烷烃羟化酶及其编码基因和应用

1.本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种烷烃羟化酶及其编码基因和应用。


背景技术：

2.原油是重要的工业资源，在经济发展中具有重要意义，目前石油工业主要关注的两个问题是石油的增采和石油污染的治理。中长链烷烃是石油的重要组分，其含量增加会使原油流动性减弱,进而限制原油的开釆。微生物促进的重质原油开采在20世纪20年代被提出，并在20世纪80年代作为微生物采油技术受到越来越多的关注，其中微生物降解长链烷烃的能力是影响微生物采油技术应用效果的重要因素之一。石油资源在开采、运输或储存过程中造成的石油污染问题也不容忽视，生物修复是最具潜力的修复方法之一，是利用高效的石油烃降解微生物来修复石油污染，具有廉价、便捷、无毒、无二次污染等优点，但对于结构稳定的长链烷烃污染的降解问题仍面临许多挑战。另外长链烷烃转化为高附加值腊酯也具有商业价值，开发长链烷烃羟化酶具有很好的前景。
3.微生物降解烷烃可通过多种途径降解，例如末端氧化，次末端氧化，ω-氧化和β-氧化。微生物利用羟化酶将烷烃氧化为醇，然后相应的醇脱氢酶再将其转变为醛和脂肪酸，脂肪酸进入β-氧化后生成乙酰辅酶a进入中央代谢途径转变为co2和h2o。烷烃羟化酶催化第一步的反应，是烷烃降解的关键酶，其酶活的高低决定整个降解过程的效率。
4.长链烷烃通常是指碳原子数大于16的烷烃，因其碳链较长，化学键稳定，疏水性强等特点，不易被生物降解。目前发现的长链烷烃降解酶有alkb，cyp153、alma和lada，报道较多的是依赖红素氧还蛋白的烷烃羟化酶alkb，早在1998年ratajczak a等人就在acinetobacter baylyi adp1菌株中发现了长链烷烃羟化酶alkm[ratajczak a,w,hillen w.1998,alkane hydroxylase from acinetobacter sp.adp1 is encoded by alkm and belongs to a new family of bacterial integral-membrane hydrocarbon hydroxylases[j].applied and environmental microbiology,64(4):1175-1179]，能够催化降解c12-c36烷烃。随后越来越多菌被发现具有长链烷烃羟化酶基因[wentzel a,ellingsen te,kotlar hk,et al.2001,bacterial metabolism of long-chain n-alkanes[j].appl microbiol biotechnol 76:1209-1221]。发现新的具有优良性能的羟化酶，并将其用于提高菌株的降解能力具有重要的应用价值。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的是为了克服现有技术存在的长链烷烃难以被微生物降解的问题，提供一种烷烃羟化酶及其编码基因和应用。本发明提供的烷烃羟化酶对长链烷烃具有较好的降解能力，而且本发明优选的编码基因能够较为稳定地在常见表达载体中高效表达，且其导入受体细胞/受体菌后，能够有效改善受体细胞/受体菌对烷烃(尤其是长链烷烃)的降解能力。
[0006]
为了实现上述目的，本发明一方面提供一种烷烃羟化酶，所述烷烃羟化酶包括以
下氨基酸序列：
[0007]
(a)如seq id no:2所示的氨基酸序列；或者
[0008]
(b)seq id no:2所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸后获得的衍生蛋白质，其酶活性不低于(a)的酶活性的95％。
[0009]
本发明第二方面提供如上所述的烷烃羟化酶的编码基因。
[0010]
本发明第三方面提供一种重组载体，所述重组载体中含有如上所述的编码基因。
[0011]
本发明第四方面提供一种重组宿主细胞，其特征在于，所述重组宿主细胞中含有如上所述的重组载体。
[0012]
本发明第五方面提供一种制备烷烃羟化酶的方法，所述方法包括对如上所述的重组菌株进行培养，并对培养产物进行分离纯化从而获得所述烷烃羟化酶。
[0013]
本发明第六方面提供一种用于降解烷烃的组合物，其特征在于，所述组合物中含有如前所述的烷烃羟化酶，或含有如上所述的方法制备获得的烷烃羟化酶。
[0014]
本发明第七方面提供权如前所述的烷烃羟化酶、编码基因、重组载体、重组宿主细胞，或者组合物在以下任意一项中的应用：
[0015]
(1)在降解烷烃中的应用；
[0016]
(2)在提高细胞对烷烃的利用能力中的应用；
[0017]
(3)在处理石油污染中的应用；
[0018]
(4)在微生物采油中的应用。
[0019]
通过上述技术方案，本发明能够取得如下有益效果：
[0020]
(1)本发明提供了一种新的烷烃羟化酶，其具有较好的烷烃降解能力，且能够有效改善微生物/细胞对烷烃的利用能力；
[0021]
(2)本发明提供的烷烃羟化酶的编码基因能够高效导入受体细胞/受体菌中，并能够在常见表达载体中高效表达；
[0022]
(3)本发明提供的烷烃羟化酶对于烷烃，尤其是长链烷烃(例如c原子数在16以上的烷烃)的降解效果较好，十分适合用于微生物采油或微生物石油污染处理。
附图说明
[0023]
图1是实施例2中阳性克隆的pcr验证结果图。
[0024]
图2是实施例2中重组菌pcom8-alkb/kob2δ1的gc-ms检测结果图。
[0025]
图3是实施例2中重组菌pcom8-alkb/kob2δ1对不同长链烷烃的降解率比较图。
[0026]
图4是(a)实施例3中重组菌pcom8-alkb/kt2440的gc-ms检测结果图；(b)实施例3中重组菌pcom8-alkb/kt2440对不同长链烷烃的降解率比较图。
具体实施方式
[0027]
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
[0028]
本发明中，“烷烃羟化酶”、“羟化酶”和“长链烷烃羟化酶”意义相同，可以互换使
用。在未做特殊说明的情况下，均指本发明提供的烷烃羟化酶alkb(或称alkb蛋白)。
[0029]
本发明的发明人在研究的过程中，自一株红球菌(rhodococcus sp.)中发现一个1597bp的羟化酶基因簇alkb-rd(核苷酸序列如seq id no:1所示)，其能够编码414aa的羟化酶蛋白alkb(简称为羟化酶alkb或alkb蛋白，氨基酸序列如seq id no:2所示)，分子量约为47kda，经过检索和比对，发现该alkb蛋白与现有羟化酶的氨基酸序列均不相同。经过进一步研究发现，该羟化酶alkb能够在常规表达体系中高效表达，并且具有很好的长链烷烃降解能力。将该羟化酶基因alkb-rd导入宿主细胞后，能够显著改善宿主细胞对烷烃，尤其是长链烷烃的利用能力。
[0030]
atgagtacggcttcggcggactcgctggacgaacccgacctgcgctggcacgaccgcaaacggcatctgtggctcctgggactggtacccccgacggccctgttcgtcgccaccgcgctggtgtgggccggtaaccagttcggactgcagagcgtgacacccgtcctgtggtggatcgggccgatgttgatctacgtcttcgttccgacgctcgatctgttcgtcggccccgacggggagaacccgcccgacgagatgttcgaacaactcgagaacgaccgcttctaccgctactgcacgtatctctacctgcccttccagttcgcgtccctgatcctggcctgttatctgtggtcggcggacgatctgtcctggctcggagtcgacggcggtctcggaatcgcgtcgaagatcgggctggcgatctccctcggcgtggtcgccgggatcggcatcaacaccgcccacgaactcggccacaagaaggtcgaattcgaacggcggctgtcgaagtgggcgctcgcgccctccttctacgggcacttctacatcgagcacaatcgcgggcatcacgtgcgtgtcgcgactccggaggatcccgcgtcggcgaggttcggggagagcttctggcgtttcctgccgcgcagtgtggtgggcagcctgcgctcggcgtggcgcctcgaaggcgcccggctcgagcgtctcggcaagccggtgtggagtgtgcacaacgacgtcctcaacgcgtgggcgatctccgtcgcgctgtacgcggtgctgctcgccgtgttcgggatcggcatcgcgccctatctcgtgatccaggcggtcttcggattctcgctgctcgaggttgtgaactatctcgagcactacggcctgctccggcagaagaccgacaagggccgctacgagcgctgctcgccggcgcacagctggaacagtgaccacctggtgacgaacatcttcctgtaccacctgcagcggcacagcgaccaccacgccaatccgacgcgccgctaccagacgttgcgcagcatggagatctccccgcagctgcccgccggttacgcgacgatgatcgtcctcgcctacattcccccgctctggcgcaaggtcatggaccatcgcgtactcgaccactacgacggcgacatcacccgcgtcaacatcgagccgagtcggcgggagaagatcctggcgcgctacgggtcgtcggattctgctgctgcggaaggtcggtgaccgcgatgtccgcctaccgctgtcctgtctgcgagttcgtgtacgacgagagtgccggggtgccccgtgaagggttccccgccggaaccccctgggacgcagtgcccgaggactggccgtgccccgactgcggcgtccgcgagaagagcgacttcgaggagtacatccgatgaacaccgaccaccgattgttccgctgcatcgtgtgcggtttcgagtacgacgaggccgaaggatggccggacgaggggatcgagcccggcacccgctgggaggacatcccggacgactggtcctgcccggagtgcggcgccgccaaggcggatttcgagatggtggaaatcgtccgccggtga(seq id no:1)
[0031]
mstasadsldepdlrwhdrkrhlwllglvpptalfvatalvwagnqfglqsvtpvlwwigpmliyvfvptldlfvgpdgenppdemfeqlendrfyryctylylpfqfaslilacylwsaddlswlgvdgglgiaskiglaislgvvagigintahelghkkveferrlskwalapsfyghfyiehnrghhvrvatpedpasarfgesfwrflprsvvgslrsawrlegarlerlgkpvwsvhndvlnawaisvalyavllavfgigiapylviqavfgfsllevvnylehygllrqktdkgryercspahswnsdhlvtniflyhlqrhsdhhanptrryqtlrsmeispqlpagyatmivlayipplwrkvmdhrvldhydgditrvniepsrrekilarygssdsaaaegr(seq id no:2)
[0032]
基于上述发现，本发明一方面提供一种烷烃羟化酶，所述烷烃羟化酶包括以下氨基酸序列：
[0033]
(a)如seq id no:2所示的氨基酸序列；或者
[0034]
(b)seq id no:2所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸后获得的衍生蛋白质，其酶活性不低于(a)的酶活性的95％。
[0035]
优选地，含有氨基酸序列(b)的烷烃羟化酶的酶活性可以为含氨基酸序列(a)的烷烃羟化酶的酶活性的95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％、99.8％、99.9％、100％，或者也可以为任意两个上述数值的任意中间值。或者，含有氨基酸序列(b)的烷烃羟化酶还可以具有超过含氨基酸序列(a)的烷烃羟化酶的酶活性，例如可以为其1.1倍、1.2倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、5倍或者更高。
[0036]
如前所述，本发明提供的烷烃羟化酶还可以进行修饰或突变，得到衍生的蛋白质。本发明所述“衍生的蛋白质”指与具有上述氨基酸序列的烷烃羟化酶具有氨基酸序列上的差异，也可以有不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白包括天然或诱导的遗传变异体。所述诱导变异体可以通过各种技术得到，如辐射或诱变剂等产生的随机突变，也可以通过如定点突变法或其他已知分子生物学的技术。所述“衍生的蛋白质”还包括具有天然l型氨基酸的残基的类似物(如d型氨基酸)，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β-氨基酸、γ-氨基酸等)的类似物。
[0037]
修饰(通常不改变一级结构，即不改变氨基酸序列)形式包括：体内或体外的蛋白的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的蛋白。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的蛋白。
[0038]
根据本发明的优选实施方式，其中，所述烷烃羟化酶中还含有便于分离纯化的氨基酸标签。
[0039]
任意本领域在蛋白纯化中常用的氨基酸标签均可适用于本发明。优选地，所述氨基酸标签包括多组氨酸标签、血凝素标签、flag标签、myc标签和荧光标签(例如egfp等)中的至少一种。本发明对所述氨基酸标签的具体序列没有特别限制，例如所述氨基酸标签可以包括以下氨基酸序列：
[0040]
多组氨酸标签：hhhhhh(seq id no:3)
[0041]
血凝素标签：ypydvpdya(seq id no:4)
[0042]
flag标签：dykddddk(seq id no:5)
[0043]
myc标签：eqkliseedl(seq id no:6)
[0044]
荧光标签(egfp)：mvskgeelftgvvpilveldgdvnghkfsvsgegegdatygkltlkficttgklpvpwptlvttltygvqcfsrypdhmkqhdffksampegyvqertiffkddgnyktraevkfegdtlvnrielkgidfkedgnilghkleynynshnvyimadkqkngikvnfkirhniedgsvqladhyqqntpigdgpvllpdnhylstqsalskdpnekrdhmvllefvtaagitlgmdelyk(seq id no:7)
[0045]
本发明第二方面提供如上所述的烷烃羟化酶的编码基因。
[0046]
本发明对于所述编码基因的具体序列没有特别限制，其只要能够编码上述烷烃羟化酶即可。本领域技术人员可以根据该烷烃羟化酶的氨基酸序列以及本领域公知的密码子表和基因构建技术进行相关编码基因的设计和构建。
[0047]
根据本发明的一种优选实施方式，其中，所述编码基因包括如seq id no:1所示的
核苷酸序列。
[0048]
根据本发明的优选实施方式，其中，所述编码基因中还可以含有便于蛋白纯化的标签的编码基因(例如如前所述的氨基酸标签的编码基因等)。
[0049]
本领域公知，组成蛋白质的20种不同的氨基酸中，除met(atg)或trp(tgg)分别为单一密码子编码外，其他18种氨基酸分别由2-6个密码子编码(sambrook等，分子克隆，冷泉港实验室出版社，纽约，美国，第二版，1989，见950页附录d)。即由于遗传密码子的简并性，决定一个氨基酸的密码子大多不止一个，三联体密码子中第三个核苷酸的置换，往往不会改变氨基酸的组成，因此编码相同蛋白的基因的核苷酸序列可以不同。本领域人员根据公知的密码子表，从本发明公开的氨基酸序列，以及由所述氨基酸序列得到的烷烃羟化酶活性不变或基本不变的氨基酸序列，完全可以推导出能够编码它们的基因的核苷酸序列，通过生物学方法(如pcr方法、突变方法)或化学合成方法得到所述核苷酸序列，因此该部分核苷酸序列都应该包括在本发明范围内。相反，利用本文公开的dna序列，也可以通过本领域公知的方法，例如sambrook等的方法(分子克隆，冷泉港实验室出版社，纽约，美国，第二版，1989)进行，通过修改本发明提供的核酸序列，得到与本发明所述烷烃羟化酶活性一致的氨基酸序列。因此本发明中，所述编码基因还可以按照表达载体的特征或体外表达的需要进行密码子优化，以提高在体外表达载体中的表达效率或表达量。本发明对于具体的密码自由化方式没有特别限制，只要优化后的编码基因能够表达具有前述氨基酸序列(a)或(b)的蛋白即可。
[0050]
本发明第三方面提供一种重组载体，所述重组载体中含有如前所述的编码基因。
[0051]
本发明中，所述重组载体可以选用任意现有常用于蛋白体外表达的载体，并通过基因工程技术将前述编码基因引入其中构成。本发明对于所选用的具体载体没有特别限制，本领域技术人员可以根据实际需要和要求(例如根据所需的表达效率、表达量、所选用的表达载体对于导入其中的重组载体的要求等)进行选择。例如可以选用线性载体pcom8、puc118、pak1900和ppsv37等中的至少一种。
[0052]
本发明第四方面提供一种重组宿主细胞，所述重组宿主细胞中含有如上所述的重组载体。
[0053]
本发明中，可以采用任意本领域现有的表达体系构建所述重组宿主细胞，其只要能够表达前述烷烃羟化酶蛋白即可。其可以为常用的菌株体系(例如常用于体外蛋白表达的细菌、酵母等，如大肠杆菌、假单胞菌等)。
[0054]
出于生产成本、操作便利性等方面的考虑，根据本发明的一种优选实施方式，其中，所述重组宿主细胞选自假单胞菌属(pseudomonas)的菌株。
[0055]
优选地，所述重组宿主细胞选自荧光假单胞菌(pseudomonas fluorescens)和/或恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)。
[0056]
本发明第五方面提供一种制备烷烃羟化酶的方法，所述方法包括对如上所述的重组菌株进行培养，并对培养产物进行分离纯化从而获得所述烷烃羟化酶。
[0057]
本发明对于所述重组菌株的具体培养方式和条件没有特别限制，本领域技术人员可以根据实际情况和需要(例如所选的宿主细胞类型和培养需要、根据表达效率和表达量的需求等)对培养条件进行调整。
[0058]
本发明中，可以采用任意现有的分离纯化细胞表达产物的方式和条件进行所述烷
烃羟化酶的分离和纯化，只要分离和纯化的条件对于该烷烃羟化酶的酶活性没有影响或基本没有影响(例如分离纯化的条件使得酶活性下降不超过5％)即可。
[0059]
本发明第六方面提供一种用于降解烷烃的组合物，所述组合物中含有如前所述的烷烃羟化酶，或含有如上所述的方法制备获得的烷烃羟化酶。
[0060]
根据本发明的一种优选实施方式，其中，所述组合物中可以仅含有如前所述的烷烃羟化酶，或仅含有如上所述的方法制备获得的烷烃羟化酶作为活性成分。
[0061]
为了提高对烷烃，尤其是长链烷烃的降解效率和降解效果，该组合物中还可以含有其他能够有效分解烷烃(尤其是长链烷烃)的物质(例如甘油、表面活性剂、丙酮等)作为有效成分，其只要对于所述烷烃羟化酶的活性和效果没有影响或基本没有影响(例如分离纯化的条件使得酶活性下降不超过5％)即可。
[0062]
根据本发明的另一种优选实施方式，其中，所述组合物中还可以含有辅料，优选所述组合物中烷烃羟化酶的含量为10-90重量％(余量即为所述辅料的含量)。本发明对于所述辅料的具体选择没有特别限制，其可以为能够提高所述烷烃羟化酶活性或提高所述组合物对烷烃(尤其是长链烷烃)的降解效果的物质，还可以是对所述烷烃羟化酶具有保护作用的物质。例如可以为本领域技术人员公知的溶剂(如甘油、糖类和蛋白酶抑制剂等蛋白保护剂)、激动剂(如mgcl2、cacl2)等。
[0063]
本发明第七方面提供如前所述的烷烃羟化酶(或采用前述方法制备获得的烷烃羟化酶)、编码基因、重组载体、重组宿主细胞，或者组合物在以下任意一项中的应用：
[0064]
(1)在降解烷烃中的应用；
[0065]
(2)在提高细胞对烷烃的利用能力中的应用；
[0066]
(3)在处理石油污染中的应用；
[0067]
(4)在微生物采油中的应用。
[0068]
根据本发明的优选实施方式，其中，应用(1)和/或(2)中，所述烷烃可以为(中)长链烷烃，其既可以为直链烷烃，也可以为支链烷烃，例如c原子数不低于15的烷烃，优选为c原子数15-32的烷烃，例如可以为c15、c16、c17、c18、c19、c20、c21、c22、c23、c24、c25、c26、c27、c28、c29、c30、c31、c32的烷烃。
[0069]
根据本发明的优选实施方式，其中，应用(3)中，所述烷烃可以为(中)长链烷烃，其既可以为直链烷烃，也可以为支链烷烃，例如c原子数不低于15的烷烃，优选为c原子数15-32的烷烃，例如可以为c15、c16、c17、c18、c19、c20、c21、c22、c23、c24、c25、c26、c27、c28、c29、c30、c31、c32的烷烃。
[0070]
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。应当能够理解的是，以下实施例仅用于示例性地进一步解释和说明本发明的内容，而不用于限制本发明。
[0071]
以下实施例中，未作特殊说明的情况下，采用的试剂均为购自正规化学或生物试剂供应商的商购产品，纯度为分析纯。
[0072]
实施例1
[0073]
本实施例用于说明本发明提供的烷烃羟化酶基因alkb-rd的发现和克隆。
[0074]
(一)羟化酶基因alkb-rd及其编码的羟化酶alkb的发现
[0075]
通过富集培养方法，从华北油田宝力格油区分离到一株具有良好降解长链烷烃能力的红球菌ch91(rhodococcus sp.ch91)。取其新鲜培养湿菌体，用omega公司细菌基因组
提取试剂盒获得该菌的基因组dna，进行基因组扫描图测序和基因注释(委托上海美吉生物医药科技有限公司进行)。通过检索和比对，从菌株ch91基因组中发现一个羟化酶基因alkb-rd，大小1597bp(核苷酸序列如seq id no:1所示)，编码一个414aa的羟化酶蛋白alkb(氨基酸序列如seq id no:2所示)，分子量约47kda。
[0076]
通过与genebank在线数据进行比对，与本羟化酶alkb氨基酸序列最相近的蛋白为玫瑰红红球菌(rhodococcus rhodochrous)spc17的烷烃羟化酶序列(genebank序列号mxq75360)和嗜联苯红球菌(rhodococcus biphenylivorans)tg9的烷烃羟化酶序列(genebank序列号awz25892)，其相似性均仅为92.2％，由此说明本发明提供的羟化酶alkb不同于目前已报道的烷烃羟化酶。
[0077]
(二)羟化酶基因alkb-rd的克隆
[0078]
根据羟化酶基因alkb-rd的核苷酸序列设计引物，并委托北京擎科生物科技有限公司合成相应引物。
[0079]
上游引物(91alkb2-f，seq id no:8)：
[0080]5’‑
atttaataaaaattggagaattccatatgatgagtacggcttcggcggactc-3’[0081]
下游引物(91alkb2-r，seq id no:9)：
[0082]5’‑
tctctcatccgccaaaacagaagctttcaccggcggacgatttcc-3’[0083]
以红球菌ch91基因组dna为模板，采用上述引物对羟化酶基因alkb-rd进行pcr扩增，具体pcr体系和条件如表1和表2所示。
[0084]
表1 pcr体系
[0085][0086]
表2 pcr程序
[0087][0088]
pcr产物用经琼脂糖电泳检测后，使用omega公司cycle pure kit进行纯化回收后，采用gibson方法连接到线性载体pcom8(ndei、hindiii酶切获得，购自neb公司)，连接体系和条件如表3所示。
[0089]
表3 gibson连接体系和条件
[0090][0091]
取5μl gibson连接产物转化至50μl感受态大肠杆菌dh5a(购自北京擎科生物科技有限公司公司，细胞含量约为109个/μl)中轻轻混匀，冰上静置30min后42℃热激45s，冰浴2min后加入500μl无抗lb液体培养基，37℃复苏1h，取适量复苏液(约10-100μl)涂布含庆大霉素的lb平板(庆大霉素含量50μg/ml)，37℃倒置培养约20h。挑取单克隆接种于装有1.5ml含庆大霉素的lb液体培养基的试管中(庆大霉素含量50ug/ml)，37℃培养约20h后，提取质粒并采用上述方法进行pcr，琼脂糖凝胶电泳进行阳性克隆鉴定。选取阳性克隆质粒送至金唯智生物科技有限公司测序以检验序列是否正确，防止出现移码、突变等情况。
[0092]
实施例2
[0093]
本实施例用于说明烷烃羟化酶基因alkb-rd恢复缺陷株荧光假单胞菌kob2δ1降解能力的效果。
[0094]
本实施例中涉及的烷烃均为直链烷烃。
[0095]
本实施例中涉及的培养基配方及制备方法如下：
[0096]
lb培养基：
[0097]
胰蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，nacl 10g/l，ph7.4。
[0098]
按照以上配方将原料加入去离子水中溶解、混匀，而后121℃高压灭菌10min，冷却后获得lb液体培养基。在灭菌前加入15g/l琼脂粉，灭菌后待冷却至不烫手(约50℃)时倒平板，待冷却凝固即得lb平板。
[0099]
e2培养基(e2无机盐培养基l-1)：
[0100]
nanh4hpo4·
4h2o 3.5g/l，k2hpo4·
3h2o 7.5g/l，kh2po
4 3.7g/l，维生素b2 20mg/l，100mm mgso4溶液10ml/l，feso4·
7h2o 100mg/l，鼠李糖脂100mg/l，庆大霉素50mg/l。
[0101]
按照以上配方将原料加入去离子水中溶解、混匀，而后121℃高压灭菌20min，冷却后获得e2液体培养基。
[0102]
荧光假单胞菌kob2δ1是烷烃利用菌荧光假单胞菌cha0敲除了一个烷烃羟化酶基因alkb2后的缺陷株，其不再利用c12-c16烷烃，当把其他来源的烷烃羟化酶基因插入到表达质粒pcom8转化荧光假单胞菌kob2δ1缺陷株，可以使宿主菌kob2δ1恢复降解c12-c16烷烃的能力。因此表达质粒pcom8和宿主菌荧光假单胞菌kob2δ1成为一个验证烷烃羟化酶基因功能的通用体系(具体可以参见smits,t.h.m.,s.b.balada,b.witholt,and j.b.van beilen.2002.functional analysis of alkane hydroxylases from gram-negative and grampositive bacteria.j.bacteriol.184:1733
–
1742)。
[0103]
将实施例1中获得的构建正确的表达质粒电转入荧光假单胞菌kob2δ1中，方法如下：取1ml过夜培养kob2δ1菌液，8000rpm离心2min，用冰预冷的300mm蔗糖溶液洗涤2次，最
后用100μl 300mm蔗糖溶液重悬即得到感受态细胞，冰上放置备用。2μl质粒加到感受态细胞中轻轻混匀，然后转移到冰预冷的电转杯中，2000v条件电击，加入500μl无抗lb后，在30℃，200rpm震荡条件下复苏1h。取适量复苏液涂布含庆大霉素的lb平板(庆大霉素含量约50μg/ml)，30℃倒置培养过夜。随机挑选4个阳性克隆进行提取质粒及pcr验证(结果见图1，其中左侧泳道“m”为marker，右侧泳道“1”为pcr产物)，把已成功制备的表达菌株加15％甘油，-80℃保存备用。采用相同的方法将pcom8空载体(不含alkb-rd基因)转入荧光假单胞菌kob2δ1作为对照备用。
[0104]
分别取含有pcom8-alkb表达质粒(实验组)和pcom8空载体(对照组)的荧光假单胞菌kob2δ1接入lb液体培养基过夜培养，菌液6000rpm离心后菌体用无菌的生理盐水洗涤两遍后重悬得到种子液(od
600
＝1.0)。然后以5％体积的接种量分别将种子液接种于含有混合烷烃的e2培养基，30℃，200rpm震荡培养2周。
[0105]
采用gc-ms法检测菌株对各烷烃的降解情况，具体方法如下：向待萃取的样品中加入20μl的菲内标溶液(1mg/ml)，混匀。加入hplc级的正己烷，震荡萃取未被利用的烷烃溶于有机相中，离心。转移有机相到新的ep管中，重复正己烷萃取一次，合并有机相至ep管中，加入无水na2so4去除可能残余的水分。经0.22μm有机滤膜过滤后gc-ms检测，以峰面积表征烷烃的含量，并计算相对于空载的降解率(降解率＝对照组烷烃含量-实验组烷烃含量/对照组烷烃含量
×
100％)。
[0106]
gc-ms检测结果如图2所示，从图中可以看出缺陷株荧光假单胞菌kob2δ1表达本发明的alkb蛋白后，培养液中长链烷烃含量降低，说明表达菌株(实验组，pcom8-alkb/kob2δ1)能够降解c16-c32的长链烷烃，且其中对于c16-c28的长链烷烃的降解效果更佳。图3中示出了表达菌株对c16-c33的长链烷烃的降解率，从图中可以看出，相对于空载(对照组，pcom8/kob2δ1)，c16-c28烷烃的降解率增加30％以上，说明本发明的羟化酶alkb具有很好的长链烷烃降解能力。
[0107]
实施例3
[0108]
本实施例用于说明烷烃羟化酶基因alkb-rd改造恶臭假单胞菌kt2440降解长链烷烃的效果。
[0109]
本实施例中涉及的烷烃均为直链烷烃。
[0110]
按照实施例2中的方法构建重组菌并对其降解能力进行检测，不同的是，将荧光假单胞菌kob2δ1替换为恶臭假单胞菌kt2440(购自atcc，atcc编号为atcc 47054)。恶臭假单胞菌kt2440不具有利用和降解烷烃的能力，选用恶臭假单胞菌kt2440作为宿主菌，通过外源表达alkb-rd基因使其具备降解长链烷烃的能力。
[0111]
图4(a)示出了导入了alkb-rd基因的重组菌pcom8-alkb/kt2440和导入了空载体的重组菌pcom8/kt2440的gcms检测结果，从图中可以看出，重组菌pcom8-alkb/kt2440具有了较好的降解烷烃的能力(图中“菲c18”为菲内标)。图4(b)示出了重组菌pcom8-alkb/kt2440对c16、c18、c20和c22的烷烃的降解率，从图中可以看出，相对于空载重组菌对c16-c22烷烃的降解率达20％以上，说明改造后的恶臭假单胞菌kt2440具有良好的长链烷烃降解能力。
[0112]
上述结果说明本发明提供的烷烃羟化酶alkb的编码基因alkb-rd可用于改造其它菌株，以提高其降解烷烃能力。
[0113]
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种烷烃羟化酶，其特征在于，所述烷烃羟化酶包括以下氨基酸序列：(a)如seq id no:2所示的氨基酸序列；或者(b)seq id no:2所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸后获得的衍生蛋白质，其酶活性不低于(a)的酶活性的95％。2.根据权利要求1所述的烷烃羟化酶，其中，所述烷烃羟化酶中还含有便于分离纯化的氨基酸标签；优选地，所述氨基酸标签选自多组氨酸标签、血凝素标签、flag标签、myc标签和荧光标签中的至少一种。3.权利要求1或2所述的烷烃羟化酶的编码基因。4.根据权利要求3所述的编码基因，其中，所述编码基因包括如seq id no:1所示的核苷酸序列。5.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体中含有权利要求3或4所述的编码基因。6.一种重组宿主细胞，其特征在于，所述重组宿主细胞中含有权利要求5所述的重组载体。7.根据权利要求6所述的重组菌株，其中，所述重组宿主细胞选自假单胞菌属(pseudomonas)的菌株；优选地，所述重组宿主细胞选自荧光假单胞菌(pseudomonas fluorescens)和/或恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)。8.一种制备烷烃羟化酶的方法，其特征在于，所述方法包括对权利要求6或7所述的重组菌株进行培养，并对培养产物进行分离纯化从而获得所述烷烃羟化酶。9.一种用于降解烷烃的组合物，其特征在于，所述组合物中含有权利要求1或2所述的烷烃羟化酶，或含有权利要求8所述的方法制备获得的烷烃羟化酶；优选地，所述组合物中仅含有权利要求1或2所述的烷烃羟化酶，或含有权利要求8所述的方法制备获得的烷烃羟化酶作为活性成分；优选地，所述组合物中还含有辅料，优选所述组合物中烷烃羟化酶的含量为10-90重量％。10.权利要求1或2所述的烷烃羟化酶、权利要求3或4所述的编码基因、权利要求5所述的重组载体、权利要求6或7所述的重组宿主细胞，或者权利要求9所述的组合物在以下任意一项中的应用：(1)在降解烷烃中的应用；(2)在提高细胞对烷烃的利用能力中的应用；(3)在处理石油污染中的应用；(4)在微生物采油中的应用。

技术总结
本发明涉及微生物技术领域，公开了一种烷烃羟化酶及其编码基因和应用。本发明提供的烷烃羟化酶对长链烷烃具有较好的降解能力，而且本发明优选的编码基因能够较为稳定地在常见表达载体中高效表达，且其导入受体细胞/受体菌后，能够有效改善受体细胞/受体菌对烷烃(尤其是长链烷烃)的降解能力，在微生物法处理石油污染或微生物采油等方面具有重要的应用价值。值。值。


技术研发人员：薛燕芬 向伟 马延和
受保护的技术使用者：中国科学院微生物研究所
技术研发日：2022.03.17
技术公布日：2023/9/22