一种用于检测神经副肿瘤综合征的表达载体及其制备方法

1.本发明涉及医学技术领域，尤其涉及一种用于检测神经副肿瘤综合征的表达载体及其制备方法。


背景技术：

2.副肿瘤综合征，是指由于肿瘤的产物导致异常的免疫反应或其他不明原因，可引起神经、肾脏及皮肤等系统发生病变，出现相应的临床表现，这些表现不是由原发肿瘤或转移灶所在部位直接引起的而是通过肿瘤的远隔效应间接引起的。影响的远隔自身器官如在神经系统，也称之为神经系统副肿瘤综合征，如肺癌、卵巢癌等可以出现表现为中枢神经系统的灰质炎性和神经退行性变的远隔效应。神经副肿瘤综合征一般发生在患者肿瘤发生之前较多一些，据统计约有80％左右的神经副肿瘤综合征患者在肿瘤发生之前就有了明显的病变表现，例如体内产生了神经副肿瘤综合征相关的抗体，这就为能够及早地发现恶性肿瘤的存在提供了一个契机，对于严重威胁人类生命健康的癌症，如果能及早的发现及治疗，那么就可以显著地提高患者的生存期。
3.专利号为cn113252906a的中国专利公开了一种副肿瘤综合征相关标志性抗体的检测方法，将微球与流式分析技术相结合，对hu、yo、ri、cv2、amphiphysin、ma1、ma2、sox1、tr、zic4、titin、recoverin、pkcγ、gad65等14项副肿瘤综合征相关标志性抗体进行联合检测，检测方法如下：对14种微球进行激活；将微球与抗原进行偶联反应；对微球进行封闭处理；将微球进行混合；将血清样本加入混合反应体系中，进行抗原抗体免疫结合反应；加入过量的fitc标记的羊抗鼠igg进行免疫荧光反应。该技术形成的14中联合标记物的检测方法所需要准备的步骤繁琐，需要孵化的微球数量较多，在实际操作中效果未知。并且该方案并没有公开副肿瘤抗原蛋白的获取途径。
4.本发明提供一种用于检测神经副肿瘤综合征的表达载体并且含有基因优化的pns基因和egfp基因序列，其能够高表达12种与神经副肿瘤综合征相关的抗体并基于免疫印迹法生成仅需要患者少量血液即可测试患者是否属于阳性患病状态的膜条。
5.此外，一方面由于对本领域技术人员的理解存在差异；另一方面由于申请人做出本发明时研究了大量文献和专利，但篇幅所限并未详细罗列所有的细节与内容，然而这绝非本发明不具备这些现有技术的特征，相反本发明已经具备现有技术的所有特征，而且申请人保留在背景技术中增加相关现有技术之权利。


技术实现要素：

6.针对现有技术之不足，本发明提供了一种表达载体，以去掉前导肽区域的原核表达载体为基础，所述原核表达载体包含mbp标签、egfp标签和目的基因，其中，所述egfp标签和目的基因之间设置有hrv 3c酶切位点。优选地，表达载体用于检测神经副肿瘤综合征。
7.根据一种优选实施方式，所述目的基因为基因优化后的amphiphysin、cv2、gad65、hu、ma2、recoverin、ri、sox1、titin、tr、yo、zic4中的一种或多种。
8.根据一种优选实施方式，所述原核表达载体为pet22b重组抗原表达载体。
9.本发明提供一种用于检测神经副肿瘤综合征的检测方法，检测方法包含基于原核表达系统进行表达纯化得到的amphiphysin、cv2、gad65、hu、ma2、recoverin、ri、sox1、titin、tr、yo、zic4中的一种或多种抗原蛋白；以pet-mbp为基础，整合有基因优化的amphiphysin、cv2、gad65、hu、ma2、recoverin、ri、sox1、titin、tr、yo、zic4中的一种或多种，得到表达amphiphysin、cv2、gad65、hu、ma2、recoverin、ri、sox1、titin、tr、yo、zic4中的一种或多种抗原蛋白的原核表达载体，其中，所述抗原蛋白能够通过免疫印迹法包被在膜条中。
10.本发明提供一种表达载体与pns抗体结合的用途。所述表达载体用于表达检测神经副肿瘤综合征所需的蛋白。
11.本发明提供一种用于检测神经副肿瘤综合征的表达载体的制备方法，包含以下步骤：将所述目的基因作为模板；pet22b重组抗原表达载体的n端串联mbp标签和egfp标签，其中，egfp标签带有一个hrv 3c酶切位点，获得pet-mbp-egfp载体；将所述目的基因整合至所述pet-mbp-egfp载体。优选地，所述目的基因为基因优化后的amphiphysin、cv2、gad65、hu、ma2、recoverin、ri、sox1、titin、tr、yo、zic4中的一种或多种。
12.根据一种优选实施方式，所述表达载体的c端带有his标签，便于蛋白纯化。
13.本发明提供一种用于检测神经副肿瘤综合征的试剂盒。所述试剂盒包含基于本技术提供的表达载体而获得的amphiphysin、cv2、gad65、hu、ma2、recoverin、ri、sox1、titin、yo、zic4中的一种或多种抗原蛋白。
14.根据一种优选实施方式，本发明提供的检测方法中的所述检测方法包含cv2重组表达抗原蛋白。
15.根据一种优选实施方式，本发明提供的检测方法中的所述检测方法包含titin重组表达抗原蛋白。
16.根据一种优选实施方式，本发明提供的检测方法中的所述检测方法包含sox1重组表达抗原蛋白。
17.根据一种优选实施方式，本发明提供的检测方法中的所述检测方法包含gad65重组表达抗原蛋白。
18.根据一种优选实施方式，本发明提供的检测方法中的所述检测方法包含yo重组表达抗原蛋白。
19.根据一种优选实施方式，本发明提供的检测方法中的所述检测方法包含titin、sox1、gad65、yo重组表达抗原蛋白。
20.根据一种优选实施方式，本发明提供的检测方法中的所述检测方法包含cv2、sox1、gad65、yo重组表达抗原蛋白。
21.根据一种优选实施方式，本发明提供的检测方法中的所述检测方法包含cv2、titin、gad65、yo重组表达抗原蛋白。
22.根据一种优选实施方式，本发明提供的检测方法中的所述检测方法包含cv2、titin、sox1、yo重组表达抗原蛋白。
23.根据一种优选实施方式，本发明提供的检测方法中的所述检测方法包含cv2、titin、sox1、gad65重组表达抗原蛋白。
24.根据一种优选实施方式，本发明提供的检测方法中的所述检测方法包含sox1、gad65、yo重组表达抗原蛋白。
25.根据一种优选实施方式，本发明提供的检测方法中的所述检测方法包含cv2、gad65、yo重组表达抗原蛋白。
26.根据一种优选实施方式，本发明提供的检测方法中的所述检测方法包含cv2、titin、yo重组表达抗原蛋白。
27.根据一种优选实施方式，本发明提供的检测方法中的所述检测方法包含cv2、titin、sox1重组表达抗原蛋白。
28.根据一种优选实施方式，本发明提供的检测方法中的所述检测方法包含cv2、titin重组表达抗原蛋白。
29.根据一种优选实施方式，本发明提供的检测方法中的所述检测方法包含titin、sox1重组表达抗原蛋白。
30.根据一种优选实施方式，本发明提供的检测方法中的所述检测方法包含sox1、gad65重组表达抗原蛋白。
31.根据一种优选实施方式，本发明提供的检测方法中的所述检测方法包含gad65、yo重组表达抗原蛋白。
32.根据一种优选实施方式，本发明提供的检测方法中的所述检测方法包含cv2、yo重组表达抗原蛋白。
33.根据一种优选实施方式，本发明提供的检测方法中的所述检测方法包含sox1、yo重组表达抗原蛋白。
34.本发明提供一种用于检测神经副肿瘤综合征的融合蛋白。融合蛋白为用于检测神经副肿瘤综合征的表达载体表达得到。
35.本发明提供基于本技术提供的表达载体在制备用于检测神经副肿瘤综合征的融合蛋白中的应用。
36.本发明提供了一种优化的egfp基因。所述egfp基因增加pns抗原蛋白的表达效率。
37.本发明提供一种宿主细菌，含有用于检测神经副肿瘤综合征的表达载体。
38.根据一种优选实施方式，表达载体是在厌氧微生物中发挥功能的质粒载体。
39.根据一种优选实施方式，表达载体是在大肠杆菌中发挥功能的质粒载体。
40.根据一种优选实施方式，厌氧微生物是选自以下的肠细菌：双歧杆菌、乳酸杆菌、肠球菌、链球菌或梭菌。
41.目前临床用于诊断神经副肿瘤综合征(paraneoplastic neurological syndromes，pns)的相关标志性抗体检测主要包括amphiphysin、cv2、gad65、hu、ma2、recoverin、ri、sox1、titin、tr、yo、zic4等12种抗体，对于上述12种抗体的检测主要适用于神经副肿瘤综合征筛查和辅助诊断，以及副肿瘤脑炎与自身免疫性脑炎的鉴别诊断等。本技术通过改造了一种原核表达质粒(pet-mbp)，实现高效地表达pns抗原蛋白，并最终能够通过原核表达质粒(pet-mbp)获得12种可溶性抗原蛋白。上述12种可溶性抗原蛋白能够单独或以组合的形式包被于膜条中，并最终形成能够与pns抗体结合而使膜条显示指示的检测方法。
42.本发明提供了一种用于神经副肿瘤抗原原核表达的载体并含有优化之后的pns基
因序列，它能够大幅度提高抗原蛋白的表达量及可溶性，并最终得到足够可溶性的抗原蛋白，包括amphiphysin、cv2、gad65、hu、ma2、recoverin、ri、sox1、titin、yo、zic4等，用于检测特异性pns抗体。
43.现有技术中，pns全长蛋白的表达和纯化的体系构建对于基于pns抗体鉴定的疾病筛查具有重要作用。本发明提供的改造后的载体能够高效表达可溶性的全长抗原蛋白，载体带有3c酶切位点，并允许实验人员基于自身需求自行选择是否去除多余的融合标签。实施例1的实验结果显示，通过常规的质粒转化和表达无法获得可使用的用于与pns抗体结合的可溶性蛋白。
44.区别于常规载体，改造后的载体包含以下特征：
45.在t7启动子和终止子增加顺序为mbp-egfp-3c的序列。
46.本技术基于改造后的载体提供一套能够快速而高效的生成上述可溶性的抗原蛋白的表达体系，使得基于一个抗原或多个抗原组合的pns抗体的鉴定能够以低廉的成本实现。
附图说明
47.图1是抗原蛋白常规pet22b载体结构图；
48.图2是改造后的pet-mbp-zic4抗原蛋白表达质粒的电泳图；
49.图3是改造之后的pet-mbp-egfp抗原蛋白表达载体结构图；
50.图4是mbp标签促进zic4蛋白可溶表达的电泳图；
51.图5是优化pns和egfp基因序列之后的表达效果图；
52.图6是基因优化之后pns抗原蛋白纯化结果图；
53.图7是膜条的生产过程图；
54.图8是蛋白抗原性验证实验结果图；
55.图9是pns和egfp基因优化之后的参数对比图。
具体实施方式
56.下面结合附图进行详细说明。
57.实施例1
58.本实施例提供一种pns抗原的表达方法。本实施例还提供一种常规pet22b载体构建的制备方法。
59.能够与pns抗体结合的12种蛋白大部分都为胞质或核蛋白，只有tr为单次跨膜蛋白，因此选取其胞外区tr-ex进行表达。原核表达系统体系成熟、成本低廉是蛋白表达的首选，因此首先将12个pns抗原基因，pcr获得并亚克隆到常规的原核表达载体pet22b上，克隆的位点为ndei-xhoi，去掉了pet22b中带有的前导肽，重组蛋白在大肠杆菌内表达(图1)，c端带有his标签可以用于蛋白亲和纯化。原始的12种抗原基因序列如序列表所示，其中，amphiphysin序列为seq id no.1、cv2序列为seq id no.2、gad65序列为seq id no.3、hu序列为seq id no.4、ma2序列为seq id no.5、recoverin序列为seq id no.6、ri序列为seq id no.7、sox1序列为seq id no.8、titin序列为seq id no.9、tr序列为seq id no.10、yo序列为seq id no.11、zic4序列为seq id no.12。
60.图1示出了去掉了前导肽的pet22b载体结构，pns基因的克隆位点为ndei-xhoi。改造后的目的蛋白的c端带有可以用于蛋白亲和纯化的his标签。
61.1)引物设计：
62.采用无缝连接法将pns抗原基因构建到原核表达质粒pet22b上。以zic4抗原的构建作为例子，设计pcr扩增引物：pet22b-原始zic4-f(seq id no.13)、pet22b-原始zic4-r(seq id no.14)，上游引物包括目的载体pet22b上插入位置之前的同源臂序列和zic4基因特异上游引物，下游引物包括pet22b上插入位置之后的同源臂反向互补序列和zic4基因特异下游引物。
63.2)按浓度将第一轮pcr扩增引物稀释到终浓度10μm，混合pcr体系如下所示：
[0064][0065]
3)混合好的pcr反应体系，短暂瞬时离心之后开始pcr扩增；
[0066]
pcr反应程序如下所示：
[0067]
预变性：94℃，2min
[0068]
变性：98℃，10s
[0069]
退火：60℃，10s
[0070]
延伸：72℃，15s(1kb/10s)
[0071]
循环数：35个循环
[0072]
延伸：72℃，2min
[0073]
保存条件：10℃
[0074]
4)pcr完成之后，电泳跑胶并切胶回收基因产物。
[0075]
5)按胶回收检测方法说明书操作回收pcr产物，第一轮pcr回收产物的终浓度为100ng/μl。
[0076]
6)pet22b载体双酶切反应体系：
[0077]
反应组分体积pet22b质粒1μgrcutsmart buffer5μlneb限制性内切酶ndei1μlneb限制性内切酶xhoi1μlddh2o补足至50μl
[0078]
反应体系混匀后，置于37℃培养箱孵育2h，电泳跑胶，切胶回收载体大片段。
[0079]
7)无缝连接反应：
[0080]
将回收的zic4基因片段和pet22b载体大片段使用nebuilder的进行无缝连接，反应体系如下：
[0081]
反应组分体积
pet22b质粒大片段3μlzic4基因片段2μlnebuilder hifi dna assembly master mix10μlddh2o5μl总体积20μl
[0082]
8)转化：取5μl连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，复苏之后涂到amp抗性的lb固体培养平板上培养。
[0083]
9)挑取单菌落，加入含有amp抗生素的lb培养基中，37℃摇菌过夜培养，提取重组质粒pet22b-zic4筛选测序结果正确的重组子。
[0084]
pns基因的克隆位点为ndei-xhoi，去掉了pet22b中带有的前导肽，使重组蛋白在大肠杆菌内表达(图1)，c端带有his标签可以用于蛋白亲和纯化。
[0085]
实施例2
[0086]
本实施例提供一种pet-mbp-egfp质粒的制备方法。
[0087]
常规pet22b重组抗原表达载体测序正确之后，转化bl21(de3)，iptg诱导表达后表达发现仅有3个蛋白有可溶性表达，其余蛋白都是包涵体或者表达太弱无法纯化。为了获得一整套的pns抗原蛋白，对表达质粒进行改造和优化，引入了mbp(maltose binding protein)标签和egfp荧光标签。mbp具有促进蛋白可溶性、稳定性的效果，egfp便于直接观察抗原蛋白是否表达及表达量高低，通过查看菌体的绿色程度即可知道目标蛋白的表达情况，非常的方便。
[0088]
在pet22b载体的基础上，引入了另外的两个标签：mbp和egfp，mbp和egfp串联，之后再装入需要表达的基因，在egfp标签和基因之间设计了一个hrv 3c酶切位点，后期可以选择是否去除mbp和egfp标签。mbp从另一个表达载体pmal-c2x中pcr扩增获得，eegfp从eegfp-n1(addgene，54767)中pcr扩增获得。
[0089]
1)引物设计：以抗原蛋白zic4的表达载体改造为例子，引物包含mbp基因上游引物mbp-nde1-f(seq id no.15)、mbp基因下游引物mbp-r(seq id no.16)、egfp基因上游引物egfp-f(seq id no.17)、egfp基因下游引物egfp-r(seq id no.18)、zic4基因上游引物zic4-f(seq id no.19)、zic4基因下游引物zic4-r(seq id no.20)。
[0090]
2)pcr扩增及回收：选择成套的引物和相应的dna模板，使用primestar(takara，r045a)体系扩增得到mbp，egfp及pns抗原基因，pcr完成之后，电泳跑胶并切胶回收基因产物。
[0091]
3)无缝连接：将回收的mbp、egfp标签，zic4抗原基因和线性化的pet22b(ndei-xhoi，前面已获得)，使用nebuilder的进行多片段的无缝连接，反应体系如下：
[0092]
反应组分体积pet22b质粒大片段3μlzic4基因片段1μlmbp片段1μlegfp片段1μlnebuilder hifi dna assembly master mix10μlddh2o4μl
总体积20μl
[0093]
4)重组克隆筛选：取5μl连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，复苏之后涂到amp抗性的lb固体培养平板上培养。挑取单菌落，加入含有amp抗生素的lb培养基中，37℃摇菌过夜培养，提取质粒测序筛选正确的重组子pet-mbp-zic4，如图2所示。
[0094]
图2示出了pet-mbp-zic4在转染质粒后的电泳示意图。图2a中的lane 1为dna marker，lane 2为pcr得到的zic4基因片段。图2b中的lane 1为dna marker，lane 2为pcr得到的mbp基因片段，lane 3为pcr得到的egfp基因片段，lane 4和5分别为不同量的pet22b双酶切之后的载体骨架。图2c示出的lane 1为dna marker，lane 2为ndei和xhoi双酶切验证的电泳结果。基于图2示出的结果可知，pet-mbp-zic4载体构建成功。
[0095]
其余的pns抗原基因也按照同样的原理构建到pet-mbp-egfp载体上。
[0096]
实施例3
[0097]
本实施例提供一种用于检测神经副肿瘤综合征的融合蛋白。本发明还提供一种用于检测神经副肿瘤综合征的融合蛋白的制备方法。
[0098]
pns抗原基因构建到新的pet-mbp-egfp载体上，新载体中pns抗原蛋白的表达模式：n端mbp和egfp标签串联，之后带有一个hrv 3c酶切位点，可以选择后期切除所有的标签蛋白，融合抗原蛋白的c末端带有一个his标签可用于蛋白亲和纯化，如图3所示。
[0099]
本实施例提供一种pet-mbp-egfp改善质粒表达蛋白可溶性的方法。
[0100]
原始的pet22b-zic4重组质粒转化bl21(de3)，iptg诱导后，有明显的zic4蛋白表达，但是几乎以包涵体形式存在于离心后的沉淀中，如图4左侧胶图。图4左侧胶图示出了pet22b-zic4包涵体。质粒改造后的pet-mbp-egfp-zic4质粒经iptg诱导，在总蛋白和上清液中均有明显条带，说明蛋白可以高丰度可溶性表达，如图4右侧胶图。图4右侧胶图示出了mbp-egfp-zic4蛋白。离心收集诱导后的大肠杆菌，超声破碎裂解细菌，离心去除沉淀得到上清液，发现能得到可溶性zic4蛋白。在250mm咪唑洗脱液中得到比较纯的mbp-egfp-zic4蛋白，收集洗脱液并进一步地纯化。
[0101]
图4左侧的胶图中的lane5代表诱导前样本，lane3和lane4代表37℃诱导之后的样本，lane1和lane2代表18℃诱导之后的样本，其中，lane6中颜色最深的条带为目的条带。图4右侧的胶图为更换质粒之后的诱导表达成功及镍柱纯化的样本，其中，250mm咪唑洗脱液对应的泳道展示的条带为目的条带。
[0102]
实施例4
[0103]
外源基因在大肠杆菌中表达，除了表达载体的影响，例如pet-mbp-egfp载体中mbp标签能够提高pns蛋白可溶性表达的问题。外源基因自身的性质的也至关重要，例如基因密码子的选择对于表达量影响。不同的表达宿主生物体对于不同密码子会有明显的偏好性，人源密码子的偏好性和大肠杆菌存在着很大的差别。pns基因来源于人源，与大肠杆菌的密码子使用频率差异很大，因此本实施例对原始的人源pns基因序列进行了密码子优化。同时我们对表达载体上的各个表达元件进行了来源分析：mbp标签本身来源于大肠杆菌可以不用优化，而egfp是从来源于水母的野生型gfp突变而来，适合在哺乳动物细胞内表达。因此我们不单对pns基因进行了基因优化，也对egfp基因做了基因优化。充分保证表达载体pet-mbp-egfp中的pns基因能够更好地在大肠杆菌中表达。
[0104]
基因优化的原则：分析pns和egfp基因序列，关注三个参数。
[0105]
一、密码子适应指数(codon adaption index)
[0106]
cai的值通常为0.8～1.0。低于cai目标值很可能会影响表达效果。
[0107]
然而，本技术根据pns抗原基因的特点，发现经过优化后cai值在0.75～0.80之间也能取得较好的表达效果。
[0108]
二、密码子使用频率分布(condon frequency distribution，cfd)
[0109]
通用密码子优化原则并不能被统一的运用到单一的基因表达载体之中。不同的通用密码子优化原则往往会出现相互不兼容的问题。如果密码子的使用频率低于30％将不利于表达，优化的目的是在不改变氨基酸的情况下，尽量少使用频率低于30％的密码子。
[0110]
基于pns基因中的密码子使用偏性，对原始pns基因进行分析，发现使用低频率密码子的氨基酸比例大概在5％～14％之间。经过优化，优化后的pns基因的cfd值降低到2％～4％。
[0111]
三、gc含量(gc content)
[0112]
gc含量是影响基因表达的次要参数。理想的范围为30％～70％，过高gc含量不利于pcr等基因操作。优化之后的pns gc含量位于47％～65％之间。
[0113]
本技术对12个pns抗原基因和egfp基因分别进行了密码子优化，优化的效果见图9。amphiphysin序列为seq id no.21、cv2序列为seq id no.22、gad65序列为seq id no.23、hu序列为seq id no.24、ma2序列为seq id no.25、recoverin序列为seq id no.26、ri序列为seq id no.27、sox1序列为seq id no.28、titin序列为seq id no.29、tr序列为seq id no.30、yo序列为seq id no.31、zic4序列为seq id no.32、egfp序列为seq id no.33。图9示出了pns和egfp基因优化之后的参数对比。
[0114]
优化好的pns和egfp基因合成由通用生物公司完成(通用公司生产编号g0161787)，然后按照实施例2中的构建方法得到一套新的pet-mbp-egfp重组质粒。在pet22b载体的基础上，引入了另外的两个标签：mbp和优化的egfp，mbp和优化的egfp串联，之后再装入优化之后的pns基因，在egfp标签和基因之间设计了一个hrv 3c酶切位点，后期可以选择是否去除mbp和egfp标签。mbp从另一个表达载体pmal-c2x中pcr扩增获得。
[0115]
1)引物设计：以优化后的抗原蛋白zic4的表达载体改造为例子，引物包含mbp基因上游引物mbp-nde1-f(seq id no.15)、mbp基因下游引物mbp-r(seq id no.34)、egfp基因上游引物egfp-f(seq id no.35)、egfp基因下游引物egfp-r(seq id no.36)、优化zic4基因上游引物zic4-f1(seq id no.37)、优化zic4基因下游引物zic4-r1(seq id no.38)。
[0116]
2)pcr扩增及回收：选择成套的引物和相应的dna模板，使用primestar(takara，r045a)体系扩增得到mbp，egfp及优化的pns抗原基因，pcr完成之后，电泳跑胶并切胶回收基因产物。
[0117]
3)无缝连接：将回收的mbp、egfp标签，优化zic4抗原基因和线性化的pet22b(ndei-xhoi，前面已获得)，使用nebuilder的进行多片段的无缝连接，反应体系如下：
[0118]
反应组分体积pet22b质粒大片段3μl优化zic4基因片段1μlmbp片段1μl优化egfp片段1μl
nebuilder hifi dna assembly master mix10μlddh2o4μl总体积20μl
[0119]
4)重组克隆筛选：取5μl连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，复苏之后涂到amp抗性的lb固体培养平板上培养。挑取单菌落，加入含有amp抗生素的lb培养基中，37℃摇菌过夜培养，提取质粒测序筛选正确的重组子pet-mbp-egfp-zic4。
[0120]
其余优化的pns抗原基因也按照同样的原理构建到pet-mbp-egfp载体上。
[0121]
实施例5
[0122]
本实施例提供一种优化基因序列能够提高蛋白表达量的方法。
[0123]
在pet-mbp-egfp质粒中，大部分的pns蛋白都能够有明显的表达，为了进一步地提高pns蛋白在大肠杆菌中的表达，我们对所有的抗原蛋白和egfp做了基因优化。其中，amphiphysin序列为seq id no.21、cv2序列为seq id no.22、gad65序列为seq id no.23、hu序列为seq id no.24、ma2序列为seq id no.25、recoverin序列为seq id no.26、ri序列为seq id no.27、sox1序列为seq id no.28、titin序列为seq id no.29、tr序列为seq id no.30、yo序列为seq id no.31、zic4序列为seq id no.32、egfp序列为seq id no.33。
[0124]
比较基因优化之后pns蛋白表达质粒的表达效果，将原始基因序列pet-mbp-egfp-pns质粒和基因优化之后的pet-mbp-egfp-pns质粒转化bl21(de3)感受态细胞，iptg诱导后，比较蛋白表达量，发现其中的6个蛋白：hu，cv2，amphiphysin，zic4，yo，titin6个蛋白的表达量有不同程度的提高(图5)，该结果充分表明基因优化能够有效提高蛋白的稳定性和表达量。如图5a，lane1、2、5、8泳道为空质粒的bl21全菌蛋白，lane3为基因优化前的pet-mbp-egfp-hu全菌蛋白，lane4为基因优化后的pet-mbp-egfp-hu全菌蛋白，lane6为基因优化前的pet-mbp-egfp-cv2全菌蛋白，lane7为基因优化后的pet-mbp-egfp-cv2全菌蛋白，lane9为基因优化前的pet-mbp-egfp-amphiphysin全菌蛋白，lane10为基因优化后的pet-mbp-egfp-amphiphysin全菌蛋白；如图5b，lane1、4、7泳道为空质粒的bl21全菌蛋白，lane2为基因优化前的pet-mbp-egfp-zic4全菌蛋白，lane3为基因优化后的pet-mbp-egfp-zic4全菌蛋白，lane5为基因优化前的pet-mbp-egfp-yo全菌蛋白，lane6为基因优化后的pet-mbp-egfp-yo全菌蛋白，lane8为基因优化前的pet-mbp-egfp-titin全菌蛋白，lane9为基因优化后的pet-mbp-egfp-titin全菌蛋白。
[0125]
实施例6
[0126]
本实施例提供一种用于检测神经副肿瘤综合征的融合蛋白的纯化方法。
[0127]
经过前期的小试表达摸索之后，对各个蛋白进行大量表达，表达(0.5mm iptg，19℃，220r，过夜诱导)，用buffer(25mm tris，0.5m nacl，5％甘油，0.05％ ddm，20mm imidazole，ph 8.0)重悬，高压破碎5min，高速离心(15000rpm，40min，4℃)。后续根据蛋白的不同情况，采用了以下步骤进行分别纯化。
[0128]
(1)his柱亲和纯化
[0129]
washing buffer：25mm tris，150mm nacl，5％甘油，0.05％ ddm，ph 8.0；
[0130]
imidazole梯度洗脱液：25mm tris，150mm nacl，5％甘油，0.05％ ddm，ph 8.0含有20mm，50mm，100mm，250mm，500mm不同浓度的咪唑(5～10倍柱体积)。
[0131]
(2)分子筛纯化(必选)
[0132]
分子筛buffer：25mm tris，150m nacl，ph 8.0；
[0133]
column：sd200 increase。
[0134]
经过上述不同组合的纯化步骤，得到了12种纯度大于85％以上的抗原，如图6。
[0135]
图6中，lane1代表蛋白marker；从左到右，依次为纯化后的amphiphysin、cv2、gad65、hu、ma2、recoverin、ri、sox1、titin、tr、yo、zic4，上样量为1～3ug。图6中的amphi代表的蛋白为纯化后的amphiphysin。
[0136]
实施例7
[0137]
本实施例提供一种用于检测神经副肿瘤综合征的融合蛋白的纯化方法。
[0138]
(1)his柱亲和纯化
[0139]
washing buffer：25mm tris，150mm nacl，5％甘油，0.05％ ddm，ph 8.0；
[0140]
imidazole梯度洗脱液：25mm tris，150mm nacl，5％甘油，0.05％ ddm，ph 8.0含有20mm，50mm，100mm，250mm，500mm不同浓度的咪唑(5～10倍柱体积)。
[0141]
(2)mbp柱亲和纯化
[0142]
washing buffer：25mm tris，150mm nacl，5％甘油，0.05％ ddm，ph 8.0；
[0143]
elution buffer：25mm tris，150mm nacl，5％甘油，0.05％ ddm，15mm maltose，ph 8.0(5～10倍柱体积)。
[0144]
(3)分子筛纯化
[0145]
分子筛buffer：25mm tris，150m nacl，ph 8.0；
[0146]
column：sd200 increase。
[0147]
经过上述不同组合的纯化步骤，得到了12种纯度大于85％以上的抗原。
[0148]
实施例8
[0149]
本实施例提供一种用于检测神经副肿瘤综合征的融合蛋白的纯化方法。
[0150]
(1)his柱亲和纯化
[0151]
washing buffer：25mm tris，150mm nacl，5％甘油，0.05％ ddm，ph 8.0；
[0152]
imidazole梯度洗脱液：25mm tris，150mm nacl，5％甘油，0.05％ ddm，ph 8.0含有20mm，50mm，100mm，250mm，500mm不同浓度的咪唑(5～10倍柱体积)。
[0153]
(2)q柱纯化
[0154]
buffer a：25mm tris，ph 8.0；
[0155]
buffer b：25mm tris，1m nacl，ph 8.0；
[0156]
column：source q。
[0157]
(3)分子筛纯化
[0158]
分子筛buffer：25mm tris，150m nacl，ph 8.0；
[0159]
column：sd200 increase。
[0160]
经过上述不同组合的纯化步骤，得到了12种纯度大于85％以上的抗原。
[0161]
实施例9
[0162]
本实施例提供一种用于检测神经副肿瘤综合征的融合蛋白的纯化方法。
[0163]
(1)his柱亲和纯化
[0164]
washing buffer：25mm tris，150mm nacl，5％甘油，0.05％ ddm，ph 8.0；
[0165]
imidazole梯度洗脱液：25mm tris，150mm nacl，5％甘油，0.05％ ddm，ph 8.0含
有20mm，50mm，100mm，250mm，500mm不同浓度的咪唑(5～10倍柱体积)。
[0166]
(2)mbp柱亲和纯化
[0167]
washing buffer：25mm tris，150mm nacl，5％甘油，0.05％ ddm，ph 8.0；
[0168]
elution buffer：25mm tris，150mm nacl，5％甘油，0.05％ ddm，15mm maltose，ph 8.0(5～10倍柱体积)。
[0169]
(3)q柱纯化
[0170]
buffer a：25mm tris，ph 8.0；
[0171]
buffer b：25mm tris，1m nacl，ph 8.0；
[0172]
column：source q。
[0173]
(4)分子筛纯化
[0174]
分子筛buffer：25mm tris，150m nacl，ph 8.0；
[0175]
column：sd200 increase。
[0176]
经过上述不同组合的纯化步骤，得到了12种纯度大于85％以上的抗原。
[0177]
实施例10
[0178]
本实施例提供一种用于检测神经副肿瘤综合征的检测方法。本实施例提供一种用于检测神经副肿瘤综合征的检测方法的制备方法。本实施例提供一种用于检测神经副肿瘤综合征的膜条的制备方法。
[0179]
检测膜条的生产步骤如下：
[0180]
将12种重组表达抗原蛋白用相应的buffer进行稀释，使用biodot-ad 3220喷膜仪，可以将单个蛋白或者多个蛋白按顺序喷到nc膜上，每条线代表一种抗原，另外加上一个阳性对照条带，该阳性对照能够和偶联ap的anti-human二抗直接反应，产生显色条带；
[0181]
将喷好重组抗原蛋白的nc膜上封闭之后，37℃烘干数小时；
[0182]
使用金标生物的zq3500数控高速斩切机切成宽度为3.5mm的膜条，整体流程如图7。
[0183]
实施例11
[0184]
为了进一步验证本发明提供的神经副肿瘤综合征相关的12项抗原蛋白能够满足检测需求，选择由商业检测方法(rsr line14 assay)筛查出来的抗体阳性和阴性血清，使用基于本技术的制备方法获得的免疫印迹膜条进行可行性和有效性测试。
[0185]
本实施例中采用含有单个蛋白的测试膜条和由商业检测方法(ravo pns 14line assay)筛查出来的cv2、titin、sox1、gad65、yo抗体阳性和阴性血清进行孵育反应，验证基于本技术提供的制备方法生产的抗原蛋白是否具有良好的抗原性和可用于神经副肿瘤综合征检测检测方法的研发。
[0186]
将cv2、titin、sox1、gad65、yo重组表达抗原蛋白用相应的buffer进行稀释，使用biodot-ad 3220喷膜仪，另外加上一个阳性对照条带，每条线代表一种抗原，在nc膜条的正面划线处理。将喷好重组抗原蛋白的nc膜上封闭之后，37℃烘干数小时。使用金标生物的zq3500数控高速斩切机切成宽度为3.5mm的膜条，用于后续的检测。
[0187]
步骤如下：
[0188]
1)向孵育槽中加入1ml稀释缓冲液确保完全覆盖膜条，在孵育过程中务必确保nc膜正面朝上；
[0189]
2)向每个反应槽中加入5μl阳性质控品或样本最终稀释比例为1：200；
[0190]
3)小心混匀，然后在摇床上室温(18～25℃)震荡孵育30min；
[0191]
4)使用洗涤缓冲液进行清洗：使用移液枪小心吸出或轻轻倒出孵育槽中的液体，然后加入1ml洗涤缓冲液，震荡30s。重复上述步骤5次；
[0192]
5)每个孵育槽中加入1ml酶结合物；
[0193]
6)室温条件下，在摇床上震荡孵育30min；
[0194]
7)使用洗涤缓冲液进行清洗：使用移液枪小心吸出或轻轻倒出孵育槽中的液体，然后加入1ml洗涤缓冲液，震荡30s，重复上述步骤5次；
[0195]
8)每个孵育槽中加入1ml底物溶液；
[0196]
9)室温条件下，孵育15～20min直到膜条上的条带清晰可见以阳性质控膜条作为参照；
[0197]
10)用去离子水终止反应：使用移液枪小心吸出或轻轻倒出孵育槽中的液体，然后每个孵育槽中加入1ml去离子水震荡30s，重复上述步骤5次；
[0198]
11)将膜条放在吸水纸上待其充分干燥，然后读取结果，如图8。
[0199]
图8中的最上方的条带为圆珠笔做的膜正面标记，中间条带为质控线，最下面的条带为抗原蛋白。
[0200]
实验结果表明：本技术所提供的一种适用于神经副肿瘤抗原原核表达的载体能够大幅度提高抗原蛋白的表达量及可溶性，并最终得到足够可溶性的抗原蛋白，包括amphiphysin、cv2、gad65、hu、ma2、recoverin、ri、sox1、titin、yo、zic4。抗原蛋白用于检测特异性pns抗体。将纯化的抗原蛋白稀释到合适的浓度，使用喷膜仪将单个蛋白喷到硝酸纤维素膜上，并使用已知的pns阳性和阴性患者血清(cv2、titin、sox1、gad65、yo)进行测试，发现检测结果和商业检测方法相吻合，该结果表明通过工程改造后的载体所表达的抗原蛋白能够以免疫印迹法在膜条上高效结合pns抗体，基于本技术提供的制备方法和纯化方法的抗原具有很好的抗原性，为后续pns检测产品的研发奠定了基础。
[0201]
使用基于本技术提出的制备方法的膜条和ravo商业化检测方法筛选出来的cv2、titin、sox1、gad65、yo、amphiphysin、hu、ma2等抗体阳性和阴性血清进行孵育反应，测试结果表明本技术的抗原蛋白具有很好的抗原性。
[0202]
[0203]
[0204]
[0205]
[0206]
[0207]
[0208]
[0209]
[0210]
[0211]
[0212][0213]
需要注意的是，上述具体实施例是示例性的，本领域技术人员可以在本发明公开内容的启发下想出各种解决方案，而这些解决方案也都属于本发明的公开范围并落入本发明的保护范围之内。本领域技术人员应该明白，本发明说明书及其附图均为说明性而并非构成对权利要求的限制。本发明的保护范围由权利要求及其等同物限定。本发明说明书包含多项发明构思，诸如“优选地”、“根据一个优选实施方式”或“可选地”均表示相应段落公开了一个独立的构思，申请人保留根据每项发明构思提出分案申请的权利。在全文中，“优选地”所引导的特征仅为一种可选方式，不应理解为必须设置，故此申请人保留随时放弃或删除相关优选特征之权利。

技术特征：
1.一种用于检测神经副肿瘤综合征的表达载体，其特征在于，以去掉前导肽区域的原核表达载体为基础，所述原核表达载体包含mbp标签、egfp标签和目的基因，其中，所述egfp标签和所述目的基因之间设置有hrv 3c酶切位点。2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述目的基因为基因优化后的amphiphysin、cv2、gad65、hu、ma2、recoverin、ri、sox1、titin、tr、yo和zic4中的一种或多种。3.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述原核表达载体为pet22b重组抗原表达载体。4.如权利要求1所述的表达载体的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：将所述目的基因作为模板；pet22b重组抗原表达载体的n端串联mbp和egfp标签，其中，egfp标签带有一个hrv 3c酶切位点，获得pet-mbp-egfp载体；将所述目的基因整合至所述pet-mbp-egfp载体。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述目的基因为基因优化后的amphiphysin、cv2、gad65、hu、ma2、recoverin、ri、sox1、titin、tr、yo和zic4中的一种或多种。6.如权利要求1～3之一所述的表达载体与pns抗体结合的用途。7.一种用于检测神经副肿瘤综合征的融合蛋白，其特征在于，如权利要求1～3之一所述的表达载体表达得到。8.如权利要求1～3之一所述的表达载体在制备用于检测神经副肿瘤综合征的融合蛋白中的应用。9.一种用于检测神经副肿瘤综合征的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含基于权利要求1～3之一所述的表达载体而获得的amphiphysin、cv2、gad65、hu、ma2、recoverin、ri、sox1、titin、yo、zic4中的一种或多种抗原蛋白。10.一种宿主细菌，含有如权利要求1～3之一所述的表达载体。

技术总结
本发明提供一种用于检测神经副肿瘤综合征(paraneoplastic neurological syndromes，PNS)的表达载体，以去掉前导肽区域的原核表达载体为基础，所述原核表达载体包含MBP标签、EGFP标签和目的基因及羧基端的his标签，其中，所述EGFP标签和目的基因之间设置有HRV 3C酶切位点。在此基础上，对目的基因和标签基因进行了基因优化，得到了一种提高PNS蛋白可溶性和表达量的原核表达体系。本发明提供的表达载体和优化PNS基因及EGFP基因序列能够特异性的高表达可被PNS抗体结合的抗原蛋白，使得表征神经副肿瘤综合征的PNS抗体能够通过膜条试纸被检测出。被检测出。被检测出。


技术研发人员：刘亮 郝峻巍 柴国梁 刘海杰 陈腾
受保护的技术使用者：首都医科大学宣武医院
技术研发日：2023.04.20
技术公布日：2023/9/22