犬腺病毒2型弱毒株及其制备的疫苗组合物和应用的制作方法

1.本发明属于生物制药领域，具体涉及犬腺病毒2型自然致弱株、其制备的疫苗组合物和应用。


背景技术：

2.犬腺病毒分为两型，其中犬腺病毒1型(cav-1)主要引起犬急性败血性肝炎和熊、狐脑炎；其致病力强，感染宿主范围广；犬腺病毒2型(cav-2)主要引起犬科动物传染性喉气管炎和幼犬肺炎等，对养犬及毛皮经济动物养殖业带来极大的危害。
3.现有技术中cav-1弱毒疫苗会引起眼部、肾脏病变，造成短暂的“蓝眼”，因此目前世界上均采用cav-2弱毒疫苗。然而，目前在国内一些比格犬养殖场出现咳嗽等症状，结果检测到cav-2感染阳性，但是犬场均按照正规免疫程序进行接种，说明目前市场上的疫苗不能抵抗cav-2野毒的感染。
4.因此，亟需提供一种针对现有流行犬腺病毒的疫苗，其能预防犬腺病毒感染引起的疾病，同时在临床应用上，如针对不同地域的感染犬均能具有预防效果，极具现实意义。


技术实现要素：

5.本发明涉及一种具有良好免疫原性的犬腺病毒2型自然致弱株，犬腺病毒2型hl50株，其保藏号为cctcc no:v202215，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉
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武汉大学，保藏日期为2022年3月1日。
6.本发明还涉及一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包含免疫量的犬腺病毒2型hl50株或其培养物的活的全病毒抗原，以及药学上可接受的载体。其具有良好的免疫原性，能预防和治疗犬腺病毒2型野毒株的感染。
7.本发明还涉及一种疫苗组合物，其具有良好的免疫原性，能预防和治疗犬腺病毒1型野毒株的感染。
8.本发明还涉及一种疫苗组合物，其具有良好的免疫原性，能预防和治疗犬的犬腺病毒2型野毒株的感染。
9.本发明还涉及一种疫苗组合物，其具有良好的免疫原性，能预防和治疗犬的犬腺病毒1型野毒株的感染。
10.本发明还涉及一种疫苗组合物，其具有良好的免疫原性，能预防狐狸的犬腺病毒1型野毒株的感染。
11.本发明还涉及一种疫苗组合物，能预防和治疗不同地域来源的犬腺病毒1型野毒株对犬的感染。
12.本发明还涉及一种疫苗组合物，能预防和治疗不同地域来源的犬腺病毒2型野毒株对犬的感染。
13.本发明还涉及一种疫苗组合物，可阻断犬腺病毒1型和/或犬腺病毒2型的连续感染。
14.本发明还涉及所述疫苗组合物在制备预防和/或治疗犬腺病毒1型和/或犬腺病毒2型感染的药物中的应用。
具体实施方式
15.以下，对本发明的实施方式进行说明。
16.定义
17.术语“免疫有效量”是指在组合物施用的宿主中发挥它们的免疫学作用而不导致过度副作用所必需的量。所用的成分和待施用的组合物的精确的量将根据因素如治疗的疾病的类型，待治疗的动物的类型和年龄，施用的方式，以及组合物中的其它成分而变化。
18.术语“药学上可接受的载体”是指不刺激机体不阻碍使用化合物的生物学活性和特性的载体或者稀释剂。
19.本文所用的术语“预防”指通过给予根据本发明的疫苗组合物抑制犬腺病毒和/或犬瘟热病毒和/或犬细小病毒感染或推迟疾病发作，减少感染后排毒的所有行为。术语“治疗”指通过给予根据本发明的疫苗组合物使犬腺病毒和/或犬瘟热病毒和/或犬细小病毒感染引起的症状减轻或转好的所有行为。
20.发明详述
21.为解决现有技术的不足，本发明提供了一种犬腺病毒2型疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包含免疫量的犬腺病毒2型hl50株抗原和冻干保护剂；所述犬腺病毒2型hl50株抗原为犬腺病毒2型hl50株或其培养物的活的全病毒抗原，所述犬腺病毒2型hl50株(canine adenovirus 2，strain hl50)保藏号为cctcc no:v202215，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉
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武汉大学，保藏时间为2022年3月1日。
22.本发明的犬腺病毒2型弱毒株具有稳定的生物学特性，且具有良好的免疫原性，安全可靠，制备的弱毒活疫苗能够产生较高水平的抗体，能够对犬腺病毒1型、犬腺病毒2型强毒攻击具有良好的保护效果。
23.本发明的疫苗组合物能对现有流行株进行保护，不仅具有预防效果，还能治疗感染的犬只，更可阻断犬腺病毒1型、犬腺病毒2型的持续感染。
24.本发明的疫苗组合物免疫不同地区发病犬后，均可阻断病毒感染(出现临床症状)，能为犬提供100％保护，说明本发明的犬腺病毒2型hl50株弱毒活疫苗在临床能治疗感染了犬腺病毒1型、犬腺病毒2型的犬，具有很好的保护力，针对不同地域犬腺病毒1型、犬腺病毒2型感染显示出很好的免疫保护和安全性。
25.本发明的疫苗组合物免疫发病犬后，对经反复感染的犬只仍能阻断病毒感染(出现临床症状)，因此具有现实的临床治疗意义。
26.本发明的组合物的成分或组分的量优选地是免疫有效量。所述免疫有效量是指在组合物施用的宿主中发挥它们的免疫学作用而不导致过度副作用所必需量。所用的成分和待施用的组合物的精确的量将根据因素如治疗的疾病的类型，待治疗的动物的类型和年龄，施用的方式，以及组合物中的其它成分而变化。
27.作为本发明的一种实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述犬腺病毒2型hl50株抗原含量为≥10
3.0
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28.作为本发明的一种优选实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述犬腺病毒2型hl50
株抗原含量为10
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～10
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29.犬腺病毒2型hl50株抗原含量可以选自10
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30.作为本发明的一种更优选实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述犬腺病毒2型hl50株抗原含量为10
4.0
～10
5.0
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31.作为本发明的一种实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述犬腺病毒2型hl50株培养物为1～70代次的培养物。
32.犬腺病毒2型hl50株培养物可以选自1代次、2代次、3代次、4代次、5代次、6代次、7代次、8代次、9代次、10代次、11代次、12代次、13代次、14代次、15代次、16代次、17代次、18代次、19代次、20代次、21代次、22代次、23代次、24代次、25代次、26代次、27代次、28代次、29代次、30代次、35代次、40代次、45代次、50代次、55代次、60代次、65代次、70代次的培养物。
33.作为本发明的一种实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述冻干保护剂包括spga、糖类、蛋白质、含有蛋白质的物质或/和缓冲液；优选地，糖类选自山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖、葡聚糖，蛋白质选自白蛋白或者酪蛋白，所述含有蛋白质的物质为牛血清或者脱脂乳，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液；更优选地，所述冻干保护剂为40w/v％蔗糖和8w/v％明胶的水溶液，所述冻干保护剂与抗原的比例为体积比1:1。
34.作为本发明的一种实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述疫苗组合物还包括免疫量的犬瘟热病毒lt90株抗原，所述犬瘟热病毒lt90株抗原为所述犬瘟热病毒lt90株或其培养物的活的全病毒抗原，所述犬瘟热病毒lt90株保藏号为cctcc no：v202030。犬瘟热病毒lt90株(canine distemper virus,strain lt90)保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctcc no：v202030，保藏地址为中国武汉
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武汉大学，保藏日期为2020年5月13日，公开于专利申请cn113827716a中。
35.本发明的疫苗组合物中，犬瘟热病毒lt90株为亚洲-1型，能对国内主要流行野毒株进行完全保护，保护率100％(5/5)。
36.作为本发明的一种实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述疫苗组合物还包括免疫量的犬细小病毒jm35株抗原，所述犬细小病毒jm35株抗原为所述犬细小病毒jm35株或其培养物的活的全病毒抗原，所述犬细小病毒jm35株保藏号为cctcc no：v201965。犬细小病毒jm35株(canine parvovirus,strain jm35)保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctcc no：v201965，保藏地址为中国武汉
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武汉大学，保藏日期为2019年10月22日，公开于专利申请cn113073083a中。
37.本发明的疫苗组合物中，犬细小病毒jm35株为new cpv-2a型，能对国内主要流行野毒株进行完全保护，保护率100％(5/5)。
38.本发明的三联疫苗组合物能对犬腺病毒1型国内主要流行野毒株、犬腺病毒2型国内主要流行野毒株、犬瘟热病毒国内主要流行野毒株、犬细小病毒国内主要流行野毒株进
行完全保护，且针对现有流行株显示出比现有商品化疫苗更好的免疫保护和安全性。
39.作为本发明的一种实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述犬瘟热病毒lt90株抗原含量为≥10
2.5
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40.作为本发明的一种优选实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述犬瘟热病毒lt90株抗原含量为10
2.5
～10
5.5
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41.犬瘟热病毒lt90株抗原含量可以选自10
2.5
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42.作为本发明的一种更优选实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述犬瘟热病毒lt90株抗原含量为10
3.5
～10
4.5
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43.作为本发明的一种实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述犬瘟热病毒lt90株培养物为1～100代次的培养物。
44.犬瘟热病毒lt90株培养物可以选自1代次、2代次、3代次、4代次、5代次、6代次、7代次、8代次、9代次、10代次、11代次、12代次、13代次、14代次、15代次、16代次、17代次、18代次、19代次、20代次、21代次、22代次、23代次、24代次、25代次、26代次、27代次、28代次、29代次、30代次、35代次、40代次、45代次、50代次、55代次、60代次、65代次、70代次、75代次、80代次、85代次、90代次、95代次、100代次的培养物。
45.作为本发明的一种实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述犬细小病毒jm35株抗原含量为≥10
4.0
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46.作为本发明的一种优选实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述犬细小病毒jm35株抗原含量为10
4.0
～10
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47.犬细小病毒jm35株抗原含量为10
4.0
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48.作为本发明的一种更优选实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述犬细小病毒jm35株抗原含量为10
5.0
～10
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49.作为本发明的一种实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述犬细小病毒jm35株培养物为1～100代次的培养物。
50.犬细小病毒jm35株培养物可选自1代次、2代次、3代次、4代次、5代次、6代次、7代次、8代次、9代次、10代次、11代次、12代次、13代次、14代次、15代次、16代次、17代次、18代次、19代次、20代次、21代次、22代次、23代次、24代次、25代次、26代次、27代次、28代次、29代次、30代次、35代次、40代次、45代次、50代次、55代次、60代次、65代次、70代次、75代次、80代
次、85代次、90代次、95代次、100代次的培养物。
51.本发明还提供了一种制备所述的疫苗组合物的方法，其中，所述方法包括：步骤(1)扩增所述犬腺病毒2型hl50株或其培养物；以及步骤(2)在所述步骤(1)扩增的犬腺病毒2型hl50株或其培养物中添加冻干保护剂，混匀。
52.本发明还提供了一种制备所述的疫苗组合物的方法，其中，所述方法包括：步骤(1)分别扩增所述犬腺病毒2型hl50株或其培养物、所述犬瘟热病毒lt90株或其培养物、所述犬细小病毒jm35株或其培养物；以及步骤(2)将所述步骤(1)所述扩增的犬腺病毒2型hl50株或其培养物、犬瘟热病毒lt90株或其培养物、所述扩增的细小病毒jm35株或其培养物中添加冻干保护剂，混匀。
53.本发明还提供了所述的疫苗组合物在制备预防和/或治疗犬腺病毒感染的药物中的应用。
54.本发明还提供了犬腺病毒2型弱毒株hl50株，所述犬腺病毒2型hl50株保藏号为cctcc no:v202215。犬腺病毒2型hl50株(canine adenovirus 2，strain hl50)保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉
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武汉大学，保藏日期为2022年3月1日。
55.致病性试验表明，犬腺病毒2型hl50株培养1代至70代之间，对犬致病力显著降低。犬在接种70代后观察21天，不出现临床症状，剖检组织器官无变化。因此，该病毒与亲本强毒犬腺病毒2型hl006株相比，致病力显著降低，是人工致弱的病毒株。
56.免疫原性试验表明，犬腺病毒2型hl50株培养至第70代，仍具有良好的免疫原性。犬在单剂量重复接种后14日，可抵御强毒腺病毒2型hl006株的攻击。同时，未接种腺病毒2型hl50株培养物的犬，则不能抵御犬腺病毒2型hl006株的攻击，全部发病。
57.毒力返强试验表明，培养1代至70代之间的病毒，接种后在犬群中连续接触传代多次，不发生返强。因此，病毒接种犬群后，不会重新演变为强毒而引发病，安全性有保证。
58.与其犬腺病毒2型亲本强毒株相比，犬腺病毒2型hl50株第1代至第70代的培养物，病毒各基因编码的氨基酸共性出现导致fiber蛋白s492r氨基酸变异；e3基因(orf2)在1091位点插入核苷酸a，引起氨基酸突变(m364n)和终止密码子后移，增加11个氨基酸(vacqinlpnfc)。
59.犬腺病毒2型hl50株不同代次培养物病毒基因编码的氨基酸出现的共性的特征性变化很有可能是其亲本强毒株毒力降低的原因，同时这些变化并未导致其免疫原性的变化。
60.本发明的犬腺病毒2型弱毒株fiber氨基酸序列发生的点突变及e3基因插入核苷酸a，较亲本强毒株毒性降低，且具有遗传稳定性。
61.还可以包含可用于本发明的可药用载体或者稀释剂的其他实例包括稳定剂，如spga、糖类(例如，山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖、葡聚糖)、蛋白质，如白蛋白或者酪蛋白、含有蛋白质的物质，如牛血清或者脱脂乳和缓冲液(例如，磷酸盐缓冲液)。
62.特别当将这种稳定剂加入疫苗时，疫苗非常适于冷冻干燥。因此，在该实施方案的更优选的形式中，活的减毒疫苗是冷冻干燥的形式。
63.任选地，可以向疫苗中加入具有佐剂活性的一种或多种化合物。根据本发明的活的减毒的犬腺病毒不一定需要这种佐剂来实现功效，但是特别对应包含根据本发明的活的减毒的犬腺病毒和来自另一致病病毒或微生物的抗原性物质的组合疫苗，将值得加入佐
剂。佐剂是免疫系统的非特异性刺激剂，它们增强宿主对疫苗的免疫应答。本领域中已知的佐剂的实例是弗氏完全和不完全佐剂、维生素e、非离子嵌段聚合物、胞壁酰二肽、iscoms(免疫刺激复合体，参考例如欧洲专利ep109942)、皂苷、矿物油、植物油，和卡波姆(carbopol)。
64.因此，在该实施方案的优选形式中，根据本发明的活的减毒疫苗包含佐剂。
65.下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
66.本发明实施例中所用到的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
67.实施例1犬腺病毒2型hl50株的获得
68.1.取生长良好的mdck细胞，用胰酶消化，接种于细胞瓶内，以含有90％～97％体积比的dmem培养液和3％～10％体积比的新生牛血清的细胞生长液(ph调整为6.8～7.2)，用于接种病毒，于33℃～37℃条件下继续培养。
69.2.将犬腺病毒2型hl006株同步接种mdck细胞悬液，用含有95％～99％体积比的dmem培养液和1％～5％体积比的新生牛血清的细胞生长液(ph调整为6.8～7.2)于33℃～37℃条件下继续培养，于36h～48h后，当细胞80％以上发生病变时，收获细胞培养病毒液。
70.3.重复上述步骤连续传代培养(50代)获得犬腺病毒2型弱毒株，将获得的犬腺病毒2型弱毒株进行测序，结果显示fiber蛋白s492r氨基酸稳定变异；e3基因(orf2)在1091位点插入核苷酸a，引起氨基酸m364n稳定突变，终止密码子后移，引起增加11个氨基酸(vacqinlpnfc)。将该犬腺病毒2型弱毒株命名为犬腺病毒2型hl50株。
71.实施例2犬腺病毒2型hl50株生物学特性研究
72.1.致病性试验
73.2～3月龄的健康易感犬腺病毒1型和犬腺病毒2型抗原抗体阴性犬15只随机分成3组，每组5只，分组和攻毒情况见表1。
74.表1致病性试验动物分组
75.组别接种用毒株接种剂量1hl50株滴鼻2ml(10
4.0
tcid
50
/ml)2hl006株滴鼻2ml(10
4.0
tcid
50
/ml)3dmem培养基滴鼻2ml
76.病毒接种后观察14日，每日早晚对犬的体温、精神、食欲、粪便、眼鼻分泌物、是否打喷嚏进行观察记录，具体结果见表2。
77.表2 hl50株对犬的致病性
[0078][0079][0080]
结果显示，犬腺病毒2型hl006株可以导致犬100％发病(5/5)，而犬腺病毒2型hl50株体温正常，无临床症状，剖检组织器官无变化。
[0081]
致病性试验表明，犬腺病毒2型hl50株与亲本强毒株hl006株相比，致病力显著降低，是致弱的病毒株。
[0082]
同时，为验证犬腺病毒2型hl50株不同代次致病力的稳定性，用第1代、10代、30代、50代、70代的犬腺病毒2型hl50株培养物，各接种一组犬腺病毒1型和犬腺病毒2型抗原抗体阴性犬(5头)，滴鼻2ml(10
4.0
tcid
50
/ml)/头，5头犬作为对照组。每日观察、记录犬的临床变化，直至接种14天。
[0083]
结果显示，第1代、10代、30代、50代、70代的犬腺病毒2型hl50株培养物，接种后观察14天，体温正常，无临床症状，剖检组织器官无变化。
[0084]
不同代次致病性试验表明，犬腺病毒2型hl50株不同代次培养物致病力显著降低，
是致弱的病毒株。
[0085]
2.免疫原性试验
[0086]
2.1对犬腺病毒2型hl006株的保护效果
[0087]
2～3月龄的健康易感抗原抗体阴性犬10只随机分成2组，每组5只，分组和免疫情况见表3。
[0088]
表3免疫原性试验动物分组
[0089]
组别接种用毒株接种剂量4hl50株皮下1ml(10
5.0
tcid
50
/ml)5dmem培养基皮下1ml
[0090]
在首次免疫后21天，进行二次免疫。二免后14天，对犬腺病毒2型hl50株接种的犬5只，以及对照组5只，均用犬腺病毒2型hl006株以滴鼻2ml(10
4.0
tcid
50
/ml)/头剂量攻毒，攻毒后每日早晚对对犬的体温、精神、食欲、粪便、眼鼻分泌物、是否打喷嚏等进行观察记录，具体结果见表4。
[0091]
表4 hl50株对犬的免疫原性
[0092][0093]
结果显示，犬腺病毒2型hl50株接种过的犬全部保护，而对照组犬全部发病。
[0094]
免疫原性试验表明，犬腺病毒2型hl50株具有良好的免疫原性，能对犬腺病毒2型hl006株攻击产生良好的保护作用。
[0095]
同时，为验证犬腺病毒2型hl50株不同代次免疫原性的稳定性，分别免疫第1代、10代、30代、50代、70代的犬腺病毒2型hl50株培养物，在首次免疫后21天，进行二次免疫；二免后14天，各免疫组连同对照组均用犬腺病毒2型hl006株以滴鼻2ml(10
4.0
tcid
50
/ml)/头剂量攻毒，攻毒后每日早晚对犬的体温、精神、食欲粪便、眼鼻分泌物、是否打喷嚏等进行观察记
录。
[0096]
结果显示，第1代、10代、30代、50代、70代的犬腺病毒2型hl50株培养物接种过的犬全部保护，对照组犬全部发病。
[0097]
不同代次免疫原性试验表明，犬腺病毒2型hl50株不同代次培养物均具有良好的免疫原性，能对犬腺病毒2型hl006株攻击产生良好的保护作用。
[0098]
3.病毒返强安全性试验
[0099]
将犬腺病毒2型hl50株第1代病毒液(10
6.5
tcid
50
/ml)通过滴鼻2ml接种3只健康易感犬。接种后每日早晚测温和观察临床表现，接种后第5日剖杀，观察病变，并对肺脏采样进行组织病学he染色和免疫组化检测，对肺脏研磨液进行犬腺病毒核酸测定，挑选病毒含量高的犬肺脏适当处理后作为下一代毒力返强用接种物，如此在犬体内传至第4代。
[0100]
取第4代毒力返强试验获得肺脏研磨液过滤后再经滴鼻2ml接种3只健康易感犬。接种后每日早晚测温和观察临床表现，接种后第21日剖杀，观察病变，并对肺脏、肠、肠系膜淋巴结和脑采样进行he和免疫组化检测，对肺脏研磨液进行病毒核酸测定。
[0101]
如在第1～4代毒力返强继代试验中，如果出现某代试验中，肺脏组织检测不到犬腺病毒核酸，则应适当加大接种量，同样方式接种6只犬，以提高病毒核酸检出率，如果进一步试验确证继代后不能重新在肺脏检测到犬腺病毒2型核酸，表明该毒力返强试验结果可判成立，该毒株没有毒力返强可能。
[0102]
结果显示，第1代～第5代病毒液接种犬后体温和临床表现均未见异常，剖杀后各脏器未见明显病变，he染色仅第1代肺脏可见肺泡隔轻微增厚，肺脏免疫组化检测可见cav-2抗原阳性，第2代～第5代毒力返强试验肺脏he染色均未见异常，免疫组化均为阴性，且肺脏中病毒载量随着代次升高在逐步降低。毒力返强试验时同居饲养的试验犬，临床观察也未见异常，同居饲养21日后血清cav抗体转阳，拭子中可检测到cav-2病毒核酸，可见犬腺病毒2型hl50株没有毒力返强能力，但存在一定的水平传播能力，是一株安全性、免疫原性良好的弱毒株。
[0103]
分别将犬腺病毒2型hl50株第10代、30代、50代、70代病毒液参照上述病毒返强试验步骤进行验证，结果显示：上述每个代次的第1代～第5代病毒液接种犬后体温和临床表现均未见异常，剖杀后各脏器未见明显病变，he染色仅第1代肺脏出现轻微病理变化，肺脏免疫组化检测可见cav-2抗原阳性，第2代～第5代毒力返强试验肺脏he染色均未见异常，免疫组化均为阴性，且肺脏中病毒载量随着代次升高在逐步降低。
[0104]
因此，犬腺病毒2型hl50株不会重新演变为强毒而引起发病，安全性有保证。
[0105]
4.基因序列分析
[0106]
将犬腺病毒2型hl50株第1代至第70代的培养物，用pcr方法，进行基因组扩增(不同代次培养物分别扩增)。将获得的基因扩增产物回收、纯化，连接到测序质粒载体中，测定病毒基因的核苷酸序列，并用计算机软件转化成病毒的氨基酸序列。用序列分析软件，将获得氨基酸序列与亲本强毒株hl006株氨基酸序列进行比较，描述病毒氨基酸序列特征。
[0107]
结果显示，犬腺病毒2型hl50株第1代至第70代的培养物，病毒各基因编码的氨基酸共性出现导致fiber蛋白s492r氨基酸变异；e3基因(orf2)在1091位点插入核苷酸a，引起氨基酸m364n突变和终止密码子后移，增加11个氨基酸(vacqinlpnfc)。
[0108]
表明，犬腺病毒2型hl50株不同代次培养物病毒基因编码的氨基酸出现的共性的
特征性变化有可能是其亲本强毒株毒力降低的原因。
[0109]
实施例3犬腺病毒2型hl50株弱毒活疫苗的制备
[0110]
1.病毒的增殖
[0111]
将实施例1制备的犬腺病毒2型hl50株毒种同步接种mdck细胞悬液，加入含1％新生牛血清的dmem培养液，置37℃、5％co2培养。待80％细胞病变后，收获病毒，测定病毒滴度，置低温保存。
[0112]
2.保护剂的配制
[0113]
每100ml去离子水中加蔗糖40g，明胶8g，充分融化后，置高压蒸气灭菌(121℃30min)。
[0114]
3.疫苗的制备
[0115]
将上述制备并保存的病毒液与保护剂按1:1(体积比)混合，冻干。疫苗含量具体配比见表5。
[0116]
表5犬腺病毒2型hl50株弱毒活疫苗含量配比
[0117]
组分疫苗1疫苗2疫苗3hl50株抗原(tcid
50
)/头份10
3.0
10
4.0
10
6.0
保护剂(v/v)50％50％50％
[0118]
实施例4犬腺病毒2型hl50株弱毒活疫苗的免疫原性试验
[0119]
28日龄以上的犬腺病毒抗原抗体阴性犬20只随机分成4组，每组5只，免疫实施例3制备的犬腺病毒2型hl50株弱毒活疫苗。第6组免疫疫苗1，第7组免疫疫苗2，第8组免疫疫苗3，第9组免疫pbs作为对照组。皮下注射，两次免疫，间隔21日，二免14日后攻毒，均用犬腺病毒2型hl006株以滴鼻2ml(10
4.0
tcid
50
/ml)/头剂量攻毒，攻毒后每日早晚对犬的体温、精神、食欲、腹部和眼部等进行观察记录，具体结果见表6。
[0120]
表6犬腺病毒2型hl50株弱毒活疫苗的免疫原性试验结果
[0121][0122]
结果显示，采用实施例3制备的犬腺病毒2型hl50株弱毒活疫苗免疫犬后，可阻断病毒感染(出现临床症状)，能为犬提供100％(5/5)保护，而对照组犬攻毒后全部发病。
[0123]
证明了三个试验组犬腺病毒2型hl50株弱毒活疫苗具有很好的保护力，显示出很好的免疫保护和安全性。
[0124]
实施例5犬腺病毒2型hl50株弱毒活疫苗的广谱性试验
[0125]
28日龄以上的犬腺病毒抗原抗体阴性犬20只随机分成4组，每组5只，免疫实施例3
制备的犬腺病毒2型hl50株弱毒活疫苗。第10组免疫疫苗1，第11组免疫疫苗2，第12组免疫疫苗3，第13组免疫pbs作为对照组。皮下注射，两次免疫，间隔21日，二免14日后攻毒，均用犬腺病毒1型yt-2株以静脉1ml(10
4.0
tcid
50
/ml)/头剂量攻毒，攻毒后每日早晚对犬的体温、精神、食欲、腹部和眼部等进行观察记录，具体结果见表7。犬腺病毒1型yt-2株(canine adenovirus 1，strain yt-2)的保藏编号为：cctcc no:v202216，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉
·
武汉大学，保藏日期为2022年3月1日。
[0126]
表7犬腺病毒2型hl50株弱毒活疫苗的广谱性试验结果
[0127][0128]
结果显示，采用实施例3制备的犬腺病毒2型hl50株弱毒活疫苗免疫犬后，可阻断犬腺病毒1型感染(出现临床症状)，能为犬提供100％(5/5)保护，而对照组犬攻毒后全部发病。
[0129]
证明了三个试验组犬腺病毒2型hl50株弱毒活疫苗具有很好的广谱性。
[0130]
实施例6犬腺病毒2型hl50株弱毒活疫苗对狐狸的试验
[0131]
28日龄以上的犬腺病毒抗原抗体阴性狐狸20只随机分成4组，每组5只，免疫实施例3制备的犬腺病毒2型hl50株弱毒活疫苗。第14组免疫疫苗1，第15组免疫疫苗2，第16组免疫疫苗3，第17组免疫pbs作为对照组。皮下注射，两次免疫，间隔21日，二免14日后攻毒，均用犬腺病毒1型yt-2株以静脉1ml(10
4.0
tcid
50
/ml)/头剂量攻毒，攻毒后每日早晚对狐狸的体温、精神、食欲、腹部和眼部等进行观察记录，具体结果见表8。
[0132]
表8犬腺病毒2型hl50株弱毒活疫苗对狐狸的试验结果
[0133][0134]
结果显示，采用实施例3制备的犬腺病毒2型hl50株弱毒活疫苗免疫狐狸后，可阻断病毒感染(出现临床症状)，能为狐狸提供100％(5/5)保护，而对照组狐狸攻毒后全部发病。
[0135]
证明了三个试验组犬腺病毒2型hl50株弱毒活疫苗具有很好的保护力，显示出很好的免疫保护和安全性。
[0136]
实施例7犬腺病毒2型hl50株弱毒活疫苗免疫原性对比试验
[0137]
将45日龄犬腺病毒抗原抗体阴性犬15只随机分成3组，5只/组。第18组单剂量重复免疫实施例3制备的犬腺病毒2型hl50株弱毒活疫苗疫苗1；第19组单剂量重复免疫商品化犬瘟热、细小病毒、传染性肝炎、副流感四联活疫苗(manhattan lpv3)；第20组免疫pbs作为对照组。间隔21日，两次免疫，二免14日后攻毒，均用犬腺病毒1型yt-2株以静脉1ml(10
4.0
tcid
50
/ml)/头剂量攻毒，攻毒后每日早晚对犬的体温、精神、食欲、腹部和眼部等进行观察记录，具体结果见表9。
[0138]
表9犬腺病毒2型hl50株弱毒活疫苗免疫原性对比试验结果
[0139][0140]
结果显示，采用实施例3制备的犬腺病毒2型hl50株弱毒活疫苗免疫犬后，可阻断病毒感染(不出现临床症状)，能为犬提供100％(5/5)保护；对照组犬攻毒后全部发病；而现有商品化的疫苗不能对犬完全保护。
[0141]
证明了犬腺病毒2型hl50株弱毒活疫苗具有很好的保护力，针对现有流行株显示出比现有商品化疫苗更好的免疫保护和安全性。
[0142]
实施例8犬腺病毒2型hl50株弱毒活疫苗临床试验
[0143]
分别从天津、河北、河南、湖北四地的部分宠物医院或犬场的犬采集眼鼻肛拭子进行pcr检测，并对犬腺病毒1型或犬腺病毒2型阳性犬免疫实施例3制备疫苗1，每日早晚对犬的体温、精神、食欲、腹部和眼部进行观察记录，具体结果见表10。
[0144]
表10犬腺病毒2型hl50株弱毒活疫苗临床试验结果
[0145]
[0146][0147]
结果显示，采用实施例3制备的犬腺病毒2型hl50株弱毒活疫苗免疫不同地区发病犬后，均可阻断病毒感染(出现临床症状)，能为犬提供100％保护，说明本发明的犬腺病毒2型hl50株弱毒活疫苗在临床能治疗感染了犬腺病毒1型或犬腺病毒2型的犬。
[0148]
证明了本发明犬腺病毒2型hl50株弱毒活疫苗具有很好的保护力，针对不同地域犬腺病毒1型或犬腺病毒2型感染显示出很好的免疫保护和安全性。
[0149]
进一步将上述天津、河北、河南、湖北犬场免疫前感染犬腺病毒的犬在逐步恢复正常后每组随机选取5只；另再选取犬腺病毒抗原抗体阴性犬10只作为对照，随机分两组，每组5只。其中21-1组，22-1组和对照25组均用犬腺病毒1型yt-2株以静脉1ml(10
4.0
tcid
50
/ml)/头剂量攻毒，攻毒后每日早晚对犬的体温、精神、食欲、腹部和眼部等进行观察记录；23-1组，24-1组和对照26组均用犬腺病毒2型hl006株以滴鼻2ml(10
4.0
tcid
50
/ml)/头剂量攻毒，攻毒后每日早晚对犬的体温、精神、食欲粪便、眼鼻分泌物、是否打喷嚏等进行观察记录，具体结果见表11。
[0150]
表11犬腺病毒2型hl50株弱毒活疫苗的临床试验攻毒结果
[0151][0152]
结果显示，各免疫过实施例3制备的犬腺病毒2型hl50株弱毒活疫苗的犬，在攻毒后均未出现临床症状，能为犬提供100％(5/5)保护；对照组犬攻毒后全部发病。这说明本发明的犬腺病毒2型hl50株弱毒活疫苗免疫后能对反复感染的犬只具有延长保护作用，保护率为100％。
[0153]
进一步证明了本发明犬腺病毒2型hl50株弱毒活疫苗具有很好的保护力，可阻断犬腺病毒1型或犬腺病毒2型的连续感染。
[0154]
实施例9犬瘟热、细小病毒病、传染性肝炎三联活疫苗的制备
[0155]
1.病毒的增殖
[0156]
将犬瘟热病毒lt90株毒种同步接种vero细胞悬液，加入含95％～99％体积比的
dmem培养液和1％～5％体积比的新生牛血清的细胞生长液(ph调整为6.8～7.2)于33℃～37℃条件下继续培养，于72h～96h后，当细胞80％以上发生病变时，冻融收毒，并进行病毒含量测定，置低温保存。
[0157]
将犬细小病毒jm35株毒种同步接入f81细胞悬液，加入含有90％～98％体积比的rpmi 1640培养液和2％～10％体积比的新生牛血清的细胞生长液(ph调整为6.8～7.2)于33℃～37℃条件下培养。待细胞病变达到80％左右时冻融收毒，并进行病毒含量测定，置低温保存。
[0158]
2.保护剂的配制
[0159]
每100ml去离子水中加蔗糖40g，明胶8g，充分融化后，置高压蒸气灭菌(121℃，30min)。
[0160]
3.疫苗的制备
[0161]
将上述制备并保存的犬瘟热病毒lt90株病毒液、犬细小病毒jm35株病毒液、实施例3制备并保存的犬腺病毒2型hl50株病毒液按比例混合，并与保护剂按1:1(体积比)混合，冻干。疫苗含量具体配比见表12。
[0162]
表12犬瘟热、细小病毒病、传染性肝炎三联活疫苗含量配比
[0163][0164][0165]
实施例10犬瘟热、细小病毒病、传染性肝炎三联活疫苗的免疫原性试验
[0166]
28日龄以上的犬瘟热、犬细小病毒、犬腺病毒抗原抗体阴性犬60只随机分成12组，每组5只，免疫实施例9制备的犬瘟热、细小病毒病、传染性肝炎三联活疫苗。第27、28组单剂量免疫疫苗4，第29、30组单剂量免疫疫苗5，第31、32组单剂量重复免疫疫苗4，第33、34组单剂量重复免疫疫苗5，间隔21日。第35～38组免疫pbs作为对照组。
[0167]
第27组、第29组和第35组免疫21日后攻毒，均用犬瘟热病毒c/hn/001株以滴鼻2ml、腹腔4ml(10
5.5
faid
50
/ml)/只剂量攻毒，攻毒后每日早晚对犬的体温、精神、食欲、粪便、眼鼻分泌物进行观察记录，具体结果见表13。
[0168]
表13犬三联活疫苗的犬瘟热抗原部分免疫原性试验结果
[0169][0170]
结果显示，采用实施例9制备的犬瘟热、细小病毒病、传染性肝炎三联活疫苗免疫犬后，可阻断犬瘟热病毒感染(出现临床症状)，能为犬提供100％(5/5)保护(预防)，而对照组犬攻毒后全部发病。
[0171]
第28组、第30组和第36组免疫14日后攻毒，均用犬细小病毒s0425株以皮下注射4ml(10
6.5
faid
50
/ml)/只剂量攻毒，攻毒后每日对犬的精神、食欲、粪便等临床表现进行观察记录。具体结果见表14。
[0172]
表14犬三联活疫苗的犬细小抗原部分免疫原性试验结果
[0173][0174]
结果显示，采用实施例9制备的犬瘟热、细小病毒病、传染性肝炎三联活疫苗免疫犬后，可阻断犬细小病毒感染(出现临床症状)，能为犬提供100％(5/5)保护(预防)，而对照组犬攻毒后全部发病。
[0175]
第31组、第33组和第37组二免14日后攻毒，均用犬腺病毒1型yt-2株以静脉注射1ml(10
4.0
tcid
50
/ml)/只剂量攻毒，攻毒后每日对犬的体温、精神、食欲、腹部和眼部等临床表现进行观察记录；第32组、第34组和第38组二免14日后攻毒，均用犬腺病毒2型hl006株以滴鼻2ml(10
4.0
tcid
50
/ml)/只剂量攻毒；攻毒后每日早晚对犬的体温、精神、食欲粪便、眼鼻分泌物、是否打喷嚏等进行观察记录。具体结果见表15。
[0176]
表15犬三联活疫苗的犬腺病毒抗原部分免疫原性试验结果
[0177][0178][0179]
结果显示，采用实施例9制备的犬瘟热、细小病毒病、传染性肝炎三联活疫苗免疫犬后，可阻断犬腺病毒1型、犬腺病毒2型感染(出现临床症状)，能为犬提供100％(5/5)保护(预防)，而对照组犬攻毒后全部发病。
[0180]
证明了本发明提供的犬瘟热、细小病毒病、传染性肝炎三联活疫苗具有很好的保护力，显示出很好的免疫保护和安全性，有效预防犬瘟热、犬细小病毒病和犬传染性肝炎的发生。
[0181]
以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

技术特征：
1.犬腺病毒2型hl50株，其保藏号为cctcc no:v202215，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉
·
武汉大学，保藏日期为2022年3月1日。2.一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包含免疫量的犬腺病毒2型hl50株或其培养物的活的全病毒抗原，以及药学上可接受的载体。3.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中，所述犬腺病毒2型hl50株其培养物为1～70代次的培养物。4.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中，所述犬腺病毒2型hl50株或其培养物的活的全病毒抗原含量为≥10
3.0
tcid
50
/头份；优选地，所述犬腺病毒2型hl50株或其培养物的活的全病毒抗原含量为10
3.0
～10
6.0
tcid
50
/头份；更优选地，所述所述犬腺病毒2型hl50株或其培养物的活的全病毒抗原含量为10
4.0
～10
5.0
tcid
50
/头份。5.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中，所述药学上可接受的载体为冻干保护剂，所述冻干保护剂选自spga、糖类、蛋白质、含有蛋白质的物质和缓冲液；所述糖类包括山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖、葡聚糖，所述蛋白质为白蛋白或者酪蛋白，所述含有蛋白质的物质为牛血清或者脱脂乳，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液；优选地，所述冻干保护剂为含有40％w/v蔗糖和8％w/v明胶的水溶液。6.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中，所述犬腺病毒2型hl50株或其培养物，与所述药学上可接受的载体之间的体积比为1:1。7.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物还包括免疫量的犬瘟热病毒lt90株或其培养物的活的全病毒抗原，和/或所述免疫量的犬细小病毒jm35株或其培养物活的全病毒抗原；所述犬瘟热病毒lt90株保藏号为cctcc no.v202030，所述犬细小病毒jm35株保藏号为cctcc no.v201965。8.根据权利要求7所述的疫苗组合物，其中，所述犬瘟热病毒lt90株其培养物为1～100代次的培养物，所述犬细小病毒jm35株其培养物为1～100代次的培养物；所述犬瘟热病毒lt90株或其培养物的活的全病毒抗原含量为≥10
2.5
faid50/头份；优选地，所述犬瘟热病毒lt90株或其培养物的活的全病毒抗原含量为10
2.5
～10
5.5
faid
50
/头份；更优选地，所述犬瘟热病毒lt90株或其培养物的活的全病毒抗原含量为10
3.5
～10
4.5
faid
50
/头份；所述犬细小病毒jm35株或其培养物活的全病毒抗原含量为≥10
4.0
faid50/头份；优选地，所述犬细小病毒jm35株或其培养物活的全病毒抗原含量为10
4.0
～10
6.5
faid
50
/头份；更优选地，所述犬细小病毒jm35株或其培养物活的全病毒抗原含量为10
5.0
～10
6.0
faid
50
/头份。9.根据权利要求2～8任一项所述的疫苗组合物在制备预防和/或治疗犬腺病毒1型和/或犬腺病毒2型感染的药物中的应用。10.根据权利要求9所述的应用，其中，所述的应用是在制备预防和/或治疗犬、狐狸犬腺病毒1型和/或犬腺病毒2型感染的药物中的应用。

技术总结
本发明提供了犬腺病毒2型HL50株疫苗株，其具有良好的免疫原性。本发明还提供了一种疫苗组合物，包含免疫量的犬腺病毒2型HL50株或其培养物的活的全病毒抗原，以及药学上可接受的载体。该疫苗组合物能预防和治疗犬腺病毒1型、犬腺病毒2型的感染；还能针对狐狸的感染具有预防作用，并对不同地域来源的野毒株的感染具有预防和治疗作用，且能可阻断犬腺病毒1型和/或犬腺病毒2型的连续感染。和/或犬腺病毒2型的连续感染。


技术研发人员：田克恭 刘彩红 刘玉秀 张许科
受保护的技术使用者：洛阳惠中生物技术有限公司
技术研发日：2022.03.18
技术公布日：2023/9/22