基于糖链指示衰老或评估干预衰老处理的应用和方法

1.本技术涉及衰老指示和干预技术领域，具体涉及基于糖链指示衰老或评估干预衰老处理的应用和方法。


背景技术：

2.衰老是一个不可避免的生物过程，也是一个非常复杂的状态。即使在健康的个体中，它也能引起许多改变，如细胞衰老、端粒磨损、干细胞衰竭、蛋白质稳态的丧失等。
3.虽然基因改造和药物干预已经成功地延长了动物的寿命，但它们并不是在人类中应用的最佳选择。热量限制，也称卡路里限制，即在不引起营养不良的前提下减少热量摄入，目前许多研究提示其是最有效的延长寿命的干预方法，可延长多种生物的健康寿命，包括酵母、线虫、啮齿动物和灵长类动物。同时，作为最有效的抗衰老干预措施，热量限制可以延缓或抑制与年龄相关的生物学变化和疾病，包括糖尿病、心血管疾病甚至癌症。许多研究表明，无论是在短期还是长期的热量限制后，热量限制对健康都有积极的影响，可以引起体重减轻和生理标志物的改善。因此，了解热量限制的分子机制将为寻找衰老及衰老相关疾病的生物标志物和干预措施提供新的思路。
4.翻译后修饰对于蛋白质的功能和稳定性至关重要。蛋白质翻译后修饰在衰老过程中发生复杂变化，其中糖基化不受模板编码的控制，而是由糖基转移酶和糖苷酶，以及转运体、核苷酸糖等共同影响。因此糖基化的时空变化更能反映细胞的实时状态。特定细胞或生物体中产生的完整的糖链组合称为糖组。
5.细胞生理环境在衰老和疾病过程中发生复杂变化。早期研究发现，随着年龄的增长，血清n-糖链发生规律性变化，例如，三个n-糖链结构(nga2f，na2fb和na2f)被观察到与年龄相关，并且在男性和女性中都观察到去半乳糖基化糖链的相对丰度随年龄而增加。血浆糖基转移酶水平也显示出与年龄相关的变化。
6.因此，对热量限制过程中全血清糖组的研究可以为探究糖基化在衰老中发挥的作用机制提供重要的基础数据。从有效的抗衰老干预措施热量限制和与衰老密切相关的糖基化角度出发，开发出可用于指示衰老的生物标志物对评估机体衰老和健康状态有重要意义。
7.然而，本领域尚未出现一种如何基于糖基化来成功指示衰老或评估干预衰老处理的应用和方法。
8.本领域仍然需要寻找一种基于糖基化来指示衰老或评估干预衰老处理的应用和方法，其能够准确、快速、低成本地指示衰老情况或评估干预衰老处理的效果，为后续的医疗诊断和治疗应用提供高价值信息。


技术实现要素：

9.为解决上述技术问题，本技术的一个方面提供了糖链混合物在制备指示衰老或评估干预衰老处理的产品中的应用。
10.本技术的另一个方面提供了一种评估对象中干预衰老处理的方法，所述方法包括：
11.(i)提供所述对象在接受所述干预衰老处理后的样品；
12.(ii)从所述样品中的糖复合物中释放样品糖链；
13.(iii)提供与所述样品糖链对应的仿生糖链；
14.(iv)对所述仿生糖链和所述样品糖链进行唾液酸衍生化；
15.(v)对所述唾液酸衍生化的样品糖链和仿生糖链进行纯化；
16.(vi)将纯化的样品糖链和仿生糖链混合，形成糖链混合物；
17.(vii)对所述糖链混合物进行质量分析，以获得质量分析数据；和
18.(viii)将所述干预衰老处理后的质量分析数据与对照数据进行比较，从而评估所述干预衰老处理。
19.本技术的又一个方面提供了用于糖链混合物在制备指示衰老或评估干预衰老处理的产品中的应用或评估对象中干预衰老处理的方法或确定对象的样品中总糖链水平和/或乙酰化糖链水平中的试剂和/或设备在制备指示衰老或评估干预衰老处理的产品中的应用，其中，所述方法包括：
20.(i)提供所述对象在接受所述干预衰老处理后的样品；
21.(ii)从所述样品中的糖复合物中释放样品糖链；
22.(iii)提供与所述样品糖链对应的仿生糖链；
23.(iv)对所述仿生糖链和所述样品糖链进行唾液酸衍生化；
24.(v)对所述唾液酸衍生化的样品糖链和仿生糖链进行纯化；
25.(vi)将纯化的样品糖链和仿生糖链混合，形成糖链混合物；
26.(vii)对所述糖链混合物进行质量分析，以获得质量分析数据；和
27.(viii)将所述干预衰老处理后的质量分析数据与对照数据进行比较，从而评估所述干预衰老处理。
附图说明
28.下面结合附图更详细地说明本技术，附图中：
29.图1是基于仿生糖内标法的血清n-糖组代表性maldi-tof-ms质谱图；
30.图2是al组和cr组小鼠7个时间点血清糖基化水平变化的热图；
31.图3是al组和cr组派生糖型的相对丰度的示意图；
32.图4是al组与cr组唾液酸糖链派生性状和o-乙酰化唾液酸糖链的相对丰度的示意图。
33.图5是al组与cr组中不同性别小鼠派生糖差异的示意图。
具体实施方式
34.本技术涉及糖链混合物在制备指示衰老或评估干预衰老处理的产品中的应用。在本技术的一个实施方式中，干预衰老处理包括热量控制。在本技术的一个实施方式中，糖链混合物包括未修饰糖链(样品糖链)和与所述未修饰糖链对应的仿生糖链。
35.在本技术的一个实施方式中，所述糖链混合物通过以下制备：(i)从样品中的糖复
合物中释放样品糖链；(ii)提供与所述样品糖链对应的仿生糖链；(iii)对所述仿生糖链和所述样品糖链进行唾液酸衍生化；(iv)对所述唾液酸衍生化的样品糖链和仿生糖链进行纯化；和(v)将纯化的样品糖链和仿生糖链混合，形成糖链混合物。在本技术的一个实施方式中，样品糖链是未修饰的。在本技术的一个实施方式中，样品糖链包括n-糖链。在本技术的一个实施方式中，样品选自：体液样品，如血液、血清、血浆、尿液、唾液、淋巴液、脊髓液、腹水、羊水，细胞样品，如分离自组织的细胞样品、体外培养的细胞样品，组织样品，如新鲜组织样品、固定化组织样品，或其组合。在本技术的一个实施方式中，糖复合物选自：糖蛋白、蛋白聚糖、糖肽、糖脂、或其组合。在本技术的一个实施方式中，释放样品糖链包括：酶法，如采用pngase f、内切糖苷酶h、f2、f3、神经酰胺糖内切酶ii，化学法，如β消除反应，和/或其组合。在本技术的一个实施方式中，纯化包括离心、沉淀分离、过滤、色谱分离和/或其组合。
36.在本技术的一个实施方式中，仿生糖链通过对所述样品糖链的仿生处理得到。在本技术的一个实施方式中，仿生处理包括同位素标记。在本技术的一个实施方式中，同位素标记包括针对样品糖链的还原反应，例如采用硼氘化钠进行还原，使得样品糖链的还原端半缩醛结构转变为醇羟基并包含同位素标记，例如，氘代。在本技术的一个实施方式中，与其对应的未修饰样品糖链相比，所述仿生糖链包括位于糖链还原端的醇羟基以及同位素标记，且所述仿生糖链的分子量增加了3道尔顿或以上。在本技术的一个实施方式中，仿生糖链具有与其对应的未修饰样品糖链相同的糖链组成和丰度。在本技术的一个实施方式中，未修饰样品糖链的还原端为半缩醛基。在本技术的一个实施方式中，醇羟基以及同位素标记为未修饰样品糖链的还原端经还原反应开环产生。在本技术的一个实施方式中，未修饰样品糖链和所述仿生糖链的还原端分别如式(i)和式(i
′
)所示，其中代表与糖链其他部分连接的键，d代表氘代：
[0037][0038]
本技术还涉及一种评估对象中干预衰老处理的方法，所述方法包括：(i)提供所述对象在接受所述干预衰老处理后的样品；(ii)从所述样品中的糖复合物中释放样品糖链；(iii)提供与所述样品糖链对应的仿生糖链；(iv)对所述仿生糖链和所述样品糖链进行唾液酸衍生化；(v)对所述唾液酸衍生化的样品糖链和仿生糖链进行纯化；(vi)将纯化的样品糖链和仿生糖链混合，形成糖链混合物；(vii)对所述糖链混合物进行质量分析，以获得质量分析数据；和(viii)将所述干预衰老处理后的质量分析数据与对照数据进行比较，从而评估所述干预衰老处理。
[0039]
在本技术的一个实施方式中，对象包括哺乳动物。在本技术的一个实施方式中，对象包括人。在本技术的一个实施方式中，干预衰老处理包括热量控制。在本技术的一个实施方式中，样品糖链包括n-糖链。在本技术的一个实施方式中，样品选自：体液样品，如血液、血清、血浆、尿液、唾液、淋巴液、脊髓液、腹水、羊水，细胞样品，如分离自组织的细胞样品、体外培养的细胞样品，组织样品，如新鲜组织样品、固定化组织样品，或其组合。在本技术的
一个实施方式中，糖复合物选自：糖蛋白、蛋白聚糖、糖肽、糖脂、或其组合。在本技术的一个实施方式中，释放样品糖链包括：酶法，如采用pngase f、内切糖苷酶h、f2、f3、神经酰胺糖内切酶ii，化学法，如β消除反应，和/或其组合。在本技术的一个实施方式中，唾液酸衍生化包括用衍生化试剂处理糖链。在本技术的一个实施方式中，衍生化试剂包括hobt和edc。在本技术的一个实施方式中，唾液酸衍生化包括在30-45℃，优选约37℃下反应20-200min，优选约60min。在本技术的一个实施方式中，纯化包括离心、沉淀分离、过滤、色谱分离和/或其组合。
[0040]
在本技术的一个实施方式中，比较通过计算软件和/或算法获得。在本技术的一个实施方式中，质量分析包括采用质谱分析，如基质辅助激光解吸附电离-四级离子阱-飞行时间质谱(maldi-qit-tof ms)进行分析。在本技术的一个实施方式中，质量分析包括定量，例如通过比较质谱中成对峰信号的峰面积，比较未经同位素标记的糖链的峰面积(如质谱峰面积)和经同位素标记的糖链的峰面积(如质谱峰面积)，进行相对定量。
[0041]
在本技术的一个实施方式中，仿生糖链通过对所述样品糖链的仿生处理得到。在本技术的一个实施方式中，仿生处理包括同位素标记。在本技术的一个实施方式中，同位素标记包括针对样品糖链的还原反应，例如采用硼氘化钠进行还原，使得样品糖链的还原端半缩醛结构转变为醇羟基并包含同位素标记，例如，氘代。在本技术的一个实施方式中，与其对应的未修饰样品糖链相比，所述仿生糖链包括位于糖链还原端的醇羟基以及同位素标记，且所述仿生糖链的分子量增加了3道尔顿或以上。在本技术的一个实施方式中，仿生糖链具有与其对应的未修饰样品糖链相同的糖链组成和丰度。在本技术的一个实施方式中，未修饰样品糖链的还原端为半缩醛基。在本技术的一个实施方式中，醇羟基以及同位素标记为未修饰样品糖链的还原端经还原反应开环产生。
[0042]
在本技术的一个实施方式中，质量分析数据包括总糖链水平和/或乙酰化糖链水平。在本技术的一个实施方式中，当所述干预衰老处理后的总糖链水平低于对照数据时，所述干预衰老处理有效。在本技术的一个实施方式中，当所述干预衰老处理后的乙酰化糖链水平高于对照数据时，所述干预衰老处理有效。在本技术的一个实施方式中，当所述干预衰老处理后的总糖链水平低于对照数据且乙酰化糖链水平高于对照数据时，所述干预衰老处理有效。在本技术的一个实施方式中，总糖链水平包括以下糖链的水平：去岩藻糖基化糖链、半乳糖基化糖链和唾液酸化糖链。在本技术的一个实施方式中，唾液酸化糖链包括α2，3-连接和α2,6-连接的唾液酸化糖链。在本技术的一个实施方式中，乙酰化糖链包括乙酰化的唾液酸糖链。在本技术的一个实施方式中，乙酰化的唾液酸糖链包括o-乙酰化的唾液酸糖链。在本技术的一个实施方式中，总糖链水平包括选自以下糖链中一个或多个的水平的总和：h5n2、h6n2、h4n3f1、h3n3ge1、h3n4f1、h4n4、h7n2、h4n3gl1、h4n3ge1、h4n4f1、h5n4、h8n2、h5n3gl1、h4n4gl1、h5n3ge1、h5n4f1、h4n4ge1、h9n2、h6n3gl1、h5n4gl1、h6n3ge1、h4n4f1ge1、h5n4ge1、h5n4f1gl1、h5n4f1ge1、h5n4gl2、h5n4e1gl1/h5n4l1ge1、h5n4ge1gl1、h6n5gl1、h5n4ge1gl1ac1、h5n4ge2、h6n5ge1、h5n4ge2ac1、h4n4ge1g12、h5n4ge2ac2、h5n4f1ge1gl1、h5n4f1ge2、h5n4ge1gl2、h5n4l1ge2、h5n4ge2gl1、h6n5ge1gl1、h6n5gl3、h6n5ge1gl2、h6n5ge1gl2ac1和h6n5ge2gl1，其中h代表己糖，n代表己糖胺，f代表岩藻糖，ge代表乙基酯化n-羟乙酰神经氨酸(α2,6-连接)，g1代表内酯化n-羟乙酰神经氨酸(α2,3-连接)，e代表乙基酯化n-乙酰神经氨酸(α2,6-连接)，l代表内酯化n-乙酰神经氨酸(α2,3-连
接)，geac/g1ac蛋白具有o-乙酰化修饰的n-羟乙酰神经氨酸。在本技术的一个实施方式中，总糖链水平包括选自以下糖链中一个或多个的水平的总和：h5n2、h6n2、h4n3f1、h3n3ge1、h3n4f1、h4n4、h7n2、h4n3gl1、h4n3ge1、h4n4f1、h5n4、h8n2、h5n3gl1、h4n4gl1、h5n3ge1、h5n4f1、h4n4ge1、h9n2、h6n3gl1、h5n4gl1、h6n3ge1、h4n4f1ge1、h5n4ge1、h5n4f1gl1、h5n4f1ge1、h5n4gl2、h5n4e1gl1/h5n4l1ge1、h5n4ge1gl1、h6n5gl1、h5n4ge1gl1ac1、h5n4ge2、h6n5ge1、h4n4ge1g12、h5n4ge1gl2、h5n4l1ge2、h5n4ge2gl1、h6n5ge1gl1、h6n5gl3、h6n5ge1gl2、h6n5ge1g12ac1和h6n5ge2gl1，其中h代表己糖，n代表己糖胺，f代表岩藻糖，ge代表乙基酯化n-羟乙酰神经氨酸(α2,6-连接)，gl代表内酯化n-羟乙酰神经氨酸(α2,3-连接)，e代表乙基酯化n-乙酰神经氨酸(α2,6-连接)，l代表内酯化n-乙酰神经氨酸(α2,3-连接)，geac/glac蛋白具有o-乙酰化修饰的n-羟乙酰神经氨酸。在本技术的一个实施方式中，乙酰化糖链包括选自以下糖链中的一个或多个：h5n4ge1gl1ac1、h6n5ge1gl2ac1、h5n4ge2ac2和h5n4ge2ac1。在本技术的一个实施方式中，乙酰化糖链包括选自以下糖链中的一个或多个：h5n4ge2ac2和h5n4ge2ac1。
[0043]
在本技术的一个实施方式中，质量分析数据包括派生的糖基化特征。在本技术的一个实施方式中，派生的糖基化特征包括以下糖链中一个或多个的水平：高甘露糖型、杂合型和复杂型。在本技术的一个实施方式中，派生的糖基化特征包括含有不同天线数(例如，1、2或3)的糖链的水平。在本技术的一个实施方式中，质量分析数据包括每天线以下糖链中一个或多个的水平：neugc和neuac。在本技术的一个实施方式中，质量分析数据包括每天线以下糖链中一个或多个的水平：α2,3-连接的neuac、α2,3-连接的neugc、α2,6-连接的neuac和α2,6-连接的neugc。在本技术的一个实施方式中，质量分析数据包括分支型唾液酸的水平。在本技术的一个实施方式中，质量分析数据包括乙酰化唾液酸的水平。在本技术的一个实施方式中，质量分析数据包括o-乙酰化唾液酸的水平。在本技术的一个实施方式中，当所述干预衰老处理后的高甘露糖型、杂合型和/或复杂型糖链的水平低于对照数据时，所述干预衰老处理有效。在本技术的一个实施方式中，当所述干预衰老处理后的含有不同天线数的糖链的水平低于对照数据时，所述干预衰老处理有效。在本技术的一个实施方式中，当所述干预衰老处理后的每天线neugc和/或neuac的水平低于对照数据时，所述干预衰老处理有效。在本技术的一个实施方式中，当所述干预衰老处理后的每天线α2,3-连接的neuac、α2，3-连接的neugc、α2,6-连接的neuac和/或α2,6-连接的neugc的水平低于对照数据时，所述干预衰老处理有效。在本技术的一个实施方式中，当所述干预衰老处理后的分支型唾液酸的水平低于对照数据时，所述干预衰老处理有效。在本技术的一个实施方式中，当所述干预衰老处理后的乙酰化唾液酸的水平高于对照数据时，所述干预衰老处理有效。在本技术的一个实施方式中，当所述干预衰老处理后的o-乙酰化唾液酸的水平高于对照数据时，所述干预衰老处理有效。
[0044]
在本技术的一个实施方式中，对照数据包括所述对象在接受所述干预衰老处理前的样品经过所述步骤(ii)-(vii)处理所得的质量分析数据。在本技术的一个实施方式中，对照数据包括未经过干预衰老处理的同种异体对象的样品经过所述步骤(ii)-(vii)处理所得的质量分析数据。在本技术的一个实施方式中，对照数据包括阈值，该阈值可由本领域技术人员直接确定，例如同种异体健康对照对象样品的平均值。
[0045]
本技术还涉及用于前述应用中的试剂和/或设备在制备指示衰老或评估干预衰老
处理的产品中的应用。
[0046]
本技术还涉及用于前述方法中的试剂和/或设备在制备指示衰老或评估干预衰老处理的产品中的应用。
[0047]
本技术还涉及确定对象的样品中总糖链水平和/或乙酰化糖链水平中的试剂和/或设备在制备指示衰老或评估干预衰老处理的产品中的应用。
[0048]
本技术的产品可包括试剂盒。本技术的产品可包含：用于检测如上所述糖链中一种或多种的水平的物质(例如试剂和/或设备)。
[0049]
本文中提供的所有数值范围旨在清楚地包括落在范围端点之间的所有数值及它们之间的数值范围。可对本发明提到的特征或实施例提到的特征进行组合。本说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
[0050]
如本文所用，“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由......构成”、“基本上由......构成”、和“由......构成”；“主要由......构成”、“基本上由......构成”和“由......构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。
[0051]
如本文所用，术语“糖组”是指样品(如细胞、组织)中表达的全部糖链或是某一类特定糖蛋白上的全部糖链。
[0052]
如本文所用，术语“样品糖链”、“待测样品糖链”、“未修饰糖链”和“未经同位素标记的糖链”可互换使用，均是指需要对其中糖链进行分析的样品中所存在的糖链，其可通过糖链释放(如酶解、化学释放)、纯化、富集、衍生化等步骤进行处理以备用于质量分析，但无需经过同位素化标记。
[0053]
如本文所用，“内标糖(链)”、“仿生糖(链)”、“经修饰糖链”、“同位素标记还原糖(链)”与“同位素标记仿生糖(链)”可互换使用，是指经过本文所述同位素标记还原的糖链标准品，或者相对于“样品糖链”而言，来自同一样品或同一物种来源并经过相同处理而区别仅在于经同位素还原标记步骤的糖链物质。
[0054]
通常就后者而言，内标糖链由待测样品制得，是一糖链混合物，其可以作为一个内标糖链库。在定量分析时，样品中的每一个糖链都有与之对应的内标，定量更为准确，更有利于大样本的分析。并且，仿生糖(组)与未修饰糖(组)具有相同的糖链结构和相似的糖链丰度分布，有利于对样品糖链的准确分析。
[0055]
本文所述的糖链可为n-糖链，也可为o-糖链，优选为n-糖链。本文所述的糖链可为游离糖链或从糖复合物中释放的糖链。
[0056]
如本文所用，术语“糖链还原端”是指糖链具有游离半缩醛羟基的一端。在一些实施方式中，糖链还原末端可为半缩醛。
[0057]
如本文所述，在一个实施方式中，仅对内标糖链进行同位素标记以使其分子量高于未标记的样品糖链，该分子量差异可至少为3da，例如3da、4da、5da等。在一些实施方式中，对于n-糖链，可采用氘化合物标记内标糖链末端，以获得例如2d标记的羟基，从而使所得同位素标记的内标糖链的分子量比未标记的样品糖链增加3da。在另一些实施方式中，对于o-糖链，可在β消除时利用nabd4作为还原试剂并以h
218
o作为溶剂，从而使所得同位素标记的内标糖链的分子量比未标记的样品糖链增加3da。
[0058]
可任选地对糖链进行衍生化，以例如提高质谱检测的灵敏度或保护糖链末端基团。衍生化可包括但不限于：甲胺化、酯化、甲基化、乙酰化、还原氨化等。可根据需要对衍生化的类型和时机进行选择。例如，通常酯化衍生在同位素标记后进行。
[0059]
在对糖链进行任何处理后，可采用本领域已知技术对其进行纯化和/或富集。例如可在糖链释放后、对内标糖链进行同位素标记后和/或对糖链进行衍生化后，对其进行纯化和/或富集。纯化和/或富集的方法可包括但不限于：离心、过滤、吸附、色谱法等。
[0060]
在获得经同位素标记的内标糖链和经相同处理但未经同位素标记的样品糖链后，可将两者按所需比例混合，用于质量分析。
[0061]
本文方法中对糖链混合物的质量分析可采用适合的方式进行，这些方式包括但不限于：质谱(ms)分析，例如基质辅助激光解吸附电离质谱(maldi ms，如基质辅助激光解吸附电离-飞行时间质谱(maldi-tof-ms)、基质辅助激光解吸附电离-四级离子阱-飞行时间质谱(maldi-qit-tof ms))、电喷雾质谱(esi-ms)、快原子轰击质谱(fab-ms)、串级质谱、多级质谱、电喷雾-碰撞诱导解离质谱(esi-cid-ms)；高效液相色谱hplc；液质联用(lc-ms)；毛细管电泳-质谱联用(ce-ms)。优选采用对分子量差异辨识度高的技术进行质量分析，例如基质辅助激光解吸附电离质谱(maldi ms)等。
[0062]
可对质量分析数据进行进一步计算和处理以获得所需的糖组相关信息。例如，可对样品糖链和内标糖链在质谱图中的出峰位置、峰高、峰面积及其任何组合进行比较，例如比较成对峰信号的峰面积、样品糖链峰面积/内标糖链峰面积(轻/重)的比值，以获得糖链的定性和/或定量信息。也可将采用本文方法所得质量分析数据与其他糖链分析技术所得数据结合起来进行分析。
[0063]
在质谱分析中，由于内标糖链和样品糖链之间存在分子量差异，通过质谱分析可表现出特定的荷质比差、可区分的ms峰和峰面积比值。这些数据可直接用于相对丰度比较或定性分析，推断目标糖链的分子结构；也可用于监控目标糖链丰度的变化；或用于检测带目标糖链的物质的存在、含量及其动态变化。
[0064]
可采用各种糖链分析软件、应用、数据库、算法等对所得数据进行分析。可用的糖链分析软件包括但不限于：progenesis maldi、glycoworkbench、netnglyc、findmod、glycanmass、glycomod、glycofragment和glycosearchms等。可用的糖链数据库包括但不限于：glycomedb、eurocarbdb、carbbank、ccsd等。
[0065]
下面将结合附图对本技术的技术方案进行清楚、完整的表述，显然，所描述的实施例是本技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例都属于本技术保护的范围。
[0066]
实施例
[0067]
实验材料
[0068]
在以下实施例中，如无特别说明，实施例中采用的仪器/试剂均为市售产品。
[0069]
仪器/试剂列表：
[0070]
[0071][0072]
实施例1.热量限制小鼠血清n-糖组的特征研究1.材料与方法
[0073]
1.1小鼠饲养和处理
[0074]
120只8周龄c57bl/6小鼠购自上海捷思捷实验动物有限公司，其中雌雄小鼠各60只。所有动物实验均符合复旦大学动物实验伦理委员会的要求，并通过审批。采用北京科奥协力饲料有限公司生产的普通商业饲料(蛋白质24.02％，脂肪12.95％，碳水化合物63.03％，3.44kcal/g)饲养。环境维持在(23
±
2)℃，12h光暗循环，开灯时间为每天早上6:00。
[0075]
饮食干预前，连续2周每天同一时间称量食物，以消耗食量的平均值作为正常摄入量。在小鼠3月龄开始干预，将动物随机分为两组，自由进食(al)组(雌雄各30只)和热量限
制(cr)组(雌雄各30只)。al组5只小鼠同笼饲养，cr组小鼠单只饲养，防止限食中的食物竞争。cr小鼠熄灯后2h喂食，将食物置于笼内垫料上，每天1次。al组在料斗内喂养。cr组小鼠每周减少10％的热量摄入，直到三周后稳定进行30％的热量限制，而al组小鼠自由正常饮食。所有小鼠均可自由饮水。所有小鼠每两周称重一次。
[0076]
1.2血清样品收集
[0077]
在不处死小鼠的前提下，采用毛细管法从小鼠眼眶取血。在15周、19周、23周、27周、31周、35周、60周的14:30-16:00之间采集血清样本。样品在3小时静置后以3000rpm离心10分钟。分离血清并在-80℃保存。血清标本避免3次以上冻融。
[0078]
1.3n-糖链的释放
[0079]
1)取5μl的小鼠血清于96孔板中，加入10μl的2％的sds，在60℃下孵育10分钟，使蛋白变性。
[0080]
2)反应完后冷却至室温，加入与血清等体积的5
×
的磷酸盐缓冲液和4％的np-40，最后加入1μl 10倍稀释的糖苷酶f，混合均匀，37℃孵育过夜。
[0081]
1.4仿生糖内标的制备
[0082]
1)随机选取部分小鼠血清制成混合血清。加入两倍体积的2％sds，在60℃下变性10分钟。冷却后加入与血清等体积的5
×
的磷酸盐缓冲液和4％的np-40，最后加入1μl 10倍稀释的糖苷酶f，混合均匀，37℃孵育过夜。
[0083]
2)取混合血清的酶解产物100μl，用两倍体积的冰乙醇沉淀血清蛋白，置于-20℃沉淀15min。
[0084]
3)取出后在13,000g下离心15min。将上清液转移至新的离心管中。向溶液中加入甲酸，使其总占比达到1％，混合后在37℃孵育2h。
[0085]
4)加入一半体积的2m nabd4溶液进行内标的还原同位素标记，在60℃下反应2h。
[0086]
5)将具有亲水作用的sepharose凝珠加入96孔pvdf膜板中，依次使用20％的乙醇，纯水和95％的乙腈进行洗涤，通过正压装置去除流出液，使sepharose凝珠达到平衡状态。
[0087]
6)样品标记完成恢复至室温后，加入等体积的乙腈，转入填有sepharose凝珠的孔内，孵育15min。通过正压装置弃去流出液。
[0088]
7)用200μl 95％acn和含有1％tfa的95％acn洗涤，去除杂质。
[0089]
8)最后用mq(通过纯水仪制备)洗脱，真空离心浓缩，干燥，-80℃保存。
[0090]
1.5唾液酸衍生化
[0091]
1)内标加10μl的水重溶。取2μl的内标和样本酶解产物分别于96孔板内，加入20μl新鲜配制的衍生化试剂(含有250mm hobt和250mm edc的etoh溶液)，避免摇晃，于37℃反应60min。
[0092]
2)取出的样品冷却后，加入等体积的纯乙腈，在-20℃沉淀蛋白15min。去掉蛋白，取上清液待用。
[0093]
1.6 n-糖链纯化
[0094]
1)糖链具有亲水性可以通过亲水作用色谱法(hilic)进行纯化。将脱脂棉线填在吸头中制成hilic-spe小柱，利用棉线的亲水性结合n-糖链达到纯化的目的。
[0095]
2)将mq和85％的acn添加至加样槽中，用移液器将hilic-spe吸头在mq和85％的acn中洗涤3次，对hilic-spe小柱进行活化。
[0096]
3)用hilic-spe吸头反复吸取样品溶液上样。
[0097]
4)上样后的hilic-spe吸头依次在在含有1％tfa的85％acn和85％acn中洗涤3次，去除棉线表面杂质。
[0098]
5)利用10μl mq使糖链充分洗脱。纯化得到的样品和内标以2∶3的体积比混合。
[0099]
1.7 maldi-tof-ms分析
[0100]
1)取内标和样品的混合溶液1μl点在布鲁克飞行时间质谱仪配套的mtp 384target plate polished靶板上，每个样品进行三次技术重复，放置至自然风干。
[0101]
2)向风干的样品孔上滴加1μl的基质溶液(新制5mg/ml super-dhb，溶于含有1mm naoh的50％acn溶液中)，待液滴自然干燥。
[0102]
3)样品孔干燥后，将靶板放入质谱仪进行maldi-tof-ms分析。肽段标准品bruker peptide calibration standard ii用于仪器使用前的校准。仪器检测的m/z比值范围为700-3500da。激光发射次数设置为10000次，采用随机行走模式，以1000hz频率进行扫描，每光栅斑进行100次扫描。激光电压设置为68v。采用串联质谱技术(maldi-tof-ms/ms)鉴定糖链结构，使用glycoworkbench 2.1版(https://code.google.com/p/glycoworkbench/)进行串级谱图解析。
[0103]
1.8数据处理和统计分析
[0104]
1)使用flexanalysis(bruker daltonics)软件进行质谱分析。通过已知的糖链m/z比值1647.587(h4n4f1)、1836.650(h4n4ge1)、2479.883(h5n4f1ge2)、1998.703(h5n4gel)、2287.778(h5n4ge1gl1)、2333.826(h5n4ge2)、2622.900(h5n4ge2gl1)对采集到的质谱峰进行内部校准，减少样品批次间的质量漂移。
[0105]
2)将flexanalysis软件处理后的数据导入商业biopharma compass软件(bruker daltonics)，提取各n-糖链的信号强度。对每对目标峰的相对信号强度(轻/重峰信号强度比)进行定量，并将3次重复的平均信号强度纳入定量分析。
[0106]
3)我们计算了18个派生的糖基化特征。所用公式见表1。为了排除异常值的影响，我们去掉了大于q3+(1.5)
×
iqr或小于q1-(1.5)
×
iqr的异常值，其中iqr＝q3-q1(q1为25％分位数，q3为75％分位数)。
[0107]
表1.派生糖基化特征的计算公式
[0108]
[0109]
[0110][0111]
结构缩写：h，己糖；n，己糖胺；f，岩藻糖；ge，乙基酯化n-羟乙酰神经氨酸(α2,6-连接)；gl，内酯化n-羟乙酰神经氨酸(α2,3-连接)；e，乙基酯化n-乙酰神经氨酸(α2,6-连接)；l，内酯化n-乙酰神经氨酸(α2,3-连接)；geac/glac，具有o-乙酰化修饰的n-羟乙酰神经氨酸。
[0112]
4)采用ibm spss statistics 20进行统计分析。graphpad prism7.0软件和r 4.1.0用于图表绘制。采用非配对t检验比较两组间糖链的差异。
[0113]
2.实验结果
[0114]
为了更准确地定量血清蛋白的n-糖链，我们利用还原同位素标记的仿生糖内标技术，为每个糖链均引入了相差3da的内标，实现全血清蛋白糖基化定量分析。内标和样品经衍生化和纯化后混合进行maldi-tof-ms检测。代表性图谱和用于定量的糖链列表分别如图1和表2所示。
[0115]
[0116]
[0117][0118]
表2.用于定量的n-糖链列表
[0119]
如图2所示，热图中描述了热量限制后血清n-糖链在热量限制过程中的变化。与岩藻糖基化的n-糖链相比，去岩藻糖基化的糖链在小鼠血清中种类更丰富。此外，本研究通过衍生化，在保护唾液酸结构的同时，还可以区分α2，3和α2，6连接方式的唾液酸。同时我们检测到含有o-乙酰化修饰的唾液酸化糖链。如表3所示，在我们鉴定出的绝大多数n-糖链中，热量限制组在各时间点均呈显著且稳定的低水平。除了对单个糖链结构的丰度进行分析，我们还进一步评估了派生的糖基化特征(图3)。我们发现，热量限制组中三种类型的糖链(高甘露糖型、杂合型和复杂型)的丰度明显降低，含有不同天线数的糖链也均有所减少。对于基于单糖成分的派生糖基化特征，我们发现热量限制组平均每天线的半乳糖化和唾液酸化也显示出较低水平，去岩藻糖基化糖链含量降低，但岩藻糖基化糖链受到的影响较小。
[0120]
[0121]
[0122][0123]
表3.热量限制处理后n-糖链的表达情况
[0124]
我们采用的衍生化方法，可以使α2,3连接的唾液酸形成内酯，而α2,6连接的唾液酸形成乙酯，从而根据质荷比的差异区分不同连接的唾液酸糖链。如图4所示，在热量限制后，neu5gc作为小鼠血清唾液酸的主要形式，在两种连接类型中出现稳定地降低。同时，以neu5ac形式存在的少量唾液酸糖链在小鼠血清中也均出现明显下降。含有分支型唾液酸的派生糖表现出同样的变化。我们同时鉴定得到了具有o-乙酰化修饰的唾液酸糖链。o-乙酰化发生在唾液酸骨架的c-4、c-7、c-8和c-9羟基上，可同时修饰多个位置。这类常见的唾液酸修饰已在多种生物中被鉴定出来，在生物过程中发挥着重要作用。我们评估了cr对o-乙酰化修饰唾液酸的影响，我们惊讶地发现，o-乙酰化唾液酸在cr组显著升高。值得一提的是，据报道，o-乙酰化修饰对于唾液酸的识别具有掩蔽作用。
[0125]
图2中n-糖链在每个时间点的均值经过log10转换。“group”代表分组，al组代表自由进食组，cr组代表热量限制组。“s”代表唾液酸化糖链，“asialylation”代表非唾液酸化糖链，“sialylation”代表唾液酸化糖链；“f”代表岩藻糖基化糖链，“afocusylation”代表去岩藻糖基化糖链，“focusylation”代表岩藻糖基化糖链。
[0126]
结构缩写：h，己糖；n，己糖胺；f，岩藻糖；ge，乙基酯化n-羟乙酰神经氨酸(α2,6-连接)；gl，内酯化n-羟乙酰神经氨酸(α2,3-连接)；e，乙基酯化n-乙酰神经氨酸(α2,6-连接)；l，内酯化n-乙酰神经氨酸(α2,3-连接)；geac/glac，具有o-乙酰化修饰的n-羟乙酰神经氨酸。
[0127]
图3中(a)根据单糖类别，分为四类糖链包括岩藻糖基化糖链、去岩藻糖基化糖链、半乳糖基化糖链(每天线)和唾液酸化糖链(每天线)；(b)在结构上，派生特征包括杂合型糖链、高甘露糖型糖链和复杂型糖链；(c)通过天线数目区分单天线、双天线和三天线糖链。p＜0.05为被认为是显著差异。
[0128]
图4中(a)基于连接方式和唾液酸类型，划分出8个唾液酸化派生性状。其中分支型唾液酸(branching sialic acids)是指同一天线上具有两个唾液酸的糖链；(b)cr过程中四种o-乙酰化唾液酸糖链的变化。
[0129]
我们进一步研究了性别是否会对派生糖链性状产生影响(图5，al-m和cr-m：al，cr组雄性小鼠；al-f和cr-f：al，cr组雌性小鼠。其中*代表p＜0.05；**代表p＜0.01；***代表p＜0.001；****代表p＜0.0001)。我们发现，对于在不同性别中的差异，雌性小鼠的岩藻糖水平高于雄性小鼠，雄性小鼠中含有较高水平的去岩藻糖基化糖链。cr处理后，雌雄小鼠岩藻糖基化糖链水平呈现相反的变化趋势，在雌性中下降明显，而在雄性中上升。这提示由于岩藻糖基化糖链水平存在巨大的性别差异，其受到饮食限制而产生的变化可能因性别存在不同的调节。相反，在其他派生糖特征中并没有观察到性别差异，cr处理后表现出一致的明显下降。
[0130]
3.结果讨论
[0131]
以上结果表明在热量限制过程中，血清总n-糖基化水平稳定下降。与之前使用的基于dna测序仪的荧光糖电泳(dsa-face)技术对cr小鼠血清的去唾液酸化n-糖链研究相比，我们的方法可对血清中n-糖链的含量进行相对定量，且不会丢失唾液酸信息。而且我们能够区分不同连接方式的唾液酸糖链，并且发现不同连接的唾液酸派生糖均降低。表明唾液酸合成可能受到阻碍，低水平的唾液酸可能与维持健康状态有关。o-乙酰化的唾液酸糖链却出现了增加，但乙酰化基团作为一种掩蔽剂，会创建空间位阻影响唾液酸蛋白与其他分子(如受体等)的相互作用。因此，血清中乙酰化唾液酸的升高可能会阻碍唾液酸糖链的正常功能，与唾液酸减少的作用相一致。
[0132]
综上所述，我们观察到血清n-糖组的普遍降低，从糖基化角度上为热量限制的机制研究提供了分子基础。我们的发现为监测和干预衰老以及年龄相关疾病提供了潜在的生物靶点，有望成为指示衰老和健康状态的生物标记物。
[0133]
以上仅是本技术的具体应用范例，对本技术的保护范围不构成任何限制。对于所述领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以列举说明。凡采用等同变换或者等效替换而形成的类似此种的技术方案，均落在本技术权利保护范围之内。

技术特征：
1.糖链混合物在制备指示衰老或评估干预衰老处理的产品中的应用，优选地，所述干预衰老处理包括热量控制。2.如权利要求1所述的应用，其中所述糖链混合物通过以下制备：(i)从样品中的糖复合物中释放样品糖链；(ii)提供与所述样品糖链对应的仿生糖链；(iii)对所述仿生糖链和所述样品糖链进行唾液酸衍生化；(iv)对所述唾液酸衍生化的样品糖链和仿生糖链进行纯化；和(v)将纯化的样品糖链和仿生糖链混合，形成糖链混合物，优选地，所述样品糖链包括n-糖链；优选地，所述样品选自：体液样品，如血液、血清、血浆、尿液、唾液、淋巴液、脊髓液、腹水、羊水，细胞样品，如分离自组织的细胞样品、体外培养的细胞样品，组织样品，如新鲜组织样品、固定化组织样品，或其组合；优选地，所述糖复合物选自：糖蛋白、蛋白聚糖、糖肽、糖脂、或其组合；优选地，所述释放样品糖链包括：酶法，如采用pngase f、内切糖苷酶h、f2、f3、神经酰胺糖内切酶ii，化学法，如β消除反应，和/或其组合；和/或优选地，所述纯化包括离心、沉淀分离、过滤、色谱分离和/或其组合。3.如权利要求2所述的应用，其中所述仿生糖链通过对所述样品糖链的仿生处理得到，优选地，所述仿生处理包括同位素标记，优选地，同位素标记包括针对样品糖链的还原反应，例如采用硼氘化钠进行还原，使得样品糖链的还原端半缩醛结构转变为醇羟基并包含同位素标记，例如，氘代。4.一种评估对象中干预衰老处理的方法，所述方法包括：(i)提供所述对象在接受所述干预衰老处理后的样品；(ii)从所述样品中的糖复合物中释放样品糖链；(iii)提供与所述样品糖链对应的仿生糖链；(iv)对所述仿生糖链和所述样品糖链进行唾液酸衍生化；(v)对所述唾液酸衍生化的样品糖链和仿生糖链进行纯化；(vi)将纯化的样品糖链和仿生糖链混合，形成混合物；(vii)对所述混合物进行质量分析，以获得质量分析数据；和(viii)将所述干预衰老处理后的质量分析数据与对照数据进行比较，从而评估所述干预衰老处理，优选地，所述干预衰老处理包括热量控制；优选地，所述样品糖链包括n-糖链；优选地，所述样品选自：体液样品，如血液、血清、血浆、尿液、唾液、淋巴液、脊髓液、腹水、羊水，细胞样品，如分离自组织的细胞样品、体外培养的细胞样品，组织样品，如新鲜组织样品、固定化组织样品，或其组合；优选地，所述糖复合物选自：糖蛋白、蛋白聚糖、糖肽、糖脂、或其组合；优选地，所述释放样品糖链包括：酶法，如采用pngase f、内切糖苷酶h、f2、f3、神经酰胺糖内切酶ii，化学法，如β消除反应，和/或其组合；优选地，所述纯化包括离心、沉淀分离、过滤、色谱分离和/或其组合；和/或
优选地，所述比较通过计算软件和/或算法获得。5.如权利要求4所述的方法，其中所述仿生糖链通过对所述样品糖链的仿生处理得到，优选地，所述仿生处理包括同位素标记，优选地，同位素标记包括针对样品糖链的还原反应，例如采用硼氘化钠进行还原，使得样品糖链的还原端半缩醛结构转变为醇羟基并包含同位素标记，例如，氘代。6.如权利要求4所述的方法，其中所述质量分析数据包括总糖链水平和/或乙酰化糖链水平，优选地，当所述干预衰老处理后的总糖链水平低于对照数据和/或乙酰化糖链水平高于对照数据时，所述干预衰老处理有效。7.如权利要求4所述的方法，其中所述总糖链水平包括以下糖链的水平：去岩藻糖基化糖链、半乳糖基化糖链和唾液酸化糖链；和/或所述乙酰化糖链包括乙酰化的唾液酸糖链，例如o-乙酰化的唾液酸糖链。8.如权利要求4所述的方法，其中所述质量分析数据包括派生的糖基化特征。9.如权利要求4所述的方法，其中所述对照数据包括所述对象在接受所述干预衰老处理前的样品经过所述步骤(ii)-(vii)处理所得的质量分析数据。10.用于如权利要求1-3中任一项所述应用或如权利要求4-9中任一项所述方法或确定对象的样品中总糖链水平和/或乙酰化糖链水平中的试剂和/或设备在制备指示衰老或评估干预衰老处理的产品中的应用。

技术总结
本申请公开了基于糖链指示衰老或评估干预衰老处理的应用和方法。具体地，糖链混合物在制备指示衰老或评估干预衰老处理的产品中的应用，优选地，所述干预衰老处理包括热量控制。制。


技术研发人员：任士芳 顾建新 范吉腾
受保护的技术使用者：复旦大学
技术研发日：2023.04.19
技术公布日：2023/9/22