一种纳米银辅助开放式发酵生产细菌纤维素膜的方法

1.本发明属于发酵技术领域，具体涉及一种纳米银辅助开放式发酵生产细菌纤维素膜的方法。


背景技术：

2.众所周知，纳米银(nano silver)就是将粒径做到纳米级的金属银单质。银是一种广谱抗肿瘤药物中的成分，可以抵抗大量革兰氏阳性和革兰氏阴性微生物，许多需氧菌和厌氧菌，以及几种抗生素耐药菌菌株，而且不会产生耐药性，纳米银抗菌的特点被应用到生活中，其中在婴儿产品中，餐具和奶瓶中就有应用；纳米银是安全材质而被人们广泛应用，其中必尔奶瓶(必尔纳米银pes益智奶瓶、必尔银离子pes益智奶瓶、必尔pes组合益智奶瓶)都含有纳米银材料。
3.近年来，由一种由醋酸细菌葡萄糖酸杆菌(gluconacetobacter xylinus)合成的聚合物-细菌纤维素(bc)。它是一种廉价而易获得的三维纳米级多孔材料，是由微生物发酵合成的多孔性网状纳米级生物高分子聚合物，其成分纯度高，不含半纤维素等杂质，更重要的是其结晶度高，强度和韧性优异，透过率良好，是一种潜在的优异柔性衬底材料。以及较高的生物适应性、良好的生物可降解性和生物合成时性能的可调控性等。正是这些优良的特性，预示了其广阔的商业用途，如扬声器的震动膜、伤口护理敷料、人造皮肤等。它作为一种优良的伤口愈合系统，具有较高的持水性、较强的液体吸附性、良好的相容性和优异的湿强度。细菌纤维素复合材料的制备，既利用了其多孔性，又增加了新的功能特性。因此，bc作为一种极具吸引力的高聚物，已广泛应用于生物医药、食品、化工、造纸、声学、柔性导电材料、污染物吸附处理等领域。
4.随着科学技术的不断发展，由于开放式发酵系统具有技术简单、投资低廉、生产操作过程简单等优点，因而备受人们的推崇。目前开放式发酵已经成功应用到以下两方面：(1)一方面是利用开放式池商业化培养藻类等一些生产环境较为特殊的、不易被其他杂菌污染的藻种取得了良好的效果。比如一些藻类生长在高盐的环境中，要求ph为9，其他杂菌很难在这种环境中生长，盐生杜氏藻可以在高盐环境中生长，其中培养基中的nacl的浓度可以达到200g/l以上，其它种类的微藻和细菌很难在此环境中生长；另一方面是可以利用开放式发酵生产酸类物质，比如羧酸(盐)和乳酸等，以及可以在耐冷、耐高温条件下开放式发酵生产一些物质，比如多糖类和酶类等。这些极端生长环境可以有效地抑制其他杂菌的生长。上述开放式发酵方法是基于发酵菌株的特殊生长条件(或者环境)来实现的，即在发酵过程中需要事先调节发酵液的ph，发酵温度等因素，来抑制其他杂菌的生长，这样对于实现开放式发酵的菌株也受到了限制；因此，在目前现有的技术中未有揭示在生产细菌纤维素膜的过程中，同时利用纳米银颗粒来抑制其它杂菌的生长，以此在不灭菌的条件下生产细菌纤维素膜的发酵工艺方法。


技术实现要素：

5.本发明为了将纳米银与开放式发酵结合实现开放式生产细菌纤维素膜，本发明提供了一种纳米银辅助开放式发酵生产细菌纤维素膜的方法，具体步骤如下：
6.1)木醋杆菌的活化和种子液的制备：将活化后的木醋杆菌接种至种子培养基中，于28-30℃，180-220rpm条件下培养1～2d获得种子液；
7.2)细菌纤维素膜粗品的制备：将种子液接种于加入纳米银胶体的发酵培养基中，于25-28℃，180-200rpm条件下培养2h获得发酵液，然后静置培养6-8d后得到细菌纤维素膜粗品；所述发酵培养基中纳米银胶体的添加量为1mg/l-4mg/l；
8.3)细菌纤维素膜的精制：利用沸水将细菌纤维素膜粗品煮沸10min～30min，再利用0.1m～1m naoh煮沸20min～60min，然后将细菌纤维素膜粗品浸泡于水中，调节ph至中性，换水冲洗直至细菌纤维素膜无色透明。
9.进一步地限定，所述木醋杆菌为komagataeibacter sucrofermentans。
10.进一步地限定，步骤1)所述活化为将保藏的木醋杆菌菌种依次转接至液体培养基和固体培养基上获得木醋杆菌单菌落。
11.进一步地限定，步骤1)所述活化使用的培养基，种子培养基，和步骤(2)所述的发酵培养基均为hs培养基，所述hs培养基的组成为15g/l～20g/l葡萄糖，3g/l～5g/l蛋白胨，2g/l～5g/l酵母浸粉，2.7g/l～3.0g/l磷酸二氢钠，1.15g/l～1.3g/l的柠檬酸，余量为水，ph为6.0～6.5。
12.进一步地限定，步骤1)所述种子液需要灭菌处理，灭菌参数为115℃，30min。
13.进一步地限定，步骤2)所述发酵培养基不需要灭菌处理。
14.进一步地限定，步骤2)所述的种子液接种量为10％～20％。
15.本发明的有益效果：
16.1、本发明提供的一种合成细菌纤维素膜的方法是基于开放式发酵提出的，在不灭菌状态下进行的发酵降低了成本，不需进行化学处理即可得到纯的纤维素膜。
17.2、本发明提供的菌株生产细菌纤维素的方法条件温和、环境友好以及产品绿色天然等优点。
18.3、上述方法实现了木醋杆菌菌株在不灭菌的条件下发酵生产细菌纤维素，从而节约了成本和能源。
附图说明
19.图1为实施例1-3中细菌纤维素膜成膜过程，其中，图1中的a为未灭菌对照，图1中的b为实施例1成膜过程，图1中的c为实施例2成膜过程，图1中的d为实施例3成膜过程；
20.图2为实施例1-3获得的细菌纤维素膜的成膜结果；其中，图2中的a为未灭菌对照，图2中的b为实施例1的成膜结果，图2中的c为实施例2的成膜结果，图2中的d为实施例3的成膜结果。
具体实施方式
21.下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
22.本发明中所述用的原料、仪器均为实验室常用设备，均可通过商业化途径购买获
得。
23.本发明用到的木醋杆菌(komagataeibacter sucrofermentans)公开于gao,m.,li,j.,bao,z.,hu,m.,nian,r.,feng,d.,an,d.,li,x.,xian,m.,zhang,h.2019.a natural in situ fabrication method of functional bacterial cellulose using a microorganism.nat commun,10(1),437.
24.实施例1：
25.一种基于木醋杆菌纳米银辅助开放式发酵生产细菌纤维素膜的方法，具体包括如下步骤：
26.1)菌株的活化：将保藏的木醋杆菌菌种依次转接至液体培养基和固体培养基上获得木醋杆菌单菌落，即可完成木醋杆菌的活化。液体培养基为hs培养基，按重量百分比计算，由20g/l的葡萄糖，5g/l的蛋白胨，5g/l的酵母浸粉，2.7g/l的磷酸二氢钠和1.15g/l的柠檬酸组成，ph为5。固体培养基为hs培养基，按重量百分比计算，由20g/l的葡萄糖，5g/l的蛋白胨，5g/l的酵母浸粉，2.7g/l的磷酸二氢钠和1.15g/l的柠檬酸，20g/l琼脂组成，ph为5，上述液体培养基和固体培养基在115℃的温度下灭菌30min。
27.2)种子液的制备：取活化好的木醋杆菌接种至种子培养基中，控制温度为28℃，转速为180rpm，培养2d得种子液。种子培养基为步骤1)所述液体培养基。
28.3)纤维素粗品的制备：发酵培养基加入100ul/200ml的纳米银胶体备用，将步骤2)所得的种子液接种至100ml发酵培养基中，种子液接种量为10％，180rpm振荡使种子液和发酵培养基混合均匀，于25℃恒温培养箱中振动培养2h，将上述发酵液转入500ml烧杯中同温度静置培养6-8d后得到细菌纤维素膜粗品。所述发酵液培养基为步骤1)所述液体培养基，无需灭菌处理。
29.4)将步骤3)得到的细菌纤维素膜粗品沸水煮10～30min，再用0.1m～1m氢氧化钠煮沸20min～60min，水中浸泡调节ph至中性，换水冲洗直至纤维素膜呈无色透明。
30.实施例1中细菌纤维素膜成膜过程见图1中的b。
31.实施例2：
32.一种基于木醋杆菌纳米银辅助开放式发酵生产细菌纤维素膜的方法，具体包括如下步骤：
33.1)菌株的活化：将保藏的木醋杆菌菌种依次转接至液体培养基和固体培养基上获得木醋杆菌单菌落，即可完成木醋杆菌的活化。液体培养基为hs培养基，按重量百分比计算，由20g/l的葡萄糖，5g/l的蛋白胨，5g/l的酵母浸粉，2.7g/l的磷酸二氢钠和1.15g/l的柠檬酸组成，ph为5。固体培养基为hs培养基，按重量百分比计算，由20g/l的葡萄糖，5g/l的蛋白胨，5g/l的酵母浸粉，2.7g/l的磷酸二氢钠和1.15g/l的柠檬酸，20g/l琼脂组成，ph为5，上述液体培养基和固体培养基在115℃的温度下灭菌30min。
34.2)种子液的制备：取活化好的木醋杆菌接种至种子培养基中，控制温度为29℃，转速为200rpm，培养2d得种子液。种子培养基为步骤1)所述液体培养基。
35.3)纤维素粗品的制备：发酵培养基加入200ul/200ml的纳米银胶体备用，将步骤2)所得的种子液接种至100ml发酵培养基中，种子液接种量为15％，190rpm振荡使种子液和发酵培养基混合均匀，于27℃恒温培养箱中振动培养2h，将上述发酵液转入500ml烧杯中同温度静置培养6-8d后得到细菌纤维素膜粗品。所述发酵液培养基为步骤1)所述液体培养基，
无需灭菌处理。
36.4)将步骤3)得到的细菌纤维素膜粗品沸水煮10～30min，再用0.1m～1m氢氧化钠煮沸20min～60min，水中浸泡调节ph至中性，换水冲洗直至纤维素膜呈无色透明。
37.实施例2中细菌纤维素膜成膜过程见图1中的c。
38.实施例3：
39.一种基于木醋杆菌纳米银辅助开放式发酵生产细菌纤维素膜的方法，具体包括如下步骤：
40.1)菌株的活化：将保藏的木醋杆菌菌种依次转接至液体培养基和固体培养基上获得木醋杆菌单菌落，即可完成木醋杆菌的活化。液体培养基为hs培养基，按重量百分比计算，由20g/l的葡萄糖，5g/l的蛋白胨，5g/l的酵母浸粉，2.7g/l的磷酸二氢钠和1.15g/l的柠檬酸组成，ph为5。固体培养基为hs培养基，按重量百分比计算，由20g/l的葡萄糖，5g/l的蛋白胨，5g/l的酵母浸粉，2.7g/l的磷酸二氢钠和1.15g/l的柠檬酸，20g/l琼脂组成，ph为5，上述液体培养基和固体培养基在115℃的温度下灭菌30min。
41.2)种子液的制备：取活化好的木醋杆菌接种至种子培养基中，控制温度为30℃，转速为220rpm，培养2d得种子液。种子培养基为步骤1)所述液体培养基。
42.3)纤维素粗品的制备：发酵培养基加入300ul/200ml的纳米银胶体备用，将步骤2)所得的种子液接种至100ml发酵培养基中，种子液接种量为20％，200rpm振荡使种子液和发酵培养基混合均匀，于28℃恒温培养箱中振动培养2h，将上述发酵液转入500ml烧杯中同温度静置培养6-8d后得到细菌纤维素膜粗品。所述发酵液培养基为步骤1)所述液体培养基，无需灭菌处理。
43.4)将步骤3)得到的细菌纤维素膜粗品沸水煮10～30min，再用0.1m～1m氢氧化钠煮沸20min～60min，水中浸泡调节ph至中性，换水冲洗直至纤维素膜呈无色透明。
44.实施例3中细菌纤维素膜成膜过程见图1中的d。
45.纤维素膜的性质检测：
46.以实施例1-3为例，将发酵结束后的纤维素膜取出，经洗涤后，观察纤维素膜的成膜情况(见图2)。
47.虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

技术特征：
1.一种纳米银辅助开放式发酵生产细菌纤维素膜的方法，其特征在于，具体步骤如下：1)木醋杆菌的活化和种子液的制备：将活化后的木醋杆菌接种至种子培养基中，于28-30℃，180-220rpm条件下培养1～2d获得种子液；2)细菌纤维素膜粗品的制备：将种子液接种于加入纳米银胶体的发酵培养基中，于25-28℃，180-200rpm条件下培养2h获得发酵液，然后静置培养6-8d后得到细菌纤维素膜粗品；所述发酵培养基中纳米银胶体的添加量为1mg/l-4mg/l；3)细菌纤维素膜的精制：利用沸水将细菌纤维素膜粗品煮沸10min～30min，再利用0.1m～1m naoh煮沸20min～60min，然后将细菌纤维素膜粗品浸泡于水中，调节ph至中性，换水冲洗直至细菌纤维素膜无色透明。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述木醋杆菌为komagataeibacter sucrofermentans。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)所述活化为将保藏的木醋杆菌菌种依次转接至液体培养基和固体培养基上获得木醋杆菌单菌落。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)所述活化使用的培养基，种子培养基，和步骤(2)所述的发酵培养基均为hs培养基，所述hs培养基的组成为15g/l～20g/l葡萄糖，3g/l～5g/l蛋白胨，2g/l～5g/l酵母浸粉，2.7g/l～3.0g/l磷酸二氢钠，1.15g/l～1.3g/l的柠檬酸，余量为水，ph为6.0～6.5。5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)所述种子液需要灭菌处理，灭菌参数为115℃，30min。6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2)所述发酵培养基不需要灭菌处理。7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2)所述的种子液接种量为10％～20％。

技术总结
一种纳米银辅助开放式发酵生产细菌纤维素膜的方法，属于微生物发酵技术领域。本发明为了将纳米银与开放式发酵结合实现开放式生产细菌纤维素膜，将纳米银胶体添加到未灭菌的发酵培养基中，向添加纳米银胶体的发酵培养基中接种木醋杆菌，通过纳米银胶体抑制其他杂菌的生长，从而有助于木醋杆菌在开放式条件下合成细菌纤维素膜。本发明提供的生产细菌纤维素膜的方法具有发酵成本低、条件温和、环境友好以及产品绿色天然等优点，节约了成本和能源。节约了成本和能源。节约了成本和能源。


技术研发人员：张海波 陈国强 门潇 赵晓琦
受保护的技术使用者：中国科学院青岛生物能源与过程研究所
技术研发日：2022.03.15
技术公布日：2023/9/22