亚硫酸氢盐试剂的评价方法及基因检查方法与流程

1.本发明涉及一种亚硫酸氢盐试剂的评价方法及基因检查方法。


背景技术：

2.存在一种甲基加成到构成dna的胞嘧啶的碳原子上而导致dna被甲基化的现象。已知dna的甲基化与疾病的发病或恶化相关，其作为对疾病的诊断有用的信息而受到关注。
3.dna的甲基化度的分析方法存在几种，其中具有代表性的一种是结合了亚硫酸氢盐处理、pcr(polymerase chain reaction：聚合酶链式反应)及序列分析的方法，即亚硫酸氢盐测序法。
4.专利文献1中公开了一种将用亚硫酸氢盐处理的核酸样品使用尺寸排除技术及尺寸排除器件来纯化的方法。
5.专利文献2中公开了一种核酸样品的时序确定方法，该方法包括多个核酸片段中的胞嘧啶的部分和不完全的亚硫酸氢盐转换。
6.现有技术文献
7.专利文献
8.专利文献1：日本特表2007-503813号公报
9.专利文献2：日本特表2015-522289号公报


技术实现要素：

10.发明要解决的技术课题
11.用亚硫酸氢盐试剂处理dna时，非甲基化胞嘧啶转换为尿嘧啶，然而甲基化胞嘧啶作为胞嘧啶残留。即，通过亚硫酸氢盐处理，胞嘧啶的修饰状态(未被甲基化或被甲基化)转换为该位置的序列信息(尿嘧啶或胞嘧啶)。
12.然而，关于亚硫酸氢盐反应，虽然频率低，但有时也会引起错误反应。将非甲基化胞嘧啶未转换为尿嘧啶而作为胞嘧啶残留的错误称为“不完全转换(failed conversion)”。甲基化胞嘧啶转换为尿嘧啶的错误称为“不适当转换(inappropriate conversion)”。将dna的甲基化度用作疾病的生物标志时，上述2个转换错误成为导致灵敏度或特异性降低的原因。
13.专利文献1中记载了以减少不完全转换的目的来调整亚硫酸氢浓度的内容。专利文献2中记载了调整亚硫酸氢濃度和反应时间来对应不完全转换的内容。然而，亚硫酸氢盐试剂的不完全转换与不适当转换存在权衡关系，可能当减少不完全转换时不适当转换增加，当减少不适当转换时不完全转换增加。
14.本发明是基于上述情况完成的。
15.本发明的课题在于提供一种用于根据基因检查对象而区分使用的亚硫酸氢盐试剂的评价方法、及能够根据基因检查对象区分使用亚硫酸氢盐试剂的基因检查方法。
16.用于解决技术课题的手段
17.用于解决上述课题的具体方法包括下述方式。
18.＜1＞一种亚硫酸氢盐试剂的评价方法，包括下述(a)～(c)，
19.(a)准备测量对象的cpg位点未被甲基化的dna样品1，用评价对象的亚硫酸氢盐试剂处理dna样品1之后，对测量对象的cpg位点的甲基化度进行测量，计算错误率1。错误率1为测量对象的cpg位点的甲基化度的平均值，
20.(b)准备与dna样品1为相同的序列且测量对象的cpg位点被甲基化的dna样品2，用评价对象的亚硫酸氢盐试剂处理dna样品2之后，对测量对象的cpg位点的甲基化度进行测量，计算错误率2。错误率2为100-(测量对象的cpg位点的甲基化度的平均值)，
21.(c)比较错误率1和错误率2，当错误率1≤错误率2时，将评价对象的亚硫酸氢盐试剂评价为不适当转换倾向，当错误率1＞错误率2时，将评价对象的亚硫酸氢盐试剂评价为不完全转换倾向。
22.＜2＞一种基因检查方法，以发病或恶化与基因的甲基化或非甲基化相关的疾病为检测对象，分析基因的甲基化度，该基因检查方法中，
23.受检者为没有疾病患病史的人，
24.该方法包括用亚硫酸氢盐试剂处理受检者的dna的步骤，
25.关于亚硫酸氢盐试剂，当以发病或恶化与基因的甲基化相关的疾病为检测对象时，其是通过＜1＞所述的亚硫酸氢盐试剂的评价方法被评价为不适当转换倾向的亚硫酸氢盐试剂，当以发病或恶化与基因的非甲基化相关的疾病为检测对象时，其是通过＜1＞所述的亚硫酸氢盐试剂的评价方法评价为不完全转换倾向的亚硫酸氢盐试剂。
26.＜3＞一种基因检查方法，以发病或恶化与基因的甲基化或非甲基化相关的疾病为检测对象，分析基因的甲基化度，该基因检查方法中，
27.受检者为有疾病患病史的人，
28.该方法包括用亚硫酸氢盐试剂处理受检者的dna的步骤，
29.关于亚硫酸氢盐试剂，当以发病或恶化与基因的甲基化相关的疾病为检测对象时，其是通过＜1＞所述的亚硫酸氢盐试剂的评价方法被评价为不完全转换倾向的亚硫酸氢盐试剂，当以发病或恶化与基因的非甲基化相关的疾病为检测对象时，其是通过＜1＞所述的亚硫酸氢盐试剂的评价方法被评价为不适合转换倾向的亚硫酸氢盐试剂。
30.＜4＞根据权利要求2或3所述的基因检查方法，其中，
31.根据所述亚硫酸氢盐试剂的评价中的所述错误率1及所述错误率2的值推定检查中的假阳性率及假阴性率。
32.＜5＞根据＜2＞至＜4＞中任一项所述的基因检查方法，其中，
33.疾病为癌症。
34.发明效果
35.根据本发明，提供一种用于根据基因检查对象而区分使用的亚硫酸氢盐试剂的评价方法、及能够根据基因检查对象区分使用亚硫酸氢盐试剂的基因检查方法。
具体实施方式
36.以下，对本发明的实施方式进行说明。这些说明及实施例是实施方式的示例，并不限制实施方式的范围。
37.在本发明中，“工序”这一术语不仅包含独立的工序，即使在无法与其他工序明确区分的情况下，只要能够实现该工序的预期目的，则也包含于本术语中。
38.在本发明中，使用“～”表示的数值范围表示将记载于“～”前后的数值分别作为最小值及最大值而包含的范围。
39.在本发明中阶段性地记载的数值范围中，在一个数值范围记载的上限值或下限值可以替换成其他阶段性地记载的数值范围的上限值或下限值。并且，在本发明中所记载的数值范围中，该数值范围的上限值或下限值也可以替换成实施例所示的值。
40.在本发明中，“定序器”是将第一代定序器(毛细管定序器)、第二代定序器(下一代定序器)、第三代定序器、第四代定序器及今后开发的定序器包括在内的术语。定序器可以是毛细管定序器，也可以是下一代定序器，也可以是其他定序器。作为定序器，从分析速度，一次可处理的试样数量的多少等观点考虑，优选下一代定序器。下一代定序器(next generation sequencer，ngs)是指与使用桑格法的毛细管定序器(称为第一代定序器。)对比来进行分类的定序器。当前最为普及的下一代定序器是捕捉与dna聚合酶的互补链合成或dna连接酶的互补链结合联动的荧光或发光来决定碱基序列的原理的定序器。具体而言，可以举出miseq(illumina,inc.)、hiseq2000(illumina,inc.，hiseq为注册商标)、roche454(roche diagnostics k.k.)等。
41.在本发明中，胞嘧啶的甲基化是指在胞嘧啶的嘧啶环5位的碳上加成甲基。
42.＜亚硫酸氢盐试剂的评价方法＞
43.关于亚硫酸氢盐试剂，虽然频率低，但也可能引起两种错误转换。一种是非甲基化胞嘧啶未转换为尿嘧啶而作为胞嘧啶残留的“不完全转换(failed conversion)”。另一种是甲基化胞嘧啶转换为尿嘧啶的“不适当转换(inappropriate conversion)”。
44.当发生不完全转换时，非甲基化胞嘧啶被错误地判别为甲基化状态，从而dna的甲基化度被测量为高于原值。
45.当发生不适当转换时，甲基化胞嘧啶被错误地判别为非甲基化状态，从而dna的甲基化度被测量为低于原值。
46.本发明人发现，在利用dna的甲基化度作为生物标记时，将上述两种转换误差作为甲基化信号降低手段或甲基化信号扩增手段来利用。
47.并且，本发明人发现，在亚硫酸氢盐试剂中存在容易引起不完全转换的试剂(称为“不完全转换倾向的试剂”。)和容易引起不适当转换的试剂(称为“不适当转换倾向的试剂”。)。
48.而且，本发明人发现，根据基因检查的性质(例如，灵敏度优先的基因检测，特异性优先的基因检测)区分使用亚硫酸氢盐试剂。
49.本发明的亚硫酸氢盐试剂的评价方法包括下述(a)～(c)。
50.(a)准备测量对象的cpg位点未被甲基化的dna样品1，用评价对象的亚硫酸氢盐试剂处理dna样品1之后，对测量对象的cpg位点的甲基化度进行测量，计算错误率1。错误率1为测量对象的cpg位点的甲基化度的平均值。
51.(b)准备与dna样品1为相同的序列且测量对象的cpg位点被甲基化的dna样品2，用评价对象的亚硫酸氢盐试剂处理dna样品2之后，对测量对象的cpg位点的甲基化度进行测量，计算错误率2。错误率2为100-(测量对象的cpg位点的甲基化度的平均值)。
52.(c)比较错误率1和错误率2，当错误率1≤错误率2时，将评价对象的亚硫酸氢盐试剂评价为不适当转换倾向，当错误率1＞错误率2时，将评价对象的亚硫酸氢盐试剂评价为不完全转换倾向。
53.以下，详细说明亚硫酸氢盐试剂的评价方法的要素。
54.[亚硫酸氢盐试剂]
[0055]
亚硫酸氢盐试剂是通过亚硫酸氢盐反应将碱基序列中未被甲基化的胞嘧啶转换为尿嘧啶的试剂，是含有亚硫酸氢盐作为主要成分的试剂。
[0056]
亚硫酸氢盐试剂使用于亚硫酸氢盐测序法。亚硫酸氢盐测序法的概要如下。
[0057]
用亚硫酸氢盐试剂处理dna时，非甲基化胞嘧啶转换为尿嘧啶，然而甲基化胞嘧啶作为胞嘧啶残留。即，通过亚硫酸氢盐处理，胞嘧啶的修饰状态(未被甲基化或被甲基化)转换为该位置的序列信息(尿嘧啶或胞嘧啶)。然后，通过pcr(polymerase chain reaction)进行dna的扩增。该过程中，尿嘧啶转换为胸腺嘧啶。然后，使用定序器分析扩增产物的序列。通过确定分析对象位置的碱基是胸腺嘧啶或胞嘧啶中的哪一个，可以知道dna中目标位置的胞嘧啶的修饰状态(未被甲基化或被甲基化)。
[0058]
评价对象的亚硫酸氢盐试剂可以是市售品，也开始是新制备的试剂。作为亚硫酸氢盐试剂的是市售品，可以举出epitect plus bisulfite conversion kit(qiagen n.v.制造)、epitect fast dnabisulfite kit(qiagen n.v.制造)、ez dnamethylation direct kit(zymo research公司制造)、ez dna methylation gold kit(zymo research公司制造)、ez dnamethylation lightning kit(zymo research公司制造)、innuconvert bisulfite body fluids kit(analytik jena公司制造)、innuconvert bisulfite basic kit(analytik jena公司制造)、premium bisulfite(diagenode公司制造)等。
[0059]
当亚硫酸氢盐试剂为市售品的情况下，利用亚硫酸氢盐试剂进行的dna样品1及dna样品2的处理优选遵循该亚硫酸氢盐试剂的推荐方案。
[0060]
利用亚硫酸氢盐试剂进行的dna处理有如下：在高摩尔浓度且高温下进行比较短时间的反应和在低摩尔浓度且低温下进行比较长时间的反应。通常，若反应时间小于8小时，则属于前者，若反应时间为8小时以上，则属于后者。
[0061]
[cpg位点的甲基化度]
[0062]
cpg位点是在胞嘧啶之后出现鸟嘌呤的双碱基序列。
[0063]
cpg位点的甲基化度是从dna片段的集合计算出的值，按每个cpg位点进行计算。某一cpg位点的甲基化度是{其cpg位点被甲基化的dna片段数
÷
(其cpg位点被甲基化的dna片段数+其cpg位点未被甲基化的dna片段数)}，以百分比(％)表示。
[0064]
dna具有多个测量对象的cpg位点时，测量对象的cpg位点的甲基化度是各cpg位点的甲基化度的平均值。
[0065]
[dna样品1、dna样品2]
[0066]
dna样品1与dna样品2的碱基序列相同，但测量对象的cpg位点的修饰状态(未被甲基化或被甲基化)不同。
[0067]
dna样品1和dna样品2可以是合成dna，也可以是标样dna。
[0068]
dna样品1中，测量对象的cpg位点的胞嘧啶为非甲基化状态。dna样品1定义为通过通常的甲基化测量技术测量为甲基化度0％～5％的dna。
[0069]
dna样品2中，测量对象的cpg位点的胞嘧啶为甲基化状态。dna样品2定义为通过通常的甲基化测量技术测量为甲基化度95％～100％的dna。
[0070]
dna样品1和dna样品2的碱基长度分别优选为50碱基～150碱基，更优选为50碱基～125碱基，进一步优选为50碱基～100碱基。
[0071]
dna样品1及dna样品2所具有的测量对象的cpg位点的个数分别优选为1个～10个，更优选为2个～8个，进一步优选为3个～6个。
[0072]
[错误率1、错误率2]
[0073]
总而言之，错误率1是将未被甲基化的cpg位点判别为甲基化状态的比率。错误率1通过用评价对象的亚硫酸氢盐试剂处理dna样品1，然后进行pcr及序列分析来求出。将dna样品1的亚硫酸氢盐处理、pcr及序列分析进行3次，并将3次甲基化度平均值(％)设为错误率1(％)。
[0074]
总而言之，错误率2是将被甲基化的cpg位点判别为非甲基化状态的比率。错误率2通过用评价对象的亚硫酸氢盐试剂处理dna样品2，然后进行pcr及序列分析来求出。将dna样品2的亚硫酸氢盐处理、pcr及序列分析进行3次，从100减去3次甲基化度的平均值(％)，并将其值设为错误率2(％)。
[0075]
[不适当转换倾向、不完全转换倾向]
[0076]
比较错误率1和错误率2，当错误率1≤错误率2时，将评价对象的亚硫酸氢盐试剂评价为不适当转换倾向。当发生不适当转换时，甲基化胞嘧啶被错误地判别为非甲基化状态，从而dna的甲基化度被测量为低于原值。不适当转换倾向的亚硫酸氢盐试剂是dna的甲基化度被测量为低于原值的可能性高于dna的甲基化度被测量为高于原值的可能性的亚硫酸氢盐试剂。不适当转换倾向的亚硫酸氢盐试剂可以称为甲基化信号降低手段。
[0077]
比较错误率1和错误率2，当错误率1＞错误率2时，将评价对象的亚硫酸氢盐试剂评价为不完全转换倾向。当发生不完全转换时，非甲基化胞嘧啶被错误地判别为甲基化状态，从而dna的甲基化度被测量为高于原值。不完全转换倾向的亚硫酸氢盐试剂是dna的甲基化度被测量为高于原值的可能性高于dna的甲基化度被测量为低于原值的可能性的亚硫酸氢盐试剂。不完全转换倾向的亚硫酸氢盐试剂可以称为甲基化信号扩增手段。
[0078]
亚硫酸氢盐试剂为市售品的情况下，通常如下所述。具有反应时间为8小时以上的推荐方案的亚硫酸氢盐试剂容易被评价为不适当转换倾向的亚硫酸氢盐试剂。具有反应时间为小于8小时的推荐方案的亚硫酸氢盐试剂容易被评价为不完全转换倾向的亚硫酸氢盐试剂。因此，通过推荐方案，可以在实施本发明的评价亚硫酸氢盐试剂的评价方法之前预测亚硫酸氢盐试剂是不适当转换倾向还是不完全转换倾向。
[0079]
＜基因检查方法＞
[0080]
本发明的基因检查方法的受检者是人。受检者例如是按自己的意愿进行健康检查的就诊者、在医疗机构中被怀疑有疾病的人、正在治疗的患者、从疾病中康复的原患者。
[0081]
通过本发明的基因检查方法获得的信息作为辅助医生诊断的信息、医生或受检者判断是否需要精密检查(例如图像检查)的依据、医生选择治疗方法或治疗药的依据、受检者改善生活习惯的动机等是有用的。
[0082]
本发明的基因检查方法是分析基因的甲基化度的基因检查方法。作为本发明的基因检查方法的检查对象的疾病只要是伴随基因中的胞嘧啶的甲基化或非甲基化的疾病，则
并无特别限制。作为疾病，可以举出癌症、自身免疫性疾病、神经系统疾病、心脏疾病、心血管疾病、脑血管疾病、代谢疾病、内分泌疾病等。作为癌症，可以举出肺癌、食道癌、胃癌、大肠癌、胰腺癌、肝细胞癌、胆囊癌、胆管癌、肾癌、膀胱癌、尿道癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、皮肤癌、白血病、骨髓瘤、淋巴瘤、甲状腺癌、脑瘤等。作为癌症以外的疾病，可以举出类风湿性关节炎、精神分裂症等。
[0083]
本发明的基因检查方法以发病或恶化与基因的甲基化或非甲基化相关的疾病为检测对象，分析基因的甲基化度。本发明的基因检查方法中，根据受检者的患病史、及疾病与基因的甲基化或非甲基化的相关性，区分使用亚硫酸氢盐试剂。本发明公开2个实施方式作为基因检查方法。
[0084]
第一实施方式中，将没有检测对象的疾病患病史的人作为受检者。第一实施方式包括用亚硫酸氢盐试剂处理受检者的dna的步骤，以发病或恶化与基因的甲基化相关的疾病为检测对象时，使用通过本发明的亚硫酸氢盐试剂的评价方法被评价为不适当转换倾向的亚硫酸氢盐试剂，以发病或恶化与基因的非甲基化相关的疾病为检测对象时，使用通过本发明的亚硫酸氢盐试剂的评价方法被评价为不完全转换倾向的亚硫酸氢盐试剂。
[0085]
第二实施方式中，将有检测对象的疾病患病史的人作为受检者。第二实施方式包括用亚硫酸氢盐试剂处理受检者的dna的步骤，以发病或恶化与基因的甲基化相关的疾病为检测对象时，使用通过本发明的亚硫酸氢盐试剂的评价方法被评价为不完全转换倾向的亚硫酸氢盐试剂，以发病或恶化与基因的非甲基化相关的疾病为检测对象时，使用通过本发明的亚硫酸氢盐试剂的评价方法被评价为不适当转换倾向的亚硫酸氢盐试剂。
[0086]
本发明的基因检查方法通过如上述区分使用亚硫酸氢盐试剂，无需对检查工序进行大幅变更，就能够进行与基因检查性质(例如，特异性优先的基因检查、灵敏度优先的基因检查)对应的适当化。
[0087]
以下，详细说明基因检查方法的要素。
[0088]“发病或恶化与基因的甲基化相关的疾病”是指，某一基因的cpg位点在健康时为非甲基化状态，伴随疾病的发病或恶化成为甲基化状态的疾病。例如，与mt1m(metallothionein 1m)基因的甲基化相关的食道癌属于该疾病。mt1m基因在健康时为非甲基化状态，在许多食道癌患者的癌组织中该基因为甲基化状态。
[0089]“发病或恶化与基因的非甲基化相关的疾病”是指，某一基因的cpg位点在健康时为甲基化状态，伴随疾病的发病或恶化成为非甲基化状态的疾病。例如，与line-1(long interspersed nucleotide element 1)基因的非甲基化相关的肝细胞癌属于该疾病。line-1基因在健康时为甲基化状态，在许多肝细胞癌患者的癌组织中该基因为非甲基化状态。
[0090]
将dna的甲基化度用作疾病的生物标志时，在发病或恶化与基因的甲基化相关的疾病中，假阳性是指将非甲基化胞嘧啶检测为甲基化状态。
[0091]
将dna的甲基化度用作疾病的生物标志时，在发病或恶化与基因的甲基化相关的疾病中，假阴性是指将甲基化胞嘧啶检测为非甲基化状态。
[0092]
将dna的甲基化度用作疾病的生物标志时，在发病或恶化与基因的非甲基化相关的疾病中，假阳性是指将甲基化胞嘧啶检测为非甲基化状态。
[0093]
将dna的甲基化度用作疾病的生物标志时，在发病或恶化与基因的非甲基化相关
的疾病中，假阴性是指将非甲基化胞嘧啶检测为甲基化状态。
[0094]“没有疾病患病史的人”例如是按自己的意愿进行健康检查的受診者。在健康检查中，应避免将健康的人误诊为患病者。并且，由于健康检查通常以比较大的规模进行(例如，在日本，预计每年有数十万受診者接受癌症初步筛查。)，所以从抑制二次筛查(例如图像检查)所需的费用的医疗经济的观点考虑，也不希望误诊。
[0095]
因此，当受检者为没有疾病患病史的人时，基因检查优选特异性高，即，优选真阴性率高，换言之，优选假阳性率低。这样，在受检者为没有疾病患病史的人时，引导为下述(1)和(2)的区分使用是优选形态。
[0096]-受检者为没有疾病患病史的人时-[0097]
(1)当检测对象为发病或恶化与基因的甲基化相关的疾病时，使用dna的甲基化度被测量为低于原值的的可能性高于dna的甲基化度被测量为高于原值的可能性的亚硫酸氢盐试剂。即，使用被评价为不适当转换倾向的亚硫酸氢盐试剂。换言之，将亚硫酸氢盐试剂的转换错误作为甲基化信号降低手段。
[0098]
(2)当检测对象为发病或恶化与基因的非甲基化相关的疾病时，使用dna的甲基化度被测量为高于原值的的可能性高于dna的甲基化度被测量为低于原值的可能性的亚硫酸氢盐试剂。即，使用被评价为不完全转换倾向的亚硫酸氢盐试剂。换言之，将亚硫酸氢盐试剂的转换错误作为甲基化信号扩增手段。
[0099]“有疾病患病史的人”例如是治疗中的患者、从疾病中康复的原患者。对患者或原患者的监测检查或随访检查中应避免漏诊患者。
[0100]
因此，当受检者为有疾病患病史的人时，基因检查优选灵敏度高，即，优选真阳性率高，换言之，优选假阴性率低。这样，在受检者为有疾病患病史的人时，引导为下述(3)和(4)的区分使用是优选形态。
[0101]-受检者为有疾病患病史的人时-[0102]
(3)当检测对象为发病或恶化与基因的甲基化相关的疾病时，使用dna的甲基化度被测量为高于原值的的可能性高于dna的甲基化度被测量为低于原值的可能性的亚硫酸氢盐试剂。即，使用被评价为不完全转换倾向的亚硫酸氢盐试剂。换言之，将亚硫酸氢盐试剂的转换错误作为甲基化信号扩增手段。
[0103]
(4)当检测对象为发病或恶化与基因的非甲基化相关的疾病时，使用dna的甲基化度被测量为低于原值的的可能性高于dna的甲基化度被测量为高于原值的可能性的亚硫酸氢盐试剂。即，使用被评价为不适当转换倾向的亚硫酸氢盐试剂。换言之，将亚硫酸氢盐试剂的转换错误作为甲基化信号降低手段。
[0104]
在本发明的基因检查方法中，用于分析基因的甲基化度的试样即dna可从受检者的活体样品中获得。活体样品例如是组织、血细胞、血液、淋巴液、尿、粪便、唾液、泪液、脑脊液、心包积水、胸水、腹水。
[0105]
活体样品优选根据作为检查对象的疾病的种类来选择。当检查对象为癌症的情况下，作为活体样品，优选血液、尿、粪便、唾液、脑脊液、心包积水、胸水或腹水。已知在血液、尿、粪便、唾液、脑脊液、心包积水、胸水及腹水中存在从癌细胞或肿瘤细胞释放出的ctdna(circulating tumor dna：循环肿瘤dna),是对多种癌症具有通用性的活体样品。作为活体样品，从对受检者的侵袭性低的观点考虑，优选血液、尿、粪便或唾液，从ctdna的浓度比较
高的观点以及可以含有多种癌症的ctdna的观点考虑，优选血液。
[0106]
在本发明中，血液包括血液本身及用生理盐水稀释的血液；在血液中加入葡萄糖、抗血液凝固剂等添加剂的保存血液；它们的分离物(例如，血浆、血清)等。
[0107]
从活体样品提取dna可以是从活体样品中所含有的细胞中提取dna，也可以是提取活体样品中所含有的无细胞dna。
[0108]
基因的甲基化度的分析通过亚硫酸氢盐测序法进行。亚硫酸氢盐测序法中使用根据基因检查对象选择的不适当转换倾向的亚硫酸氢盐试剂或不完全转换倾向的亚硫酸氢盐试剂。
[0109]
实施例
[0110]
以下，通过实施例进一步说明发明的实施方式，但发明的实施方式并不限定于这些实施例。
[0111]
＜实施例1：亚硫酸氢盐试剂的评价＞
[0112]
[准备dna样品1-1]
[0113]
作为dna样品1的实施方式例，合成了具有序列号1的序列的dna。该dna中，从5’末端起第25个、第28个、第38个、第57个、第69个及第74个胞嘧啶为cpg位点，所有的cpg位点均未被甲基化。以下，将该dna称为dna样品1-1。
[0114]
dna样品1-1(序列号1)ttgatggtattgcacagaatatggcggcgatgctgaccggcagtgagcagaactggcgcagcttcacccgttccgtgctgtccatgatgacagaaattc
[0115]
[dna样品1-1的亚硫酸氢盐处理]
[0116]
用作为亚硫酸氢盐试剂的ez dna methylation gold kit(zymo research公司制造)处理了dna样品1-1。
[0117]
亚硫酸氢盐处理根据该产品的推荐方案进行。
[0118]
[dna样品1-1的甲基化度的测量]
[0119]
作为正向引物使用具有序列号2的序列的引物及作为反向引物使用具有序列号3的序列的引物，通过多重pcr，扩增了亚硫酸氢盐处理后的dna样品1-1。多重pcr是使用kod-multi&epi-(toyobo co.,ltd.制造)并按照该产品的说明书来进行的。在pcr软管中分注了25μl的2x pcr buffer for kod-multi&epi-、1μl的kod-multi&epi-、15μl的1μm引物混合物、8.5μl的亚硫酸氢盐处理后的dna、0.5μl的水。pcr如下进行：将94℃/2分钟进行1个循环，将98℃/10秒、58℃/30秒、68℃/15秒这3个步骤进行40个循环。使用ampure xp(beckman coulter inc.制造)纯化扩增反应液，将经纯化的dna回收到40μl的tris-edta缓冲液中。
[0120]
正向引物(序列号2)cgctcttccgatctttgatggtattgtatagaatatgg反向引物(序列号3)cgctcttccgatctaaatttctatcatcataaacaaca
[0121]
使用回收的dna、作为正向引物具有序列号4的序列的引物(fasmac co.,ltd.制造)及作为反向引物具有序列号5的序列的引物(fasmac co.,ltd.制造)，通过index加成pcr扩增了dna。index加成pcr是使用multiplex pcr assay kit(takara bio inc.制造)进行的。使用各1μl的1.25μm引物、0.125μl的multiplex pcr mix1、12.5μl的multiplex pcr mix2、水制备反应液，使最终液量成为25μl。pcr如下进行：将94℃/3分钟进行1个循环，将94℃/45秒、50℃/60秒、72℃/30秒这3个步骤进行5个循环，将94℃/45秒、55℃/60秒、72℃/30秒这3个步骤进行11个循环。
n.v.制造)，也使用dna样品1-1及dna样品2-1进行了与上述相同的工序，获得错误率1＝1.3％且错误率2＝1.2％的结果。
[0144]
错误率2是小于错误率1的值。因此，将该亚硫酸氢盐试剂评价为不完全转换倾向。
[0145]
＜实施例2：癌症的基因检查＞
[0146]
日本40多岁人群的癌症患病率为0.05％左右(每10万人中有50人左右)。据此，在没有癌症患病史的10万名40多岁人群中，推定潜在的癌症患者为50人，并推定99950人未患癌症。
[0147]
[检查对象的选定]
[0148]
将没有癌症患病史的40多岁的10万人作为受检者，实施癌症筛选检查。检查对象的癌症是发病或恶化与基因甲基化相关的癌症。
[0149]
[使用不适当转换倾向的亚硫酸氢盐试剂进行的基因检查]
[0150]
使用作为不适当转换倾向的亚硫酸氢盐试剂的ez dna methylation gold kit(zymo research公司制造)，对检查对象的基因，分析受检者的dna甲基化度。
[0151]
ez dnamethylation gold kit的错误率1为0.5％，错误率2为2.4％。因此，使用ez dnamethylation gold kit进行亚硫酸氢盐测序时，可能成为假阳性499人(99950人
×
0.5％)且假阴性1人(50人
×
2.4％)。
[0152]
[使用不完全转换倾向的亚硫酸氢盐试剂进行的基因检查]
[0153]
使用作为不完全转换倾向的亚硫酸氢盐试剂的epitect plus bisulfite conversion kit(qiagen n.v.制造)，对检查对象的基因，分析受检者的dna甲基化度。
[0154]
epitect plus bisulfite conversion kit的错误率1为1.3％，错误率2为1.2％。因此，使用epitect plus bisulfite conversion kit进行亚硫酸氢盐测序时，可能成为假阳性1299人(99950人
×
1.3％)且假阴性0人(50人
×
1.2％)。
[0155]
以健康者为对象进行的较大规模的一次筛选，优选特异度高，即优选假阳性率低。而且，在发病或恶化与基因的甲基化相关的癌症为检测对象时，关于处理受检者的dna的亚硫酸氢盐试剂，比相比于被评价为不完全转换倾向的亚硫酸氢盐试剂，更优选被评价为不适当转换倾向的亚硫酸氢盐试剂。

技术特征：
1.一种亚硫酸氢盐试剂的评价方法，包括下述(a)～(c)，(a)准备测量对象的cpg位点未被甲基化的dna样品1，用评价对象的亚硫酸氢盐试剂处理所述dna样品1之后，对所述测量对象的cpg位点的甲基化度进行测量，计算错误率1，所述错误率1为所述测量对象的cpg位点的甲基化度的平均值，(b)准备与所述dna样品1为相同的序列且所述测量对象的cpg位点被甲基化的dna样品2，用所述评价对象的亚硫酸氢盐试剂处理所述dna样品2之后，对所述测量对象的cpg位点的甲基化度进行测量，计算错误率2，所述错误率2为100-(所述测量对象的cpg位点的甲基化度的平均值)，(c)比较所述错误率1和所述错误率2，当所述错误率1≤所述错误率2时，将所述评价对象的亚硫酸氢盐试剂评价为不适当转换倾向，当所述错误率1＞所述错误率2时，将所述评价对象的亚硫酸氢盐试剂评价为不完全转换倾向。2.一种基因检查方法，以发病或恶化与基因的甲基化或非甲基化相关的疾病为检测对象，分析所述基因的甲基化度，所述基因检查方法中，受检者为没有所述疾病患病史的人，所述方法包括用亚硫酸氢盐试剂处理所述受检者的dna的步骤，关于所述亚硫酸氢盐试剂，当以发病或恶化与基因的甲基化相关的疾病为检测对象时，其是通过权利要求1所述的亚硫酸氢盐试剂的评价方法被评价为不适当转换倾向的亚硫酸氢盐试剂，当以发病或恶化与基因的非甲基化相关的疾病为检测对象时，其是通过权利要求1所述的亚硫酸氢盐试剂的评价方法被评价为不完全转换倾向的亚硫酸氢盐试剂。3.一种基因检查方法，以发病或恶化与基因的甲基化或非甲基化相关的疾病为检测对象，分析所述基因的甲基化度，所述基因检查方法中，受检者为有所述疾病患病史的人，所述方法包括用亚硫酸氢盐试剂处理所述受检者的dna的步骤，关于所述亚硫酸氢盐试剂，当以发病或恶化与基因的甲基化相关的疾病为检测对象时，其是通过权利要求1所述的亚硫酸氢盐试剂的评价方法被评价为不完全转换倾向的亚硫酸氢盐试剂，当以发病或恶化与基因的非甲基化相关的疾病为检测对象时，其是通过权利要求1所述的亚硫酸氢盐试剂的评价方法被评价为不适合转换倾向的亚硫酸氢盐试剂。4.根据权利要求2或3所述的基因检查方法，其中，根据所述亚硫酸氢盐试剂的评价中的所述错误率1及所述错误率2的值推定检查中的假阳性率及假阴性率。5.根据权利要求2至4中任一项所述的基因检查方法，其中，所述疾病为癌症。

技术总结
本发明提供一种用于根据基因检查对象而区分使用的亚硫酸氢盐试剂的评价方法、及能够根据基因检查对象区分使用亚硫酸氢盐试剂的基因检查方法。亚硫酸氢盐试剂的评价方法中，比较将未被甲基化的CpG位点判别为甲基化状态的错误率1和将被甲基化的CpG位点判别为非甲基化状态的错误率2。基因检查方法中，根据受检者的患病史、及疾病与基因的甲基化或非甲基化的相关性，区分使用亚硫酸氢盐试剂。区分使用亚硫酸氢盐试剂。


技术研发人员：胁田舞子
受保护的技术使用者：富士胶片株式会社
技术研发日：2022.02.18
技术公布日：2023/9/22