℃培养箱中培养24h。待细胞贴壁密度至80～90％时，使用10μl枪头在各孔中央划痕。用pbs洗涤2次后，更换为不含血清的新鲜培养基，并加入不同浓度sarp处理，使用显微镜对中央划痕区进行拍照观察，之后每隔12小时进行一次拍照。迁移率计算：细胞迁移率％＝(边缘距离0h-边缘距离th)/边缘距离0h
×
100.
76.实验方法transwell法：取对数生长期的细胞，按8000/孔的密度将细胞铺到transwell小室中，并把不同浓度的sarp加到小室中，上室的血清浓度为1％，同时下室中也加入相应浓度的sarp，血清浓度为10％，将transwell小室置于培养中培养24h。培养结束后，弃去小室培养液，用pbs洗3遍，用4％多聚甲醛固定细胞15min，固定结束后用pbs洗3遍，并用0.1％结晶紫染色，室温染色15min，，用棉签擦去上室细胞后，迁移至下室的细胞用显微镜拍照，并用33％的乙酸脱色，在570nm处测od值。
77.根据图6实验结果发现，与对照组相比，在sarp处理24h后，划痕细胞向中央迁移的速度明显增加，说明sarp可以促进细胞迁移。为了进一步证明sarp对huvecs细胞迁移的作用，将细胞置于transwell中，发现在加入sarp后，迁移至下室的细胞明显增多，以上实验说明sarp可以促进huvecs迁移。
78.试验例7
79.探究了sarp对k562对小管生成的影响。
80.细胞：人脐静脉内皮细胞(huvecs)，购自中国典型培养物保藏中心。
81.试剂耗材：dmem干粉培养基(gibco公司，美国)；pbs；胰酶(碧云天生物技术公司)；matrigel(corning公司，美国)
82.仪器：co2培养箱(heraeus公司，德国)；倒置显微镜(奥林巴斯公司，日本)；超净工作台(heraeus公司，德国)。
83.实验方法小管生成法：将matrigel基质胶于4℃融化至液体，取50μl平铺于96孔板中，放于37℃培养箱中使其固化。取对数生长期的细胞，按10000/孔的密度将细胞与不同浓度的sarp混匀，将细胞铺到matrigel基质胶上。3h后，显微镜下观察小管生成情况。
84.根据图7实验结果发现，与对照组相比，在加入sarp后，huvecs形成了明显的网状结构，而此时对照还没有形成完整的管腔结构，同时我们对节点(nodes)进行了统计，我们的结果表明，sarp可以促进huvecs小管生成，表明sarp可以促进血管生成。
85.试验例8
86.探究了sarp体内对糖尿病大鼠皮肤溃疡的愈合作用。
87.动物：sd大鼠(雄性，200
–
220g)，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司。
88.试剂：链脲菌素(stz，sigma，美国)；柠檬酸钠(索莱宝科技有限公司)。
89.仪器与耗材：超净工作台(heraeus公司，德国)；注射器(河南曙光健士医疗器械集团股份有限公司)。
90.实验方法糖尿病模型建立法：sd大鼠禁食过夜，将stz溶于ph4.5的柠檬酸钠溶液中，避光并置于冰上，sd大鼠50mg/kg腹腔注射，5min之内注射完毕。注射后3h后给予食物。期间观察糖尿病症状，并于stz注射的第三天测量血糖，血糖≥16.67mmol/l的大鼠方可用
于后续实验。
91.实验方法糖尿病伤口溃疡建立法：糖尿病大鼠背部剃毛并麻醉，在无菌操作台内用活检打孔器在其背部各一侧制造一个直径一样的伤口，将每只大鼠单独饲养，期间防止细菌感染。
92.实验方法动物分组给药法：将大鼠分成3组，每组6只，分别为：(1)对照组；(2)stz组；(3)stz+sarp组。将sarp粉末溶于pbs并过0.22μm无菌滤膜，sarp(200mg/kg)腹腔注射，并连续给药10d，定期测量伤口直径并拍照。
93.根据图8实验结果发现，与对照组相比，stz组大鼠伤口愈合明显减慢，表现为伤口深而大，表明糖尿病溃疡愈合的减慢；而给予sarp后，与stz组相比，sarp治疗后伤口深度以及伤口直径变小，说明sarp可以促进糖尿病溃疡愈合。
94.试验例9
95.探究了sarp对糖尿病大鼠氧化压力的影响。
96.动物：sd大鼠(雄性，200
–
220g)，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司。
97.仪器与耗材：倒置显微镜(奥林巴斯公司，日本)；毛细管、采血针、真空采血抗凝管(江西赛华科技有限公司)；注射器(河南曙光健士医疗器械集团股份有限公司)；脂质氧化(mda)检测试剂盒、谷胱甘肽检测试剂盒、sod检测试剂盒(碧云天生物技术公司)。
98.实验方法：取大鼠眼静脉血，颠倒混匀后室温静置20min，离心4℃，600g离心10min，移取上清至另一新的1ml离心管中，根据试剂盒说明书进行mda、谷胱甘肽以及sod的测定。
99.根据图9实验结果发现，与对照组相比，stz组大鼠氧化应激水平升高，表现为mda、gssg水平的升高，抗氧化酶sod的减少，而sarp治疗后，糖尿病大鼠氧化应激水平有所降低，表现为mda、gssg水平的降低，抗氧化酶sod的升高，说明sarp可以改善糖尿病大鼠体内的氧化压力，进而促进糖尿病溃疡愈合。
100.试验例10
101.探究了sarp对糖尿病大鼠伤口血管生成的影响。
102.动物：sd大鼠(雄性，200
–
220g)，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司。
103.试剂：苏木素、cd31抗体(武汉赛维尔生物科技有限公司)。
104.仪器与耗材：剪刀；倒置显微镜(奥林巴斯公司，日本)。
105.实验方法：剪刀剪取每组伤口及其伤口周围正常皮肤，制备5μm的切片并将切片脱蜡和水化，抗原修复后，在玻片上滴加5％的正常血清(与二抗种属来源一致或相似)，37℃封闭30min。然后滴加稀释好的一抗4℃孵育过夜。pbs冲洗切片3次，每次3min，吸水纸擦干切片后滴加辣根过氧化物酶标记二抗，37℃孵育30min，pbs冲洗切片4次，每次3min，甩去pbs液体后吸水纸擦干切片，每张切片滴加新鲜配制的dab显色液，显微镜下观察，阳性信号为棕黄色或棕褐色，用自来水冲洗切片终止显色。苏木素复染。最后脱水固定封片显微镜下观察。
106.根据图10实验结果发现，与对照组相比，stz组血管生成明显减少，表现为棕黄色信号少，而sarp可以促进血管的生成。
107.试验例11
108.探究了sarp体内对糖尿病大鼠炎症的影响。
109.动物：sd大鼠(雄性，200
–
220g)，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司。
110.仪器与耗材：毛细管、采血针、真空采血抗凝管(江西赛华科技有限公司)，注射器(河南曙光健士医疗器械集团股份有限公司)。
111.实验方法：采血针取血置真空采血抗凝管，缓慢混匀后通过全自动血液生化分析仪检测各个细胞的数量变化。
112.根据图11实验结果发现，与对照组相比，stz组炎症水平明显升高，表现为白细胞、淋巴细胞、单核细胞的增多，sarp治疗后炎症症状明显减轻，炎症细胞数量减少，以上实验说明sarp可以降低糖尿病大鼠炎症水平。
113.试验例12
114.探究了sarp体内对糖尿病大鼠血脂代谢的影响。
115.动物：sd大鼠(雄性，200
–
220g)，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司。
116.仪器与耗材：毛细管、采血针、真空采血抗凝管(江西赛华科技有限公司)，注射器(河南曙光健士医疗器械集团股份有限公司)。
117.实验方法：采血针取血置真空采血抗凝管，缓慢混匀后通过全自动血液生化分析仪检测各个细胞的数量变化。
118.根据图12实验结果发现，stz组血脂升高，表现为血清总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白的升高，sarp治疗后，清总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白整体降低，说明sarp可以减轻糖尿病大鼠的血脂代谢紊乱。

技术特征：
1.sargassum kjellmanianum来源褐藻多糖sarp在促进糖尿病溃疡愈合领域的应用。sarp分子量约为45.4kda，由甘露糖醛酸(76.56％)、古洛糖醛酸(18.89％)和少量葡萄糖醛酸(4.55％)组成。2.根据权利要求1所述的促进糖尿病溃疡愈合作用，其特征在于：所述的sarp体外具有良好的抗氧化能力，能够减轻氧化压力诱导的细胞损伤。3.根据权利要求1所述的促进糖尿病溃疡愈合作用，其特征在于：sarp可以促进人脐静脉内皮细胞(huvecs)迁移。4.根据权利要求1所述的促进糖尿病溃疡愈合作用，其特征在于：sarp可以促进huvecs的小管生成，进而促进血管生成能力。5.根据权利要求1所述的促进糖尿病溃疡愈合作用，其特征在于：在体内，sarp可以明显促进糖尿病大鼠溃疡的愈合。6.根据权利要求1所述的促进糖尿病溃疡愈合作用，其特征在于：在体内，sarp可以明显改善糖尿病大鼠溃疡的氧化应激、炎症水平以及脂质代谢紊乱。

技术总结
本发明公开了一种新型的促进糖尿病溃疡愈合的褐藻多糖SARP的制备及应用。经SephacrylS-300/HR凝胶柱分离、纯化得到了结构新颖的SARP，其分子量约为45.4kDa，由甘露糖醛酸(76.56％)、古洛糖醛酸(18.89％)和少量葡萄糖醛酸(4.55％)组成。SARP与从其他褐藻中分离到的褐藻胶相比，SARP的甘露糖酸含量更高。SARP显示出较好的体外抗氧化能力，在HUVECs中SARP可以明显的逆转H2O2以及高糖引起的HUVECs的细胞损伤。此外，SARP可以促进HUVECs细胞的迁移以及小管生成。体内实验进一步表明，SARP可以促进糖尿病大鼠溃疡的愈合，能够降低糖尿病大鼠体内的氧化应激、炎症水平、脂质紊乱。SARP纯化路线简单，可大量制备，是一种非常有前途的治疗糖尿病足溃疡的新型药物。非常有前途的治疗糖尿病足溃疡的新型药物。


技术研发人员：刘明 缪锦来 卢绪秀 秦玲
受保护的技术使用者：中国海洋大学
技术研发日：2022.03.15
技术公布日：2023/9/22