一种神经系统来源多肽及负载该多肽的手术垫片及其应用的制作方法

1.本发明属于生物医药领域，具体涉及一种神经系统来源多肽及负载该多肽的手术垫片及其应用。


背景技术：

2.有三叉神经痛、舌咽神经痛和面肌痉挛等神经性疾病症状的颅神经血管压迫综合征是一种常见的神经外科疾病，其主要发病原因是由于颅神经出/入脑干处受到责任血管压迫造成的，查阅相关文献发现，颅神经出/入脑干处延伸至约4mm处依旧是中枢神经髓鞘存在区域。而且，有研究发现患有颅神经血管压迫综合征患者的神经根处神经细胞的超微结构表明：颅神经血管压迫综合征患者在责任血管压迫的颅神经根处存在中枢神经脱髓鞘损伤。针对责任血管长期压迫颅神经后致使中枢神经脱髓鞘损伤，从而导致神经传导异常而发生颅神经血管压迫综合征的这一根本原因，jannetta教授于1967年首次提出微血管减压术，该手术是利用tefflon垫片将压迫神经根的责任血管(一根或多根)垫起隔离开，从而达到治疗颅神经血管压迫综合的目的。此外，还可通过三叉神经毁损术进行相应治疗，主要包括射频治疗和球囊压迫等手术治疗。
3.目前，微血管减压术已是针对颅神经血管压迫综合征常规开展的手术。例如，专利cn201911238759.2公开了一种微血管神经减压术用的微导管，所述微导管在其长度方向上从远端至近端依次包括储囊、以可解脱的方式与储囊连接的解脱机构、以及对解脱机构进行控制的解脱开关，所述储囊内具有减压垫，其所述的微导管进行微血管神经减压术时，具有免开颅、风险低、微创伤口小、手术迅速、恢复时间短、保留神经功能与远期疗效高等优异效果。专利cn201811000072.0则公开了一种特氟龙减压材料，该材料具有由聚四氟乙烯纤维构成的棉絮状纤维结构，密度为0.001-0.002g/cm3，聚四氟乙烯纤维的直径为0.1-0.2mm，采用该teflon减压材料制备得到手术垫片，能降低手术无效及复发的概率，提高微血管减压术的疗效，同时，该手术垫片可设计成多种规格的规范化的外形和尺寸，满足微血管减压术中不同粗细血管的各种情况，手术时可以直接使用，无需人工撕扯调整外形尺寸，降低手术的不确定性。虽然微血管减压术具有创伤小，预后良好的优点，但在实际治疗过程中也存在着术后无效或复发等难题。因此，针对如何提高微血管减压术治疗颅神经血管压迫综合征的疗效已经成为该疾病的临床研究热点。
4.微血管减压术虽然可以隔离开责任血管与颅神经根，使颅神经根免受责任血管的持续物理压迫，但微血管减压术却不能治疗颅神经根受到责任血管压迫导致的脱髓鞘损伤，因此，寻找可同时缓解责任血管压迫并促进中枢中枢神经脱髓鞘损伤修复的方法意义重大。


技术实现要素：

5.发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种神经系统来源多肽及负载该多肽的tefflon垫片在颅神经血管压迫综合征微血管减压术(mvd)中的应用。本发
明所述的神经系统来源多肽可显著促进少突胶质前体细胞分化为少突胶质细胞，负载该多肽的tefflon垫片可显著促进为神经脱髓鞘损伤修复，为解决颅神经血管压迫综合征术后无效、复发提供了新的思路及方法。
6.技术方案：为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
7.一方面，本发明提供了一种神经系统来源的多肽，所述的多肽的氨基酸序列为seq id no:1：ladptgafgketdl所示的序列。
8.另一方面，本发明提供了一系列编码上述多肽的核酸分子。
9.具体地，所述的核酸分子包含一种或多种经密码子优化的核酸分子。
10.又一方面，本发明提供了一系列载体，所述的载体包含上述一个或多个核酸分子。
11.具体地，所述的载体包括但不限于质粒、病毒、噬菌体。
12.又一方面，本发明提供了一系列包含上述核酸分子或上述载体的宿主细胞。
13.具体地，所述的宿主细胞包括但不限于微生物、植物或动物细胞，可通过本领域技术人员已知的方法将本发明所述的载体引入所述宿主细胞中，例如电穿孔、lipofectine转染、lipofectamin转染等方法。
14.又一方面，本发明提供了上述多肽、核酸分子、载体或宿主细胞在制备tefflon减压材料中的应用。
15.具体地，所述的tefflon减压材料负载上述多肽、核酸分子、载体或宿主细胞。
16.具体地，所述的tefflon减压材料为本领域微血管减压术mvd手术常规使用的tefflon垫片，可通过常规方式获得。
17.进一步具体地，所述的tefflon垫片包括但不限于涤纶片、涤纶毡片等材料。
18.在某些实施例中，所述的负载该多肽的tefflon减压材料的制备可通过以下方法获得：首先将tefflon表面等离子体活化处理，在等离子反应器中，采用高纯度氨气进行射频辉光放电等离子体处理静电纺tefflon材料纤维支架，使tefflon减压材料表面氨基化；其次将透明质酸溶于mes缓冲液中，将上述多肽、核酸分子、载体或宿主细胞充分分散于透明质酸缓冲液中，加入交联剂，然后把氨基化的tefflon纤维支架浸入透明质酸溶液过夜，最后用大量去离子水清洗，将负载多肽透明质酸的tefflon减压植入材料冷冻干燥。
19.与现有技术相比，本发明的积极和有益效果在于：
20.(1)本发明提供了一种神经系统来源的多肽ladptgafgketdl(seq id no:1)，为pdx5来源肽，由14个氨基酸组成，目前尚无其相关功能报道。生物信息学分析结果显示：1)该多肽来源于pdx5蛋白的150-163位氨基酸；2)protparam在线分析发现，该多肽的脂肪系数为70，平均亲疏水性为-0.300，表现为疏水亲脂性。
21.(2)本发明通过细胞实验发现，上述神经系统来源的多肽可以显著促进少突胶质前体细胞增殖及分化，具有促进髓鞘再生功能。
22.(3)本发明还提供了负载上述神经系统来源多肽(seq id no:1)的tefflon减压材料及其制备方法，首先通过将tefflon表面等离子体活化处理，在等离子反应器中，采用高纯度氨气进行射频辉光放电等离子体处理静电纺tefflon材料纤维支架，使tefflon减压材料表面氨基化；其次将透明质酸溶于mes缓冲液中，将多肽充分分散于透明质酸缓冲液中，加入交联剂，然后把氨基化的tefflon纤维支架浸入透明质酸溶液过夜，最后用大量去离子水清洗，将负载多肽透明质酸的tefflon减压植入材料冷冻干燥。
23.(4)本发明还提供了负载上述神经系统来源多肽(seq id no:1)的tefflon减压材料在颅神经压迫综合征面肌痉挛大鼠损伤模型中的应用，通过构建面肌痉挛大鼠损伤模型，并将负载该多肽的tefflon减压材料置于面神经损伤处，结果显示，治疗5天后，材料置入组(置入负载该多肽的tefflon减压材料)跟损伤组相比，面神经中脱髓鞘损伤被显著修复。因此，负载上述神经系统来源多肽(seq id no:1)的tefflon减压材料可以应用于制备颅神经血管压迫综合征mvd手术使用的促进髓鞘再生的减压材料。
附图说明
24.图1为所述神经系统来源多肽促进少突胶质前体细胞增殖的cck8结果图。
25.图2为所述神经系统来源多肽促进少突胶质前体细胞分化的qpcr结果图。
26.图3为所述神经系统来源多肽促进少突胶质前体细胞分化的westernblot结果图。
27.图4为利用负载多肽的tefflon减压材料干预面肌痉挛大鼠面神经损伤后，面神经损伤处少突胶质前提细胞分化标记基因表达的qpcr结果图。
28.图5为利用负载多肽的tefflon减压材料干预面肌痉挛大鼠面神经损伤后，面神经损伤处髓鞘再生标记蛋白表达的westernblot结果图。
具体实施方式
29.下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
30.实施例1.
31.委托南京金斯瑞生物科技有限公司通过固相法合成如下seq id no:1所示氨基酸序列：ladptgafgketdl。
32.通过在线工具获取多肽序列的主要生物学参数如下：等电点(pi)为4.03，分子质量(mw)为1434.57。
33.上述序列为来源于神经系统的天然序列，可通过氨基酸固相合成方法获得；也可通过微生物或者宿主细胞内表达所述多肽片段，分离提纯获得。所述的微生物和宿主细胞为公众所知且常规使用的，例如大肠杆菌(e.coli)，放线菌(actinomycetes)，芽孢杠菌(bacillus)，链霉菌(streptomyces)等宿主细胞，本发明说述的多肽分离提纯方法为本领域技术人员公知的方法技术，例如可通过常规的液相色谱法进行分离和纯化。
34.实施例2.
35.购买mvd手术常规使用tefflon减压垫片，将其裁剪至合适大小，将tefflon表面等离子体活化处理，在等离子反应器中，采用高纯度氨气进行射频辉光放电等离子体处理静电纺tefflon材料纤维支架，使tefflon减压材料表面氨基化；其次将透明质酸溶于mes缓冲液中，将多肽充分分散于透明质酸缓冲液中，加入交联剂，然后把氨基化的tefflon纤维支架浸入透明质酸溶液过夜，最后用大量去离子水清洗，将负载多肽透明质酸的tefflon减压植入材料冷冻干燥。
36.实验例1.
37.以大鼠少突胶质前体细胞cg4为研究对象，将合成多肽设置不同浓度(0μm、5μm、10μm、25μm、50μm)，与24小时、48小时及72小时干预时间进行细胞活性检测。
38.实验方法：采用cck8检测细胞活性，大鼠少突胶质前体细胞悬液接种于96孔板中，贴壁后换成含不同多肽浓度培养基，分别处理24h、48h、72h后，每孔加入10μl的cck8溶液，培养箱孵育1h，450nm测定吸光度(a)值。
39.检测结果如图1所示，随着多肽浓度的增加，多肽持续处理可显著增加大鼠少突胶质前体细胞的活性。采用50μm终浓度作为处理浓度，进行后续实验。
40.实验例2.多肽对大鼠少突胶质前体细胞分化的影响
41.以大鼠少突胶质前体细胞cg4为研究对象，以50μm浓度的多肽加入诱导培养基中，利用诱导大鼠少突胶质前体细胞分化培养基培养大鼠少突胶质前体细胞以诱发细胞分化，在细胞分化过程中每隔一天向培养体系中添加50μm多肽干预，分化4天后，利用qpcr实验检测mbp、mog及plp的mrna表达水平评估少突胶质前体细胞分化效果，具体方法如下：
42.2.1.细胞总rna提取
43.收集对照组和多肽干预组大鼠少突胶质前体细胞，加入rna提取液(诺唯赞，r701-01)，按照说明书操作，提取总rna。
44.2.2.逆转录反应
45.将提取的对照组和多肽干预组大鼠少突胶质前体细胞总rna进行定量，采用hiscript iii 1st strand cdna synthesis kit(+gdna wiper)试剂盒(诺唯赞，r312-01)将总rna反转录为cdna，进行后续实验。
46.2.3.qpcr
47.按照以下体系配置qpcr反应体系，2
×
powerup sybr green master mix 5μl、正向引物和反向引物各0.5μl(引物总浓度为500nm)，cdna模板1μl，ddh2o 3μl，按照以下反应程序进行qpcr，50℃2min，95℃2min，95℃15s，60℃15s，72℃1min(第三第五步骤设置40个循环)；采用δδct法计算mrna的相对表达量(利用gapdh进行标化)：mrna相对表达量＝2
(
△
ct(control)
‑△
ct(mrna))
。
48.其中，正、反向引物分别如下表1所示。
49.表1
50.geneforward sequence(5'to3')sequencereverse(5'to3')gapdhggctggcattgctctcaatgattactccttggaggccatgtambpgagcagccgctgtcagtcgtgttcaagagcggtgctgmogctccgtgcagaagtcgagaatcaaaaggggtttcttagctctplpctgcaaaacagccgagttccatcagaacttggtgcctcgg
51.检测结果如图2所示，多肽可促进大鼠少突胶质前体细胞的分化。
52.实验例3.多肽对大鼠少突胶质前体细胞分化的相关蛋白表达水平影响
53.3.1.细胞总蛋白提取：
54.培养细胞的大皿中加入4℃预冷的ripa裂解液，500μl/孔，利用移液器吸头刮下细胞收集至1.5mlep管中，冰上静置裂解30min。裂解完成后于4℃，12000rpm离心30min，取上清即为提取蛋白质。
55.3.2.蛋白定量
56.采用bca法蛋白定量(碧云天，中国，cat：p0012)，按照说明书进行蛋白定量。
57.3.3.western blot实验
58.采用预制胶(天地人和，中国，sle009)，按照标准western blot实验操作流程进行实验，其中采用抗体具体信息为：mbp(proteintech,cat no.10458-1-ap)，mog(proteintech,cat no.12690-1-ap)。
59.检测结果如图3所示，多肽可促进大鼠少突胶质前体细胞的分化。
60.实施例4.利用负载多肽tefflon减压材料干预面肌痉挛大鼠面神经损伤对面神经处少突胶质细胞分化基因表达水平的影响
61.取成年、体重250g左右雄性大鼠，麻醉后手术暴露左侧面神经根部分，在面神经根用动力钳夹60s造成挤压伤，构建面肌痉挛大鼠面神经损伤模型(hsfmodel)，分为对照组，面肌痉挛损伤组，面肌痉挛损伤+负载多肽tefflon材料组，损伤5天后，取损伤区面神经根，提取rna(步骤详见2.1)，反转录为cdna(步骤详见2.2)，进行qpcr(步骤详见2.3)，结果详见图4。由图4可知，负载多肽tefflon材料可显著促进面神经根处少突胶质细胞分化。
62.实施例5.利用负载多肽tefflon减压材料干预面肌痉挛大鼠面神经损伤对面神经处少突胶质细胞分化基因蛋白表达水平的影响
63.取成年、体重250g左右雄性大鼠，麻醉后手术暴露左侧面神经根部分，在面神经根用动力钳夹60s造成挤压伤，构建面肌痉挛大鼠面神经损伤模型，分为对照组，面肌痉挛损伤组(hsf)，面肌痉挛损伤+负载多肽tefflon材料组，损伤5天后，取损伤区面神经根，提取组织总蛋白(步骤详见3.1)，进行westernblot(步骤详见3.3)，结果详见图5。由图5可知，负载多肽tefflon材料可显著促进面神经根处少突胶质细胞分化相关蛋白mbp及mog的表达。
64.以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

技术特征：
1.一种神经系统来源的多肽，其特征在于：所述的多肽的氨基酸序列为seq id no:1：ladptgafgketdl所示的序列。2.一种编码权利要求1所述的多肽的核酸分子。3.一种载体，其特征在于：所述的载体包含权利要求2所述的核酸分子。4.一种包含权利要求2所述的核酸分子或权利要求3所述的载体的宿主细胞。5.权利要求1所述的多肽、权利要求2所述的核酸分子、权利要求3所述的载体或权利要求4所述的宿主细胞在制备tefflon减压材料中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的tefflon减压材料负载权利要求1所述的多肽、权利要求2所述的核酸分子、权利要求3所述的载体或权利要求4所述的宿主细胞。7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的tefflon减压材料为微血管减压术使用的tefflon垫片，所述的tefflon垫片包括涤纶片或涤纶毡片材料。8.一种tefflon减压材料，其特征在于：所述的tefflon减压材料负载权利要求1所述的多肽、权利要求2所述的核酸分子、权利要求3所述的载体或权利要求4所述的宿主细胞。9.一种权利要求8所述的tefflon减压材料的制备方法，其特征在于：所述的制备方法包括以下步骤：将tefflon表面等离子体活化处理，在等离子反应器中，采用高纯度氨气进行射频辉光放电等离子体处理静电纺tefflon材料纤维支架，使tefflon减压材料表面氨基化；其次将透明质酸溶于mes缓冲液中，将权利要求1所述的多肽、权利要求2所述的核酸分子、权利要求3所述的载体或权利要求4所述的宿主细胞充分分散于透明质酸缓冲液中，加入交联剂，然后把氨基化的tefflon纤维支架浸入透明质酸溶液过夜，最后用大量去离子水清洗，将负载多肽透明质酸的tefflon减压植入材料冷冻干燥。

技术总结
本发明公开了一种神经系统来源多肽及负载该多肽的手术垫片及其应用，属于生物医药领域。本发明所述的神经系统来源多肽可显著促进少突胶质前体细胞分化为少突胶质细胞，负载该多肽的Tefflon垫片可显著促进为神经脱髓鞘损伤修复，为解决颅神经血管压迫综合征术后无效、复发提供了新的思路及方法。复发提供了新的思路及方法。复发提供了新的思路及方法。


技术研发人员：李心远 董晓华 华春晖 李桀 陈莹莹
受保护的技术使用者：上海市同仁医院
技术研发日：2023.02.28
技术公布日：2023/9/22