新型冠状病毒疫苗中S蛋白含量的检测方法与流程

新型冠状病毒疫苗中s蛋白含量的检测方法
技术领域
1.本公开涉及新型冠状病毒(sars-cov-2)灭活疫苗的检测技术领域。具体涉及用于 sars-cov-2灭活疫苗的s蛋白含量检测的特征多肽，检测试剂盒及其检测方法。


背景技术：

2.新型冠状病毒肺炎(covid-19)是以严重急性呼吸系统综合征冠状病毒(sars-cov-2) 为病原体的疾病，可以引起人体急性呼吸道传染病。为了应对covid-19的传播，疫苗是一种有效方式，成为了全球药物研发的关注焦点。
3.灭活疫苗是针对传染性疾病的最有效的疫苗研发途径。目前，sars-cov-2病毒由原型株逐渐进化出多个主要变异株，包括alpha、beta、gamma、delta、omicron等。针对这些变异株的流行，正在研制和生产新一代的变异株疫苗，以及针对原型株和变异株的二价或多价疫苗。而对于灭活疫苗中不同毒株的有效抗原(免疫原)的含量，例如对sars-cov-2中的s蛋白和n蛋白的含量检测，对于疫苗评价有着十分重要的意义。
4.通常使用酶联免疫吸附测定(elisa)对疫苗的抗原含量进行定量，作为疫苗的关键评价指标之一。但由于原型株与变异株的病毒抗原表位差异不大，在评价包含原型株与变异株的二价或多价苗的抗原含量时，采用elisa抗原检测系统无法分别准确定量原型株与变异株。因此，亟需建立一种能够对二价或多价疫苗或其中间品中的不同抗原分别进行准确定量的方法。


技术实现要素：

5.为了解决现有技术中存在的上述技术问题之一，本公开提供了新型冠状病毒原型株和 gamma株的特征肽段。本公开利用新型冠状病毒的s蛋白酶切后特征肽段序列，采用合成肽标准物质(ps)和稳定同位素标记肽内标(sips)完成定量分析，具备高通量的定量分析能力。通过加入sips，可以大大降低离子抑制、基质效应和样品前处理过程的误差造成的影响，得到更准确的定量结果。基于特征肽段，可以准确测定新型冠状病毒原型株和/或gamma株的s蛋白的量。
6.根据本公开的一个方面，提供了一种用于定量检测新型冠状病毒s蛋白的多肽。根据本公开的实施方式，所述多肽包括如asanlaatk(seq id no.:1)所示的氨基酸序列。根据本公开的实施方式，所述多肽包括如asanlaaik(seq id no.:2)所示的氨基酸序列。
7.根据本公开的实施方式，所述多肽是未经标记的。
8.根据本公开的实施方式，所述多肽带有可检测的标记物。可检测的标记物是指，可以通过质谱、荧光、光谱、光化学、生物化学、免疫学、电学、光学或化学手段检测的任何物质。这类标记物是本领域公知的，包括但不限于，同位素(例如，稳定同位素，如2h、
13
c、
15
n、
17
o、
18
o)、酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶等)、荧光染料(例如，异硫氰酸荧光素(fitc)、荧光素、异硫氰酸四甲基罗丹明 (tritc)、藻红蛋白(pe)、德克萨斯红、罗丹明、量子点或花菁染料衍生物(例如cy7、 alexa 750)、吖啶酯类
化合物、磁珠(例如，)、测热标记物例如胶体金或有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等)，以及用于结合上述标记物修饰的亲和素 (例如，链霉亲和素)的生物素。
9.根据本公开的实施方式，所述多肽带有同位素标记。根据本公开的实施方式，所述多肽中的一个或多个氨基酸带有同位素标记物。所述同位素标记物优选选自2h、
13
c、
15
n、
17
o、
18
o及其任意组合。
10.根据本公开的实施方式，所述多肽的赖氨酸中的一个或多个原子被对应的同位素替换。根据具体的实施方式，包括氨基酸序列如asanlaatk(seq id no.:1)所示的多肽的第9 位赖氨酸(k)带有同位素标记。根据具体的实施方式，包括氨基酸序列如asanlaaik (seq id no.:2)所示的多肽的第9位赖氨酸(k)带有同位素标记。例如赖氨酸上的c原子被替换成
13
c，n原子被替换成
15
n，h原子被替换成2h，o原子被替换成
17
o或
18
o。
11.根据另一方面，提供了一种用于定量检测新型冠状病毒s蛋白的试剂盒。
12.根据本公开的实施方式，所述试剂盒包括第一多肽，其包括如asanlaatk(seq idno.:1)所示的氨基酸序列。根据一些实施方式，所述第一多肽可带有可检测的标记物。
13.根据本公开的实施方式，所述试剂盒包括第二多肽，其包括如asanlaaik(seq idno.:2)所示的氨基酸序列。根据一些实施方式，所述第二多肽可带有可检测的标记物。
14.根据本公开的实施方式，所述试剂盒包括：第一多肽，其包括如asanlaatk(seq idno.:1)所示的氨基酸序列；和，第二多肽，其包括如asanlaaik(seq id no.:2)所示的氨基酸序列。根据一些实施方式，所述第一多肽可以带有可检测的标记物。根据一些实施方式，所述第二多肽可带有可检测的标记物。
15.根据本公开的实施方式，所述第一多肽和/或所述第二多肽中的一个或多个氨基酸带有同位素标记物。根据具体的实施方式，所述同位素标记物可以选自2h、
13
c、
15
n、
17
o、
18
o及其任意组合。
16.根据本公开的实施方式，所述第一多肽和/或所述第二多肽的赖氨酸中的一个或多个原子被对应的同位素替换。
17.根据本公开的实施方式，所述第一多肽用于测定新型冠状病毒原型株s蛋白的量。根据本公开的实施方式，所述新型冠状病毒原型株也被称为sars-cov-2或者2019-ncov。
18.根据本公开的实施方式，所述第二多肽用于测定新型冠状病毒gamma株s蛋白的量。所述新型冠状病毒gamma株是发现的病毒变种，编号为p.1，命名为新型冠状病毒gamma株。
19.根据本公开的实施方式，所述试剂盒还包括变性剂、还原剂、烷基化试剂和蛋白酶中的一种或多种。
20.根据具体的实施方式，所述变性剂可以选自尿素、十二烷基磺酸钠、辛烷磺酸钠或 rapigestsf溶液。
21.根据具体的实施方式，所述还原剂可以选自二硫苏糖醇、巯基乙醇或三(2-羧乙基)膦。
22.根据具体的实施方式，所述烷基化试剂选自碘乙酰胺。
23.根据具体的实施方式，所述蛋白酶选自胰蛋白酶。
24.根据又一方面，提供了一种用于定量检测新型冠状病毒s蛋白的方法。所述方法可
以包括：使用蛋白酶消化待测样品，得到消化产物；和，使用高效液相色谱和质谱测定所述消化产物中的第一多肽和/或第二多肽的量。
25.根据本公开的实施方式，所述第一多肽包括如asanlaatk(seq id no.:1)所示的氨基酸序列。根据本公开的实施方式，所述第二多肽包括如asanlaaik(seq id no.:2)所示的氨基酸序列。
26.根据本公开的实施方式，所述方法还包括：在所述消化产物中，加入带可检测的标记物的所述第一多肽作为第一内标物，和/或，加入带可检测的标记物的所述第二多肽作为第二内标物。根据具体的实施方式，可以基于所述第一内标物的量来绘制标准曲线，用于计算第一多肽的量，从而可以计算新型冠状病毒原型株的s蛋白的量。根据具体的实施方式，可以基于所述第二内标物的量来绘制标准曲线，用于计算第二多肽的量，从而可以计算新型冠状病毒gamma株的s蛋白的量。
27.根据本公开的实施方式，所述第一内标物和/或所述第二内标物中的一个或多个氨基酸带有同位素标记物。根据具体的实施方式，所述同位素标记物可以选自2h、
13
c、
15
n、
17
o、
18
o及其任意组合。根据具体的实施方式，所述第一内标物可以为 asanlaat{lys(13c6,15n2)}。根据具体的实施方式，所述第二内标物可以为 asanlaai{lys(13c6,15n2)}。
28.根据本公开的实施方式，所述蛋白酶选自胰蛋白酶。
29.根据本公开的实施方式，所述质谱的监测模式为平行反应监测(prm)模式。
30.作为最具潜力的蛋白定量工具，高效液相色谱-高分辨质谱联用(hplc-hrms)具备高敏感度和高通量的特性。采用高分辨质谱进行蛋白定量的常用模式包括，基于一级质谱酶切后肽段离子的离子流色谱峰(sim)模式，和基于二级质谱碎片离子的平行反应监测(prm) 模式。两种模式中，通常都利用酶切后肽段(碎片)的prm模式色谱峰峰面积来代表蛋白的实际量。高分辨质谱利用了一蛋白所特有的肽段序列来完成定量分析，一次运行可同时分析几种到几十种的蛋白，具备高通量的定量分析能力，在复杂的蛋白混合物定量领域中有着广阔的应用前景。相比于亲和方法，prm不受到蛋白混合物种类及特异性的限制。
31.根据具体的实施方式，所述待测样品选自灭活的新型冠状病毒2019-ncov株疫苗。根据具体的实施方式，所述待测样品选自灭活的新型冠状病毒gamma株疫苗。根据具体的实施方式，所述待测样品选自灭活的新型冠状病毒2019-ncov株+gamma株疫苗，即同时包括灭活的新型冠状病毒2019-ncov株病毒和灭活的gamma株病毒。
32.根据本公开的实施方式，所述用于定量检测新型冠状病毒s蛋白的方法可以包括以下步骤：
33.(1)取新型冠状病毒灭活疫苗2019-ncov株和/或gamma株进行酶解前处理，得到酶解液；
34.(2)将步骤(1)所得的酶解液进行高效液相色谱-高分辨质谱联用检测，根据2019-ncov株和/或gamma株的s蛋白的特征肽段的色谱峰面积和标准工作曲线，得到所述酶解液中2019
‑ꢀ
ncov株和/或gamma株的s蛋白的含量，通过所述酶解液的体积与新型冠状病毒灭活疫苗 2019-ncov株和/或gamma株的体积换算，得到新型冠状病毒灭活疫苗2019-ncov株和/或 gamma株的s蛋白的含量。
35.根据具体的实施方式，上述步骤(1)可以包括：取500μl新型冠状病毒灭活疫苗 12000rpm离心10分钟，弃去上清液，向残渣中加入100μl蛋白质变性剂溶液并混匀，置于干
式恒温金属浴中，50～90℃加热15分钟；加入10μl二硫键断裂试剂溶液并混匀，50～90℃反应60分钟；冷却至室温后，加入10μl烷基化试剂溶液并混匀，于室温下避光反应60分钟；加入500μl碳酸氢铵溶液、内标液100μl及10μl胰蛋白酶溶液并混匀，37℃反应10～ 20小时，加入5μl酸性溶液并混匀，定容至1ml；12000rpm离心10分钟，取上清液，即酶解液。
36.根据具体的实施方式，所述高效液相色谱采用辛烷基硅烷键合硅胶色谱柱。根据具体的实施方式，所述高效液相色谱采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱。根据具体的实施方式，所述色谱柱的柱温为50～90℃。
37.根据具体的实施方式，所述高效液相色谱的条件可以包括：采用辛烷基硅烷键合硅胶色谱柱或十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；柱温为50～90℃；流动相a为含离子交换剂的水溶液；流动相b有两种形式：离子交换剂与有机溶剂的混合液或离子交换剂、有机溶剂和水的混合液；梯度为0～10min，5％～32％流动相b；10～10.1min，32％～90％流动相b；10.1～ 12min，90％流动相b；12～12.1min，90％～5％流动相b；12.1～17min，5％流动相b；流速：0.2～0.5ml/min。
38.根据具体的实施方式，所述高分辨质谱检测的条件可以包括：esi离子源，正离子模式；高分辨质谱仪；离子源温度：250～350℃；辅气流速：5～15arb；壳气流速：25～45arb；离子传输毛细管：250～350℃；接口电压：3.0～4.5kv，碰撞能量20～40。
39.根据具体的实施方式，对于所述第一多肽，使用产物离子390.234作为定量用二级离子。根据具体的实施方式，对于所述第二多肽，使用产物离子629.398作为定量用二级离子。根据具体的实施方式，对于所述第一内标，使用产物离子398.249作为定量用二级离子。根据具体的实施方式，对于所述第二多肽，使用产物离子637.412作为定量用二级离子。
40.根据具体的实施方式，所述体积换算可以根据以下公式来进行：
41.c＝c
测
×v2
/v142.其中，v1指所述酶解液的体积，v2指定容后的待测液体积，c
测
指由标准工作曲线得出待测液中待测组份的含量，c指待测样品中的待测组分的含量。
43.根据具体的实施方式，所述胰蛋白酶溶液的浓度可以为0.2～1μg/μl，可以通过使用 100～500μl 50mmol/l碳酸氢铵溶液溶解100μg胰蛋白酶来获得。
44.根据具体的实施方式，所述色谱条件中的所述离子交换剂为也适用于质谱的酸或盐，或酸和盐的混合物。例如，所述盐可以选自甲酸铵或乙酸铵，所述酸可以选自甲酸或乙酸。
45.根据具体的实施方式，所述流动相a中，所述离子交换剂选择盐，所述离子交换剂的水溶液的浓度为0～20mmol/l。
46.根据具体的实施方式，所述流动相a中，所述离子交换剂选择酸时，酸与水的体积比为 (0～10):(100～1000)。
47.根据具体的实施方式，所述流动相b中，所述离子交换剂为酸时，离子交换剂、有机溶剂、水的体积比为(1～2):(200～1000):(0～1000)。
48.根据具体的实施方式，所述流动相b中，所述离子交换剂为盐时，盐溶于水中形成盐水溶液，有机溶剂：盐水溶液的体积比为100～60:0～40，其中盐溶液的浓度为0～40mmol/l。
49.根据具体的实施方式，所述流动相b中的有机溶剂可以包括甲醇、乙腈。
50.根据具体的实施方式，所述变性剂的浓度为0.05％～0.2％。
51.根据具体的实施方式，所述酸性溶液选自甲酸、乙酸、三氟乙酸水溶液中的一种或多种。甲酸、乙酸、三氟乙酸与水的体积比为100～1:0～100。
52.根据具体的实施方式，所述还原剂的浓度可以为50mmol/l～1mol/l。
53.根据具体的实施方式，所述样品前处理方法中的碳酸氢铵溶液浓度可以为10～ 500mmol/l。根据具体的实施方式，所述样品前处理方法中的碳酸氢铵溶液浓度可以为50～ 100mmol/l。
54.根据具体的实施方式，所述烷基化试剂的浓度可以为100mmol/l～2mol/l。根据具体的实施方式，所述烷基化试剂的浓度可以为1mol/l。
55.根据具体的实施方式，所述第一内标物的浓度可以为150～300ng/ml。根据具体的实施方式，所述第二内标物的浓度可以为600～1000ng/ml。
56.本发明公开了新型冠状病毒灭活疫苗2019-ncov株和gamma株的s蛋白的特征多肽，和采用特征多肽对新型冠状病毒灭活疫苗2019-ncov株和/或gamma株的s蛋白进行定量测定。本公开采用了高效液相色谱-高分辨质谱联用的方法，建立了一种高通量、高选择性、高灵敏度的新型冠状病毒灭活疫苗(2019-ncov株、gamma株或2019-ncov株+gamma株)中不同毒株的s蛋白的定量方法。本公开首次从复杂的疫苗基质中筛选出可用于新型冠状病毒灭活疫苗s蛋白定量分析的差异肽段，可实现不同批次新型冠状病毒灭活疫苗(2019-ncov 株、gamma株或2019-ncov株+gamma株)中不同毒株s蛋白的定量。
57.本公开的方法既可以实现新型冠状病毒灭活疫苗的不同毒株的活性蛋白的含量测定，又可以用于比较二价或多价疫苗不同批次活性蛋白的含量、评估产品批次重复性，可为相关产品质量控制标准的建立提供参考。本公开筛选出了新的新型冠状病毒灭活疫苗2019-ncov株和gamma株的s蛋白的特征肽段。本公开筛选出的特征肽段具有高选择性和抗基质干扰能力，可用于新型冠状病毒灭活疫苗中活性蛋白的定量研究。
58.另外，本公开的方法可通过一次酶解，一次进样且液相分离和质谱检测时间在非常短的时间(例如17分钟)内，实现新型冠状病毒灭活疫苗不同毒株活性蛋白的同时含量测定。而且本公开的方法能够进行一致的、可重复的、高通量的精准定量分析。相比于原有抗原检测系统无法分别及准确定量二价或多价疫苗中原型株与变异株的问题，本公开的方法不会受到蛋白混合物种类及特异性的限制，可得到准确的相对定量结果。
附图说明
59.图1示出了多肽标准物质和内标多肽标准物质典型色谱图。图1中，自上而下显示了多肽asanlaatk、多肽asanlaat{lys(13c6,15n2)}、多肽asanlaaik、多肽 asanlaai{lys(13c6,15n2)}的色谱图。
60.图2示出了原型株特征多肽asanlaatk标准物质典型二级质谱图。
61.图3示出了原型株内标多肽asanlaat{lys(13c6,15n2)}标准物质典型二级质谱图。
62.图4示出了gamma株特征多肽asanlaaik标准物质典型二级质谱图。
63.图5示出了gamma株内标多肽asanlaai{lys(13c6,15n2)}标准物质典型二级质谱图。
具体实施方式
64.为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于构成对本发明的任何限制。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本公开的概念。这样的结构和技术在许多出版物中也进行了描述。
65.定义
66.除非另有定义，否则本发明使用的所有技术术语和科技术语都具有如在本发明所属领域中通常使用的相同含义。出于解释本说明书的目的，将应用以下定义，并且在适当时，以单数形式使用的术语也将包括复数形式，反之亦然。
67.除非上下文另有明确说明，否则本文所用的表述“一种”和“一个”包括复数指代。例如，提及“一个细胞”包括多个这样的细胞及本领域技术人员可知晓的等同物等等。
68.本文所用的术语“约”表示其后的数值的
±
20％的范围。在一些实施方式中，术语“约”表示其后的数值的
±
10％的范围。在一些实施方式中，术语“约”表示其后的数值的
±
5％的范围。
69.病毒在复制的过程中，核酸序列有时会发生突变。具有一个或多个新突变的病毒株可称为原始病毒株的“变异株”。病毒随着传播时间越长，发生突变的可能性越大。与原始病毒株相比，这些突变有的可能导致病毒特征的改变，例如改变适应环境的能力、传播性或严重程度。这种改变和选择成功变异的过程被称为病毒进化。下面提供实施例和附图以帮助理解本发明。但应理解，这些实施例和附图仅用于说明本发明，但不构成任何限制。本发明的实际保护范围在权利要求书中进行阐述。应理解，在不脱离本发明精神的情况下，可以进行任何修改和改变。
70.本发明所述的多价新型冠状病毒灭活疫苗(原型株+gamma株)包含新冠病毒原型株与 gamma株，或在上述两种毒株的基础上增加其他毒株。其制备方法为：不同毒株的病毒分别接种接种非洲绿猴肾细胞(简称：vero细胞)，经病毒培养、收获病毒液、灭活病毒、浓缩、纯化和氢氧化铝吸附制成。用于预防由新冠病毒感染所致的疾病。
71.实施例中所使用的仪器、试剂及材料的来源
72.1、主要的实验仪器：高效液相色谱仪(包含高压二元泵、脱气机、自动进样器、柱温箱) 购自赛默飞世尔科技公司；高分辨质谱仪购自赛默飞世尔科技公司。
73.2、实验试剂：rapigest购自沃特世(上海)科技有限公司；甲酸、乙酸、三氟乙酸、碳酸氢铵、二硫苏糖醇、三(2-羧乙基)膦、尿素、十二烷基磺酸钠、辛烷磺酸钠及碘乙酰胺购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；甲醇、乙腈购自赛默飞世尔科技公司；胰蛋白酶购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司。
74.3、新型冠状病毒灭活疫苗(原型株+gamma株，二价疫苗)由科兴中维生物技术有限公司提供。
75.4、合成多肽标准物质(ps)和稳定同位素标记多肽内标标准物质(sips)由金斯瑞生物科技股份有限公司合成。
76.实施例
77.实施例1.新型冠状病毒原型株和gamma株的s蛋白的定量肽段及定量离子对的确定
78.原型株s蛋白及gamma株s蛋白，经胰蛋白酶酶切有10条差异肽段，筛选出差异肽段组合为原型株肽段asanlaatk(seq id no.:1)和gamma株肽段asanlaaik(seq idno.:2)。
79.合成原型株特征多肽asanlaatk(seq id no.:1)、原型株内标多肽 asanlaat{lys(13c6,15n2)}、gamma株特征多肽asanlaaik(seq id no.:2)和 gamma株内标多肽asanlaai{lys(13c6,15n2)}。
80.按照如下步骤进行高效液相色谱串联质谱检测分析。
81.1.检测条件
82.色谱柱：waters acquity uplc peptide beh c18色谱柱。流动相：a-甲酸：水(1:1000， v/v)；b-甲酸：乙腈(1:1000，v/v)；梯度：0～10min，5％b～32％b；10～10.1min，32％b～ 90％b；10.1～12min，90％b；12～12.1min，90％b～5％b；12.1～17min，5％b；流速：0.4 ml/min；柱温为60℃；进样体积：10μl。
83.质谱条件：离子源：esi+模式；质谱仪：高分辨质谱仪；离子源温度：320℃；辅气流速： 10arb；壳气流速：40arb；离子传输毛细管：350℃；接口电压：4kv。质谱检测器检测模式为平行反应监测(prm)模式。
84.质谱检测参数见表1。
85.表1.质谱prm检测参数
[0086][0087]
表1中所示的4个特征肽段的色谱图示于图1中，质谱结果分别如图2～5所示。
[0088]
从图2的结果可以看出，其中响应较高同时质荷比较高的390.234碎片离子可作为定量用二级离子。从图3的结果可以看出，其中响应较高同时质荷比较高的398.249碎片离子可作为定量用二级离子。从图4的结果可以看出，其中响应较高同时质荷比较高的629.398碎片离子可作为定量用二级离子。从图5的结果可以看出，其中响应较高同时质荷比较高的 637.412碎片离子可作为定量用二级离子。
[0089]
实施例2.抗基质干扰测试
[0090]
原型株：取浓度为50μg/ml原型株的s蛋白原液100μl，置于低吸附离心管中， 12000rpm离心10分钟，弃去上清液，向残渣中加入内标液100μl以及100μl蛋白质变性剂溶液并混匀，置于干式恒温金属浴中，50～90℃加热15分钟；加入10μl二硫键断裂试剂溶液并混匀，50～90℃反应60分钟；冷却至室温后，加入10μl烷基化试剂溶液并混匀，于室温下避光反应60分钟；加入500μl碳酸氢铵溶液及10μl胰蛋白酶溶液并混匀，37℃反应 10～20小时，加入5μl酸性溶液并混匀，定容至1ml；12000rpm离心10分钟，取上清液，即酶解液。将酶解液按照实施例1确定的条件进行液相色谱和prm质谱分析。若所得prm 质谱图中无其它响应(即，响应强度为0)，或有响应强度值但仅为基线噪音(即，没有色谱峰检出)，则原型株特征肽段为原型株特征肽段，无法从其它基质蛋白酶解得到，即肽段具有特异性和抗基质干扰能力。
[0091]
提取的离子流色谱图中，原型株色谱图中出现与多肽asanlaatk标准物质相同保
留时间的色谱峰，未出现与多肽asanlaaik标准物质相同保留时间的色谱峰。
[0092]
gamma株：取浓度为50μg/ml gamma株的s蛋白原液100μl，置于低吸附离心管中，按上述方法进行酶解，液相色谱和prm质谱分析。若所得prm质谱图中无其它响应(即，响应强度为0)，或有响应强度值但仅为基线噪音(即，没有色谱峰检出)，则gamma株特征肽段为gamma株特征肽段，无法从其它基质蛋白酶解得到，即肽段具有特异性和抗基质干扰能力。
[0093]
提取的离子流色谱图中，gamma色谱图中出现与多肽asanlaaik标准物质相同保留时间的色谱峰，未出现与多肽asanlaatk标准物质相同保留时间的色谱峰。
[0094]
实施例3.线性分析和定量限度
[0095]
1.线性
[0096]
①
肽标准物质(ps)储备液配置：取多肽标准物质(ps)固体分别用50mmol/l碳酸氢铵溶液溶解成浓度为为1μg/ml的标准储备液。
[0097]
②
稳定同位素标记肽内标储备液配置：取稳定同位素标记多肽内标标准物质(sips)固体分别用50mmol/l碳酸氢铵溶液溶解成浓度为1μg/ml的标准储备液。
[0098]
③
标准系列溶液配置：量取各标准储备液适量，配成标准系列溶液，结果见表2所示。
[0099]
获得标准曲线方程：y＝ax+b；r2[0100]
式中：
[0101]
x-蛋白特征多肽浓度与同位素标记特征多肽浓度比值；
[0102]
y-蛋白特征多肽峰面积与同位素内标特征多肽峰面积比值；
[0103]
a-常数；
[0104]
b-常数；
[0105]r2-相关系数。
[0106]
2.定量限(loq)
[0107]
以各特征多肽为监测对象，当该肽段的响应大约等于10倍噪音时，对应的蛋白浓度作为该方法定量下限，即loq(μg/ml)，结果见表2所示。
[0108]
实施例4.重复性测定
[0109]
1.酶解重复性
[0110]
取原型株+gamma株二价苗样品10支，合并内容物并混匀。取500μl样品溶液，12000 rpm离心10分钟，弃去上清液。向残渣中加入内标液100μl以及100μl 0.1％rapigest溶液，混匀，置于干式恒温金属浴中，60℃加热15分钟。然后，加入10μl 500mmol/l的二硫苏糖醇溶液，60℃加热60min。冷却至室温后，避光操作，加入10μl 1mmol/l的碘代乙酰胺溶液，室温放置60min。加入500μl碳酸氢铵溶液，加入10μl胰蛋白酶溶液，37℃酶解16 小时。加入4μl三氟乙酸并混匀，37℃放置30min。定容至1ml，12000rpm离心5min，取上清液10μl进样分析，同样操作重复6次。6次所得酶解液分别进样，所得肽段峰面积求相对标准偏差，结果见表2所示。
[0111]
2.进样重复性
[0112]
取酶解重复性溶液中一个溶液，连续进样5次，每次进样10μl，所得肽段峰面积求相对标准偏差，结果见表2所示。
[0113]
表2.蛋白方法重复性和酶解重复性考察结果
[0114][0115]
实施例5.新型冠状病毒灭活疫苗(原型株+gamma株)中原型株s蛋白及gamma株s蛋白含量测定
[0116]
检测条件：同实施例1。
[0117]
标准曲线：同实施例3。
[0118]
样品处理：取原型株+gamma株二价苗(中剂量)样品10支，合并内容物并混匀，取 1000μl样品溶液12000rpm离心10分钟，弃去上清液，向残渣中加入内标液100μl以及 100μl 0.1％rapigest溶液并混匀，置于干式恒温金属浴中，60℃加热15min；加入10μl 500mmol/l的二硫苏糖醇溶液，60℃加热60min；冷却至室温后，避光操作，加入10μl 1mmol/l的碘代乙酰胺溶液，室温放置60min；加入500μl碳酸氢铵溶液，加入10μl胰蛋白酶溶液，37℃酶解14小时；加入4μl三氟乙酸并混匀，37℃放置30min；定容至1ml， 12000rpm离心5min，取上清液10μl进样分析。
[0119]
取原型株+gamma株二价苗(高剂量)样品10支，合并内容物并混匀，取500μl样品溶液12000rpm离心10分钟，弃去上清液，向残渣中加入内标液100μl以及100μ l0.1％rapigest溶液并混匀，置于干式恒温金属浴中，60℃加热15min；加入10μl 500 mmol/l的二硫苏糖醇溶液，60℃加热60min；冷却至室温后，避光操作，加入10μl1mmol/l的碘代乙酰胺溶液，室温放置60min；加入500μl碳酸氢铵溶液，加入10μl胰蛋白酶溶液，37℃酶解14小时；加入4μl三氟乙酸并混匀，37℃放置30min；定容至1ml， 12000rpm离心5min，取上清液10μl进样分析。
[0120]
试样中特征多肽含量按照以下公式来计算：
[0121]
mt＝(x
×
ci
×
v1)/v2
[0122]
式中：
[0123]
mt-试样中特征多肽含量，ng/ml；
[0124]
x-样品中特征多肽与同位素内标特征多肽的浓度比；
[0125]
ci-同位素内标特征多肽浓度，ng/ml；
[0126]
v1-样品最终定容体积，ml；
[0127]
v2-最终测试样液的试样体积，ml。
[0128]
所得样品酶解液定容后，用液相色谱串联高分辨质谱进行分析检测，将所得特征肽段峰面积计算出上述两种不同含量的疫苗待测样品中s蛋白的浓度。
[0129]
结果显示，在原型株+gamma株二价疫苗(中剂量)样品中，含原型株s蛋白以多肽 asanlaatk计为6.8ng/ml，含gamma株s蛋白以多肽asanlaaik计为9.1ng/ml。
[0130]
另一种含量的原型株+gamma株二价疫苗(高剂量)样品中，含原型株s蛋白以多肽 asanlaatk计为12.8ng/ml，含gamma株s蛋白以多肽asanlaaik计为18.8ng/ml。
[0131]
本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种用于定量检测新型冠状病毒s蛋白的多肽，其特征在于，所述多肽包括如asanlaatk(seq id no.:1)或asanlaaik(seq id no.:2)所示的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽是未经标记的或带有可检测的标记物，优选地，所述多肽中的一个或多个氨基酸带有同位素标记物，所述同位素标记物优选选自2h、
13
c、
15
n、
17
o、
18
o及其任意组合，优选地，所述多肽的赖氨酸中的一个或多个原子被对应的同位素替换。3.一种用于定量检测新型冠状病毒s蛋白的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：第一多肽，其包括如asanlaatk(seq id no.:1)所示的氨基酸序列，和/或第二多肽，其包括如asanlaaik(seq id no.:2)所示的氨基酸序列；优选地，所述第一多肽和/或所述第二多肽中的一个或多个氨基酸带有可检测的标记物，所述可检测的标记物优选为同位素标记物，更优选选自2h、
13
c、
15
n、
17
o、
18
o及其任意组合，优选地，所述第一多肽和/或所述第二多肽的赖氨酸中的一个或多个原子被对应的同位素替换。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述第一多肽用于测定新型冠状病毒2019-ncov株s蛋白的量，和/或所述第二多肽用于测定新型冠状病毒gamma株s蛋白的量。5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括变性剂、还原剂、烷基化试剂和蛋白酶中的一种或多种，优选地，所述变性剂选自尿素、十二烷基磺酸钠、辛烷磺酸钠或rapigestsf溶液；优选地，还原剂选自二硫苏糖醇、巯基乙醇或三(2-羧乙基)膦；优选地，所述烷基化试剂选自碘乙酰胺；优选地，所述蛋白酶选自胰蛋白酶。6.一种用于定量检测新型冠状病毒s蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括：使用蛋白酶消化待测样品，得到消化产物；和使用高效液相色谱和质谱测定所述消化产物中的第一多肽和/或第二多肽的量，其中，所述第一多肽包括如asanlaatk(seq id no.:1)所示的氨基酸序列，所述第二多肽包括如asanlaaik(seq id no.:2)所示的氨基酸序列。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：在所述消化产物中，加入带可检测的标记物的所述第一多肽作为第一内标物，和/或加入带可检测的标记物的所述第二多肽作为第二内标物；基于所述第一内标物和/或所述第二内标物的量绘制标准曲线，优选地，所述第一内标物和/或所述第二内标物中的一个或多个氨基酸带有同位素标记物，所述同位素标记物优选选自2h、
13
c、
15
n、
17
o、
18
o及其任意组合，优选地，所述蛋白酶选自胰蛋白酶。8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱采用辛烷基硅烷键合硅胶色谱柱或十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；优选地，所述色谱柱的柱温为50～90℃。9.根据权利要求6至8中任一项所述的方法，其特征在于，对于所述第一多肽，使用产物
离子390.234作为定量用二级离子；对于所述第二多肽，使用产物离子629.398作为定量用二级离子。10.根据权利要求7至9中任一项所述的方法，其特征在于，所述待测样品选自灭活的新型冠状病毒2019-ncov株疫苗，灭活的新型冠状病毒gamma株疫苗，或灭活的新型冠状病毒2019-ncov株+gamma株疫苗。

技术总结
本公开涉及新型冠状病毒疫苗中S蛋白含量的检测方法。本公开提供了一种用于定量检测新型冠状病毒S蛋白的多肽，所述多肽包括如ASANLAATK(SEQ ID NO.:1)或ASANLAAIK(SEQ ID NO.:2)所示的氨基酸序列。本公开还提供了包括所述多肽的试剂盒，和用于定量检测新型冠状病毒S蛋白的方法。毒S蛋白的方法。


技术研发人员：孙煌 胡雅灵 王琳 戈小琴
受保护的技术使用者：北京科兴中维生物技术有限公司
技术研发日：2022.03.17
技术公布日：2023/9/22