一种用于治疗慢性脑缺血的黄芪甲苷、绿原酸和灯盏乙素联合用药物

1.本发明属于化学医药领域，具体涉及一种用于治疗慢性脑缺血的黄芪甲苷、绿原酸和灯盏乙素联合用药物。


背景技术：

2.慢性脑缺血(慢脑缺血)是指大脑整体水平的血液供应减少的状态，是中老年的常见病，多发病，也是缺血性卒中发生和发展的重要环节。据统计80岁以上的老年人中有超过半数的人有不同程度慢性脑供血不足的症状，60岁以上的人群中2/3有慢性脑供血不足的病史。
3.中医临床在益气活血法治疗原则的指导下，将黄芪注射液和灯盏细辛注射液联合用以治疗脑缺血疾病，效果较好，且联用效果优于任一制剂单用或者常规西医治疗(基线等比增减设计法优选黄芪注射液联合灯盏细辛注射液抗大鼠脑缺血再灌注损伤的最佳配比，《中国药房》2019年第14期)。
4.黄芪注射液是以黄芪为主要原料制成的灭菌水溶液，灯盏细辛经提取酚酸类成分制成的灭菌水溶液，这两种注射液所含有的化学成分组成复杂。这使得其联合治疗脑缺血疾病的物质基础并不清楚。因此，虽然目前能够将黄芪注射液与灯盏细辛注射液联合使用治疗脑缺血，但是在明确物质基础后，直接以活性物质进行联合用药有望进一步提高其疗效。
5.慢脑缺血疾病的诱因、成因复杂，所以临床上需要更加多样化的有效治疗方法。此外，人们仍然希望继续提高药物对慢脑缺血疾病的治疗效果。因此，有必要继续开发新的治疗慢脑缺血的药物，为临床治疗提供更多新的选择。


技术实现要素：

6.针对现有技术中的缺陷，本发明提供一种用于治疗慢性脑缺血的黄芪甲苷、绿原酸和灯盏乙素联合用药物，目的在于提供新的能够用于预防或治疗慢性脑缺血的药物组合物及联合用药方法，为临床治疗提供新的选择。
7.黄芪甲苷、绿原酸和灯盏乙素联合使用，或黄芪甲苷、绿原酸、灯盏乙素和毛蕊异黄酮联合使用在制备预防和/或治疗慢脑缺血的药物中的用途。
8.优选的，所述黄芪甲苷、绿原酸和灯盏乙素的用量比例为摩尔比2.5-10：25-100：25-70；
9.或，所述黄芪甲苷、绿原酸、灯盏乙素和毛蕊异黄酮的用量比例为摩尔比2.5-10：25-100：25-70：3.95-31.6。
10.优选的，所述黄芪甲苷、绿原酸和灯盏乙素的用量比例为摩尔比10：75：40；
11.或，所述黄芪甲苷、绿原酸、灯盏乙素和毛蕊异黄酮的用量比例为摩尔比10：75：40：15.8。
12.本发明还提供一种用于预防和/或治疗慢脑缺血的药物组合物，它是以包括黄芪甲苷、绿原酸和灯盏乙素或其药学上可接受的盐的原料组合物为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制成的。
13.优选的，所述黄芪甲苷、绿原酸和灯盏乙素的用量比例为摩尔比2.5-10：25-100：25-70。
14.优选的，所述黄芪甲苷、绿原酸和灯盏乙素的用量比例为摩尔比10：75：40。
15.优选的，所述药物组合物的剂型为固体制剂或液体制剂，所述固体制剂为丸剂、散剂、片剂或颗粒剂，所述液体制剂为口服液。
16.优选的，所述药物组合物的剂型为液体制剂，所述黄芪甲苷的浓度为2.5-10umol/l，所述绿原酸的浓度为25-100umol/l，所述灯盏乙素的浓度为25-70umol/l。
17.优选的，所述黄芪甲苷的浓度为10umol/l，所述绿原酸的浓度为75umol/l，所述灯盏乙素的浓度为40umol/l。
18.优选的，所述原料组合物中还包括毛蕊异黄酮，所述黄芪甲苷、绿原酸、灯盏乙素和毛蕊异黄酮的用量比例为摩尔比2.5-10：25-100：25-70：3.95-31.6。
19.本发明中，术语“药学上可接受的”是指某载体、运载物、稀释剂、辅料，和/或所形成的盐通常在化学上或物理上与构成某药物剂型的其它成分相兼容，并在生理上与受体相兼容。
20.本发明提供了一种新的联合用药物及其药物组合物，本发明的联合用药物能够有效提高氯化钴损伤pc12细胞的存活率，且在动物实验中能够改善慢性脑缺血小鼠两侧脑血流。因此，本发明的联合用药物能够用于制备治疗慢性脑缺血的药物，产生很好的治疗效果，为临床治疗慢性脑缺血提供了新的选择。
21.显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
22.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
23.图1为实验例3的脑血流图。
具体实施方式
24.本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
25.实施例1治疗慢脑缺血的口服液
26.本实施例提供一种以黄芪甲苷、绿原酸和灯盏乙素为活性成分的口服液，其浓度为：黄芪甲苷10umol/l，绿原酸75umol/l，灯盏乙素40umol/l。
27.实施例2治疗慢脑缺血的口服液
28.本实施例提供一种以黄芪甲苷、绿原酸和灯盏乙素为活性成分的口服液，其浓度为：黄芪甲苷2.5umol/l，绿原酸25umol/l，灯盏乙素25umol/l。
29.实施例3治疗慢脑缺血的口服液
30.本实施例提供一种以黄芪甲苷、绿原酸和灯盏乙素为活性成分的口服液，其浓度为：黄芪甲苷5umol/l，绿原酸100umol/l，灯盏乙素70umol/l。
31.实施例4治疗慢脑缺血的散剂
32.本实施例提供一种以黄芪甲苷、绿原酸和灯盏乙素为活性成分的散剂，其包括：黄芪甲苷2.5g，绿原酸25g，灯盏乙素25g。
33.实施例5治疗慢脑缺血的颗粒剂
34.本实施例提供一种以黄芪甲苷、绿原酸和灯盏乙素为活性成分的颗粒剂，其包括：黄芪甲苷5g，绿原酸100g，灯盏乙素70g。
35.实施例6治疗慢脑缺血的口服液
36.本实施例提供一种以黄芪甲苷、绿原酸、灯盏乙素和毛蕊异黄酮为活性成分的口服液，其浓度为：黄芪甲苷10umol/l，绿原酸75umol/l，灯盏乙素40umol/l，毛蕊异黄酮15.8umol/l。
37.实施例7治疗慢脑缺血的口服液
38.本实施例提供一种以黄芪甲苷、绿原酸、灯盏乙素和毛蕊异黄酮为活性成分的口服液，其浓度为：黄芪甲苷2.5umol/l，绿原酸25umol/l，灯盏乙素25umol/l，毛蕊异黄酮3.95umol/l。
39.实施例8治疗慢脑缺血的口服液
40.本实施例提供一种以黄芪甲苷、绿原酸、灯盏乙素和毛蕊异黄酮为活性成分的口服液，其浓度为：黄芪甲苷5umol/l，绿原酸100umol/l，灯盏乙素70umol/l，毛蕊异黄酮31.6umol/l。
41.实施例9治疗慢脑缺血的片剂
42.本实施例提供一种以黄芪甲苷、绿原酸、灯盏乙素和毛蕊异黄酮为活性成分的片剂，其包括：黄芪甲苷10mg，绿原酸75mg，灯盏乙素40mg，毛蕊异黄酮15.8mg。
43.下面通过实验对本发明的技术方案作进一步说明。
44.实验例1黄芪甲苷、绿原酸和灯盏乙素联合用药治疗慢脑缺血体外药效评价
45.1 材料
46.1.1 细胞株
47.大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞pc12。pc12细胞是一个常用的神经细胞株，通过研究药物对无糖培养加氯化钴损伤pc12细胞的作用，能够了解该药物对缺糖缺氧损伤神经细胞的作用，从而推断其治疗慢脑缺血的药效。
48.1.2药物与试剂
49.黄芪甲苷标准品、绿原酸标准品、灯盏乙素标准品均购自于(重庆高仁生物科技有限公司，批号84687-43-4、327-97-9、27740-01-8)，氯化钴(sigma,批号:7791-13-1)，dmem高糖培养基(hyclon)、dmem无糖培养基(bi)，胎牛血清(杭州四季青生物工程研究所)；二甲基亚砜(biofroxx)，胰酶(hyclone)，mtt(biofroxx)。
50.1.3主要仪器
51.1300系列ⅱ级生物安全柜(赛默飞世尔(上海)仪器有限公司)，低速离心机(安徽嘉文仪器装备有限公司)，普通倒置显微镜(motic)，电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)，微量震荡器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)，酶标仪(victor nivo)、流式
细胞仪(acea bioscience inc)，移液器(赛默飞世尔仪器有限公司)，二氧化碳培养箱(赛默飞世尔科技仪器有限公司)。
52.2.方法与结果
53.2.1各成分配比组合的拟定
54.确定三个有效成分黄芪甲苷、绿原酸、灯盏乙素的对氯化钴损伤pc12细胞的有效浓度范围，组合中黄芪甲苷的浓度为：2.5-10umol/l，绿原酸的浓度：25-100umol/l，灯盏乙素的浓度：25-70umol/l。将黄芪、绿原酸、灯盏乙素进行组合，各实验组组合配比见表1。
55.表1黄芪甲苷、绿原酸、灯盏乙素组合表
[0056][0057]
2.2各组合对氯化钴损伤pc12细胞活力的影响
[0058]
取对数生长期的pc12细胞，消化离心(800rpm，5min)，用完全培养基稀释成1
×
105个/ml细胞悬液，100μl/孔接种于96孔板中培养24h。将细胞分为：正常组、模型组、6个组合给药组(药物浓度如表1)。正常对照组给予120μl完全培养基，其余各组均先加入无糖dmem培养基配制的0.4mmol/l的氯化钴，100μl/孔，各给药组再加入20μl药液(药物浓度见表1)，模型组加入20ul的无糖培养基。每组各设6个复孔，于37℃、5％co2培养箱孵育24h。弃掉上清，每孔加入100μl无血清的dmem高糖培养基和20μl的mtt，避光孵育4h后，弃掉上清，每孔加入150μl dmso，震荡10min，用酶标仪检测各孔在490nm处的吸光度值，实验重复3次，计算细胞存活率。
[0059]
2.3各组合对细胞存活率影响的结果
[0060]
对细胞存活率进行统计分析，由表2可知，与模型组比较，各组合的存活率均有统计学差异(p《0.01)。其中组合1提高细胞存活率相对最多，且与拟合方程得到的最优组合最接近，确定其为最优组合。其所对应的各个单体浓度分别为黄芪甲苷10umol/l、绿原酸75umol/l、灯盏乙素40umol/l。
[0061]
表2各组合对细胞存活率的影响(x
±
s，n＝6)
[0062][0063]
注：与模型组比较，*p《0.05，**p《0.01；
[0064]
2.4联合用药效果的验证
[0065]
为了证明黄芪甲苷、绿原酸、灯盏乙素三种药物具有协同增效的效果。进一步提供黄芪甲苷、绿原酸和灯盏乙素三种药物单组份用药对细胞存活率影响的实验数据。其中，药物单组份用药的剂量与上述组合1中三种药物的总剂量相同，即单组份用药的浓度为125umol/l。其他未说明的实验步骤和条件与2.2部分相同。
[0066]
结果如表3所示，可以看到，在药物总剂量相同的情况下，组合1(最优组合)提高细胞存活率的效果优于任意一种药物单组份实验组的效果。这表明在组合1中，三种药物产生了协同增效的作用，从而具有更好的提高细胞存活率的效果。
[0067]
表3相同剂量的组合与单体成分对细胞存活率的影响(x
±
s，n＝6
[0068][0069][0070]
注：与模型组比较，*p《0.05，**p《0.01；与最优组合组比较，
#
p《0.05
[0071]
实验例2黄芪甲苷、绿原酸、灯盏乙素和毛蕊异黄酮联合用药治疗慢脑缺血体外药效评价
[0072]
本实施例按照与实施例1相同的方法进行实验，区别在于药液是在实施例1的组合1的基础上加入毛蕊异黄酮配制而成的，各实验组的药液中毛蕊异黄酮的浓度及细胞存活率结果如表4所示。
[0073]
表4毛蕊异黄酮加到最优组合药中对细胞存活率的影响(n＝6)
[0074][0075]
注：与模型组比较，*p《0.05，**p《0.01；
[0076]
结果表明毛蕊异黄酮各浓度加入到组合中，尤其浓度为15.8umol/l时提高存活率较明显。而无论进一步降低还是升高毛蕊异黄酮的浓度，都会导致细胞存活率的明显下降。因此，毛蕊异黄酮与组合1联合用药时，各组分的用量对药物组合物的治疗效果有显著的影响，最佳的用量比例为：毛蕊异黄酮15.8umol/l、黄芪甲苷10umol/l、绿原酸75umol/l、灯盏乙素40umol/l。
[0077]
实验例3黄芪甲苷、绿原酸、灯盏乙素成分组合对慢性脑缺血小鼠的药效评价
[0078]
1 实验器材与方法
[0079]
1.1 实验动物
[0080]
昆明小鼠，成都达硕实验动物有限公司。
[0081]
1.2仪器设备与试剂
[0082]
[0083]
2方法
[0084]
2.1慢性脑缺血小鼠模型的复制
[0085]
采用右侧颈总动脉结扎方法建立慢性脑缺血小鼠模型，术前禁食12h，称重。采用10％水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，仰卧位固定，颈部备皮、消毒。用剪刀沿颈部中线剪开约1-2cm小切口，分离筋膜肌肉，找出左侧颈总动脉。然后用0-4号丝线结扎远心端和近心端，从中间剪断右侧颈总动脉。最后用手术线缝合颈部切口，涂碘伏消毒，假手术组仅分离颈总动脉不结扎。术后连续3天肌肉注射青霉素钠，以防感染。
[0086]
2.2分组及给药
[0087]
将小鼠随机分为5组,分别为假手术组、模型组、阳性组(脑络通)、联用高剂量组(黄芪甲苷-绿原酸-灯盏乙素联用)、联用低剂量组(黄芪甲苷-绿原酸-灯盏乙素联用)，每组10只。阳性药组97.5mg/kg，联用高剂量组(黄芪甲苷28mg/kg、绿原酸84mg/kg、灯盏乙素56mg/kg)，联用低剂量组(黄芪甲苷14mg/kg、绿原酸42mg/kg、灯盏乙素28mg/kg)，假手术组以及模型组给予等量生理盐水。药物用羧甲基纤维素钠溶解，以灌胃的方式，连续给药30天。联用组的给药剂量来源于细胞实验和参考文献：在细胞实验中，浓度比(mg/ml)黄芪甲苷：绿原酸：灯盏乙素＝1:3:2。参考文献中黄芪甲苷的大鼠剂量为20mg/kg，小鼠剂量按大鼠的1.4倍进行换算。
[0088]
2.3脑血流测量
[0089]
术后和给药30天后检测两侧脑血流，在小鼠麻醉的情况下，用剪刀沿小鼠脑中线剪开头皮，长度约2cm。用镊子分离头皮，暴露出头骨，用生理盐水保持头骨湿润，放入激光散斑仪上，测量双侧脑血流量并拍照记录，并计算两侧脑血流差异。随后用手术线缝合伤口，消毒。
[0090]
两侧脑血流差＝左侧脑血流-右侧脑血流
[0091]
右侧血流恢复率＝(术后两侧脑血流差-给药30天两侧脑血流差)/术后两侧脑血流差
[0092]
2.4统计学分析
[0093]
实验结果用spss19.0软件进行数据统计分析，数据用平均数
±
标准差(x
‑±
s)表示，多组数据采用单因素方差分析。p＜0.05表示有统计学差异。
[0094]
3结果
[0095]
3.1慢性脑缺血小鼠两侧脑血流
[0096]
由表5可知，术后立即对小鼠的双侧脑血流进行测定。与假手术组比，术后模型组右侧脑血流明显降低，经双侧血流差异分析有统计学意义(p＜0.01)。说明慢性脑缺血小鼠造模成功。与模型组比，各给药组的两侧血流差均没有统计学差异(p》0.05)。术后30天(即给药30天)，与模型组比，各给药组的两侧脑血流差变小，有统计学意义(p《0.05或0.01)，且各给药组的血流恢复率均较模型组高(56.93％)。从脑血流图1可知，假手术组的左右两侧脑血流没有差异；模型组的左侧脑血流明显少于右侧；与模型组比，组合高低剂量组小鼠右侧脑血流明显增加，可见组合药物可以明显促进慢性脑缺血小鼠右侧脑血流的恢复。
[0097]
表5小鼠双侧脑血流差(x
±
s，n＝10)
[0098][0099]
注：与模型比，
*
p《0.05，
**
p《0.01
[0100]
通过上述实施例可看到，本发明的联合用药物对能够有效提高氯化钴损伤pc12细胞的存活率，且在动物实验中能够改善慢性脑缺血小鼠两侧脑血流。因此其能够用于制备预防和/或治疗慢性脑缺血的药物，应用前景广阔。

技术特征：
1.黄芪甲苷、绿原酸和灯盏乙素联合使用，或黄芪甲苷、绿原酸、灯盏乙素和毛蕊异黄酮联合使用在制备预防和/或治疗慢脑缺血的药物中的用途。2.按照权利要求1所述的用途，其特征在于：所述黄芪甲苷、绿原酸和灯盏乙素的用量比例为摩尔比2.5-10：25-100：25-70；或，所述黄芪甲苷、绿原酸、灯盏乙素和毛蕊异黄酮的用量比例为摩尔比2.5-10：25-100：25-70：3.95-31.6。3.按照权利要求2所述的用途，其特征在于：所述黄芪甲苷、绿原酸和灯盏乙素的用量比例为摩尔比10：75：40；或，所述黄芪甲苷、绿原酸、灯盏乙素和毛蕊异黄酮的用量比例为摩尔比10：75：40：15.8。4.一种用于预防和/或治疗慢脑缺血的药物组合物，其特征在于：它是以包括黄芪甲苷、绿原酸和灯盏乙素或其药学上可接受的盐的原料组合物为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制成的。5.按照权利要求4所述的药物组合物，其特征在于：所述黄芪甲苷、绿原酸和灯盏乙素的用量比例为摩尔比2.5-10：25-100：25-70。6.按照权利要求5所述的药物组合物，其特征在于：所述黄芪甲苷、绿原酸和灯盏乙素的用量比例为摩尔比10：75：40。7.按照权利要求4所述的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物的剂型为固体制剂或液体制剂，所述固体制剂为丸剂、散剂、片剂或颗粒剂，所述液体制剂为口服液。8.按照权利要求7所述的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物的剂型为液体制剂，所述黄芪甲苷的浓度为2.5-10umol/l，所述绿原酸的浓度为25-100umol/l，所述灯盏乙素的浓度为25-70umol/l。9.按照权利要求8所述的药物组合物，其特征在于：所述黄芪甲苷的浓度为10umol/l，所述绿原酸的浓度为75umol/l，所述灯盏乙素的浓度为40umol/l。10.按照权利要求4所述的药物组合物，其特征在于：所述原料组合物中还包括毛蕊异黄酮，所述黄芪甲苷、绿原酸、灯盏乙素和毛蕊异黄酮的用量比例为摩尔比2.5-10：25-100：25-70：3.95-31.6。

技术总结
本发明属于化学医药领域，具体涉及一种用于治疗慢性脑缺血的黄芪甲苷、绿原酸和灯盏乙素联合用药物。本发明提供黄芪甲苷、绿原酸和灯盏乙素联合使用在制备预防和/或治疗慢性脑缺血的药物中的用途，此外，毛蕊异黄酮也可作为额外的成分与上述三种成分联合使用制备预防和/或治疗慢性脑缺血的药物。本发明的药物能够协同增效，用于治疗慢性脑缺血，产生很好的治疗效果，为临床治疗慢性脑缺血提供了新的选择，具有很好的应用前景。具有很好的应用前景。具有很好的应用前景。


技术研发人员：盛艳梅 谢兴亮 鄢宇梅 程芳 张洁 米佳佳
受保护的技术使用者：成都医学院
技术研发日：2022.06.08
技术公布日：2023/9/22