小龙虾虾壳提取的寡肽族及其提取方法和应用与流程

1.本发明涉及一种从小龙虾虾壳中提取的寡肽族，涉及其在人工胃液中酶解方法,涉及酶解产物中18种寡肽的序列,涉及酶解产物的含18种寡肽的寡肽族的舒血管活性,抗炎活性,恢复氢化可的松损伤的睾丸功能活性以及提高血清细胞因子浓度的活性。本发明属于生物医药领域。


背景技术：

2.克氏原鳌虾,俗称小龙虾。我国小龙虾年养殖面积为17333km2,年养殖产量为263.36万吨。小龙虾加工中,质量分数70％-80％为废弃物。废弃物的主体是小龙虾虾壳。此外,小龙虾从幼体成长为商品虾需要经历蜕虾壳11-12次。小龙虾成长期间蜕下的壳大都直接抛弃。这种处理策略不但浪费资源,而且污染环境。可是,废弃小龙虾虾壳的再利用未得到应有关注。针对这种状况,本发明将废弃的小龙虾虾壳在人工胃液中酶解,酶解产物依次用sephadex g-50层析柱和sephadex g-25层析柱和低压硅胶层析柱纯化。本发明还将纯化的酶解产物用超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱测定寡肽序列,确认了含18种寡肽的寡肽族。本发明进一步对寡肽族的生物活性实施普筛,发现寡肽族有优秀的舒血管活性,抗炎活性,恢复损伤的睾丸功能的活性以及提高血清细胞因子浓度的活性。根据这些认识和发现,发明人提出了本发明。


技术实现要素：

3.本发明要解决的技术问题是提供一种从小龙虾虾壳为原料通过酶解制备提取的寡肽族,解析寡肽族的18种寡肽的序列及测定18种寡肽相对含量,评价寡肽族的生物活性。本发明的寡肽族有优秀的舒血管活性,抗炎活性,恢复氢化可的松损伤的睾丸功能活性以及提高血清细胞因子浓度的活性。为了达到所述目的,本发明采用了以下八个技术手段。
4.本发明提供了一种从小龙虾虾壳为原料通过酶解制备提取的寡肽族，所述寡肽族包含了18种寡肽序列，所述的18种寡肽序列为lys-ser-thr-cys；gly-ala-asn；met-trp-ala；
5.thr-ala-val-lys；glu-thr-arg；glu-trp-ala；tyr-his-lys；his-his-val；thr-trp-thr-his；
6.asp-val-val；arg-gly-gly-ser；asn-trp-thr；glu-tyr-trp；gln-phe-cys-ser；gln-tyr-trp；asp-tyr-trp；val-gly-ala-thr和pro-tyr-ser。这18种寡肽是一族寡肽,简称寡肽族。
7.进一步的，本发明还提供了所述寡肽族的18种寡肽序列的百分含量，具体为lys-ser-thr-cys(2.52％),gly-ala-asn(4.41％),met-trp-ala(1.93％),thr-ala-val-lys(17.93％),glu-thr-arg(7.91％),glu-trp-ala(3.96％),tyr-his-lys(1.76％),his-his-val(1.02％),thr-trp-thr-his(0.49％),asp-val-val(4.87％),arg-gly-gly-ser(29.01％)，asn-trp-thr(6.22％),glu-tyr-trp(1.54％),gln-phe-cys-ser(6.83％),
gln-tyr-trp(4.99％),asp-tyr-trp(1.53％),val-gly-ala-thr(1.54％)和pro-tyr-ser(1.57％)。
8.本发明第三个技术手段是提出了的小龙虾虾壳粉末在人工胃液中酶解的方法,该方法包括如下步骤:
9.1.洗净、烘干、粉碎,得到小龙虾虾壳粉末；
10.2.根据2015版的中国药典提供的模拟胃液配方制备人工胃液；
11.3.称取干燥小龙虾虾壳粉末,加入人工胃液,37℃搅拌酶解4-6小时,将nahco3粉末缓慢加到酶解液中,使酶解液的ph为7,猝灭酶解反应；
12.4.酶解液于4℃及3000g离心15分钟,将上清液-80℃冷冻,24小时后冷冻干燥,得到淡黄色溶于水的冻干粉；
13.5.将溶胀好的sephadex g-50悬浮倾入柱,静置沉降使柱内sephadex g-50的高度基本恒定；
14.6.将溶胀好的sephadex g-25悬浮液缓缓倾入柱,静置沉降使柱内sephadex g-25的高度基本恒定；
15.7.将冻干粉用水溶解后10000转离心10分钟,将上清液加载到sephadex g-50层析柱上,以0.2％甲酸水溶液洗脱,恒流泵控制流速为0.5ml/分钟,紫外检测器在280nm下检测,根据记录仪显示的紫外吸收合并收集的组分,收集的组分对应双缩脲和茚三酮测定均为阳性者确定为肽,冷冻干燥得初级冻干粉；将初级冻干粉用水溶解后10000转离心10分钟,将上清液加载到sephadex g-25层析柱上,以0.2％甲酸水溶液洗脱,恒流泵控制流速为0.5ml/分钟,紫外检测器在280nm下检测,根据记录仪显示的紫外吸收合并收集的组分,将收集的组分进行双缩脲测定及茚三酮测定,收集的组分对应双缩脲和茚三酮测定均为阳性者确定为肽,冷冻干燥,得终级冻干粉。
16.第四个技术手段是提出了本发明的小龙虾虾壳的酶解的终级冻干粉的纯化方法,该方法的特征在于终级冻干粉用低压层析柱纯化,层析柱的固定相为粒径为1.8μm的高强度硅胶,纯化时低压柱的压力为0.1公斤,纯化时的流动相为0.2％-06％甲酸水溶液梯度洗脱,纯化时的流动相的流速为0.1ml-0.4ml/分钟,梯度洗脱时间为60分钟,收集的组分冷冻干燥,得纯化的冻干粉。
17.第五个技术手段是评价了所述寡肽族的舒血管活性及其在制备舒血管药物中的应用。
18.第六个技术手段是评价了所述寡肽族的抗炎活性，以及其在制备抗炎药物中的应用。
19.第七个技术手段是评价了所述寡肽族恢复损伤的睾丸功能的活性，以及其在制备恢复损伤的睾丸功能药物中的应用。
20.第八个技术手段是评价了所述寡肽族使血清细胞因子浓度提高的活性，以及其在制备提高血清细胞因子浓度的药物中的应用。
附图说明
21.图1用超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱测定的寡肽族的正离子流色谱。
22.图2用病理切片揭示的寡肽族对氢化可的松损伤的小鼠睾丸的治疗作用的对比
图。
23.图3寡肽族在hplc-tof-ms中12.600分钟的组分的tof-es-ms质谱图:(a)12.600分钟的组分的tof-es-ms质谱图全图；(b)lys碎片离子峰,质量数为130.1092；(c)lys-ser碎片离子峰,质量数为217.1381；(d)lys-ser-thr碎片离子峰,质量数为318.1918；(e)lys-ser-thr-cys分子离子峰,质量数为438.2019,即hplc-tof-ms中12.600分钟的组分为lys-ser-thr-cys。
24.图4寡肽族在hplc-tof-ms中12.977分钟的组分的tof-es-ms质谱图:(a)
25.12.977分钟的组分的tof-es-ms质谱图全图；(b)gly碎片离子峰,质量数为59.0407；(c)gly-ala碎片离子峰,质量数为130.0694；(d)gly-ala-asn分子离子峰,质量数为261.1237,即hplc-tof-ms中12.977分钟的组分为gly-ala-asn。
26.图5寡肽族在hplc-tof-ms中13.717分钟的组分的tof-es-ms质谱图:(a)
27.13.717分钟的组分的tof-es-ms质谱图全图；(b)met碎片离子峰,质量数为133.0580；(c)met-trp碎片离子峰,质量数为319.1345；(d)met-trp-ala分子离子峰,质量数为407.1775,即hplc-tof-ms中13.717分钟的组分为met-trp-ala。
28.图6寡肽族在hplc-tof-ms中14.734分钟的组分的tof-es-ms质谱图:(a)
29.14.734分钟的组分的tof-es-ms质谱图全图；(b)thr碎片离子峰,质量数为103.0577；(c)thr-ala碎片离子峰,质量数为174.0943；(d)thr-ala-val碎片峰,质量数为273.1646)；(e)thr-ala-val-lys分子离子峰,质量数为418.2608,即hplc-tof-ms中14.734分钟的组分为thr-ala-val-lys。
30.图7寡肽族在hplc-tof-ms中14.848分钟的组分的tof-es-ms质谱图:(a)
31.14.848分钟的组分的tof-es-ms质谱图全图；(b)glu碎片离子峰,质量数为131.0568；(c)glu-thr碎片离子峰,质量数为232.1025；(d)glu-thr-arg分子离子峰,质量数为405.2071,即hplc-tof-ms中14.848分钟的组分为glu-thr-arg。
32.图8寡肽族在hplc-tof-ms中15.332分钟的组分的tof-es-ms质谱图:(a)
33.15.332分钟的组分的tof-es-ms质谱图全图；(b)glu碎片离子峰,质量数为131.0568；(c)glu-trp碎片离子峰,质量数为317.1416；(d)glu-trp-ala分子离子峰,质量数为405.1720,即hplc-tof-ms中15.332分钟的组分为glu-trp-ala。
34.图9寡肽族在hplc-tof-ms中16.022分钟的组分的tof-es-ms质谱图:(a)
35.16.022分钟的组分的tof-es-ms质谱图全图；(b)tyr碎片离子峰,质量数为165.0751；(c)tyr-his碎片离子峰,质量数为302.1433；(d)tyr-his-lys分子离子峰,质量数为447.2290,即hplc-tof-ms中16.022分钟的组分为tyr-his-lys。
36.图10寡肽族在hplc-tof-ms中16.476分钟的组分的tof-es-ms质谱图:(a)
37.16.476分钟的组分的tof-es-ms质谱图全图；(b)his碎片离子峰,质量数为139.0754；(c)his-his碎片离子峰,质量数为276.1302；(d)his-his-val分子离子峰,质量数为392.2048,即hplc-tof-ms中16.476分钟的组分为his-his-val。
38.图11寡肽族在hplc-tof-ms中17.479分钟的组分的tof-es-ms质谱图:(a)
39.17.479分钟的组分的tof-es-ms质谱图全图；(b)thr碎片离子峰,质量数为103.0577；(c)thr-trp碎片离子峰,质量数为289.1388；(d)thr-trp-thr碎片离子峰,质量数为390.1848；(e)thr-trp-thr-his分子离子峰,质量数为544.2513,即hplc-tof-ms中
17.479分钟的组分为thr-trp-thr-his。
40.图12寡肽族在hplc-tof-ms中17.999分钟的组分的tof-es-ms质谱图:(a)
41.17.999分钟的组分的tof-es-ms质谱图全图；(b)asp碎片离子峰,质量数为117.0382；(c)asp-val碎片离子峰,质量数为216.1103；(d)asp-val-val分子离子峰,质量数为332.1848,即hplc-tof-ms中17.999分钟的组分为asp-val-val。
42.图13寡肽族在hplc-tof-ms中21.569分钟的组分的tof-es-m质谱图:(a)
43.21.569分钟的组分的tof-es-ms质谱图全图；(b)arg碎片离子峰,质量数为158.1125；(c)arg-gly碎片离子峰,质量数为215.1361；(d)arg-gly-gly碎片离子峰,质量数为272.1628；(e)arg-gly-gly-ser分子离子峰,质量数为376.1908,即hplc-tof-ms中21.569分钟的组分为arg-gly-gly-ser。
44.图14寡肽族在hplc-tof-ms中22.330分钟的组分的tof-es-ms质谱图:(a)
45.22.330分钟的组分的tof-es-ms质谱图全图；(b)asn碎片离子峰,质量数为116.0628；(c)asn-trp碎片离子峰,质量数为302.1357；(d)asn-trp-thr分子离子峰,质量数为420.1910,即hplc-tof-ms中22.330分钟的组分为asn-trp-thr。
46.图15寡肽族在hplc-tof-ms中23.667分钟的组分的tof-es-ms质谱图:(a)
47.23.667分钟的组分的tof-es-ms质谱图全图；(b)glu碎片离子峰,质量数为131.0618；(c)glu-tyr碎片离子峰,质量数为294.1251；(d)glu-tyr-trp分子离子峰,质量数为497.2038,即hplc-tof-ms中23.667分钟的组分为glu-tyr-trp。
48.图16寡肽族在hplc-tof-ms中24.264分钟的组分的tof-es-ms质谱图:(a)
49.24.264分钟的组分的tof-es-ms质谱图全图；(b)gln碎片离子峰,质量数为130.0694；(c)gln-phe碎片离子峰,质量数为277.1465；(d)gln-phe-cys碎片峰,质量数为380.1545；(e)gln-phe-cys-ser分子离子峰,质量数为484.1811,即hplc-tof-ms中24.264分钟的组分为gln-phe-cys-ser。
50.图17寡肽族在hplc-tof-ms中24.350分钟的组分的tof-es-ms质谱图:(a)
51.24.350分钟的组分的tof-es-ms质谱图全图；(b)gln碎片离子峰,质量数为130.0694；(c)gln-tyr碎片离子峰,质量数为293.1379；(d)gln-tyr-trp分子离子峰,质量数为496.211,即hplc-tof-ms中24.350分钟的组分为gln-tyr-trp。
52.图18寡肽族在hplc-tof-ms中24.407分钟的组分的tof-es-ms质谱图:(a)
53.24.407分钟的组分的tof-es-ms质谱图全图；(b)asp碎片离子峰,质量数为117.0429；(c)asp-tyr碎片离子峰,质量数为280.1043；(d)asp-tyr-trp的分子离子峰,质量数为483.1924,即hplc-tof-ms中24.407分钟的组分为asp-tyr-trp。
54.图19寡肽族在hplc-tof-ms中26.604分钟的组分的tof-es-ms质谱图:(a)
55.26.604分钟的组分的tof-es-ms质谱图全图；(b)val碎片离子峰,质量数为101.0823；(c)val-gly碎片离子峰,质量数为158.1015；(d)val-gly-ala碎片峰,质量数为229.1398；(e)val-gly-ala-thr分子离子峰,质量数为347.1944,即hplc-tof-ms中26.604分钟的组分为val-gly-ala-thr。
56.图20寡肽族在hplc-tof-ms中26.910分钟的组分的tof-es-ms质谱图:(a)
57.26.910分钟的组分的tof-es-ms质谱图全图；(b)pro碎片离子峰,质量数为99.0651；(c)pro-tyr碎片离子峰,质量数为262.1332；(d)pro-tyr-ser分子离子峰,质量数
为366.1595,即hplc-tof-ms中26.910分钟的组分为pro-tyr-ser。
58.图21arg-tyr-trp和trp-tyr-trp的液相合成路线:i)n-羟基苯并三唑,n-甲基马啉,二环己基羰二亚胺；ii)4n的氯化氢的无水乙酸乙酯溶液；iii)pd/c,氢气,4n的氯化氢的无水乙酸乙酯溶液。
具体实施方式
59.为了进一步阐述本发明,下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的,它们仅用来对本发明进行具体描述,不应当理解为对本发明的限制。
60.实施例1制备小龙虾虾壳的纯化的酶解产物
61.1将1000g新鲜小龙虾去肉,留虾虾壳,反复洗净,得到400g鲜虾壳；
62.2得到的400g鲜虾壳在烘箱中铺平,40℃烘4小时,小龙虾虾壳由灰色变红色,得到300g干虾壳；
63.3烘干的小龙虾虾壳在高速粉碎机中粉碎,过60目筛,得到290g粉末；
64.4人工胃液制备:根据2015版的中国药典提供的模拟胃液配方,量取16.4ml稀盐酸,加水约800ml制备稀盐酸水溶液,称取10g胃蛋白酶倒入稀盐酸水溶液,加蒸馏水摇匀稀释成1000ml人工胃液；
65.5称取5g干燥小龙虾虾壳粉末,加入200ml人工胃液,在37℃水浴上搅拌酶解4小时,期间产生大量气泡；
66.6搅拌下将nahco3粉末缓慢加到酶解液中,使酶解液的ph为7,猝灭酶解反应；
67.7酶解液于4℃及3000g离心15分钟,将上清液-80℃冷冻,24小时后冷冻干燥,得到2.6g淡黄色的初级冻干粉,收率52％；
68.8称取16g sephadex g-50,加1500ml蒸馏水,煮沸24小时,除去凝胶颗粒中的气泡并提高凝胶溶胀速度,然后冷却至室温；
69.9将溶胀好的sephadex g-50悬浮液缓缓倾入柱(2.6
×
60cm),静置1小时使柱内sephadex g-50的高度基本恒定,即sephadex g-50的沉降过程已结束；
70.10用约5倍柱体积水溶液平衡sephadex g-50的层析柱；
71.11称取16g sephadex g-25,加1500ml蒸馏水,煮沸24小时,除去凝胶颗粒中的气泡并提高凝胶溶胀速度,然后冷却至室温；
72.12将溶胀好的sephadex g-25悬浮液缓缓倾入柱(2.6
×
60cm),静置1小时使柱内sephadex g-25的高度基本恒定,即sephadex g-25的沉降过程已结束；
73.13用约5倍柱体积水溶液平衡sephadex g-25的层析柱；
74.14初级冻干粉的纯化:称取600mg初级冻干粉用水溶解后1000g离心10分钟,将上清液加载到sephadex g-50层析柱上,以0.2％甲酸水溶液作为缓冲液洗脱,恒流泵控制流速为0.5ml/分钟,紫外检测器在280nm下检测,根据记录仪显示的紫外吸收合并收集的组分,将收集的组分进行双缩脲测定及茚三酮测定,收集的组分对应双缩脲和茚三酮测定均为阳性者确定为肽,冷冻干燥得初级冻干粉；将初级冻干粉用水溶解后1000g离心10分钟,将上清液加载到sephadex g-25层析柱上,以0.2％甲酸水溶液作为缓冲液洗脱,恒流泵控制流速为0.5ml/分钟,紫外检测器在280nm下检测,根据记录仪显示的紫外吸收合并收集的组分,将收集的组分进行双缩脲测定及茚三酮测定,收集的组分对应双缩脲和茚三酮测定
均为阳性者确定为肽,冷冻干燥,得终级冻干粉；终级冻干粉用0.2％甲酸水溶液溶解,得到的溶液加载到硅胶层析柱上,硅胶层析柱的固定相为粒径为1.8μm的高强度硅胶,纯化时低压柱的压力为0.1公斤,纯化时的流动相为0.2％-0.6％甲酸水溶液梯度洗脱,纯化时的流动相的流速为0.1ml-0.4ml/分钟,梯度洗脱时间为60分钟,收集的组分冷冻干燥,得270mg纯化的冻干粉。
75.实施例2测定纯化的冻干粉的液-质测定
76.用超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱测定纯化的冻干粉的正离子流色谱及质谱,解析质谱,确认寡肽序列,质谱的检测器为esi-q-tof,正离子模式。具体操作为将20mg寡肽族溶解于1ml超纯水中,溶液于3000g离心15分钟,取上清进行uplc-qtof测定,测定时进样体积为2μl,pda检测器的检测波长为190nm至400nm。测定时色谱柱为waters,acquityhss t3柱(2.1
×
100mm i.d.,1.7μm)；流动相为0.2％甲酸水溶液和乙腈。采用该流动相,按表1的梯度洗色谱柱并记录正离子流色谱(见图1)。
77.表1流动相梯度表
[0078][0079][0080]
质谱测定时采用电喷雾离子源,正模式进行检测。样品分析之前采用甲酸钠对质谱仪进行质量轴校准。正离子模式参数:毛细管电压1000v,去溶剂气流速800l/h.温度450℃,源温度120℃,锥孔气流速50l/h,喷雾气压6bar,碎裂电压20-45v,取样锥电压40v,采集模式为ms
e continuum；分辨率模式:带电粒子的质量数与电荷数之比(m/z),数据采集范围50-1500,低能量通道trap碎裂电压6v,高能量通道trap碎裂电压选择梯度电压20-60v,选取le(亮氨酸脑啡肽)556.2771作为质量锁采集m/z,范围:100-1500。测定的tof-es-ms质谱见图3-图20。
[0081]
实施例3解析纯化的冻干粉的tof-es-ms质谱的寡肽序列
[0082]
本发明从n端到c端逐个计算tof-es-ms中的碎片离子的精确质量数,解析表2的寡肽族各时间点组分的质谱图:12.600分钟的组分的tof-es-ms质谱图中的lys碎片离子+h的理论值为130.1101,实测值为130.1092；lys-ser碎片离子+h的理论值为217.1421,实测值为217.1381；lys-ser-thr碎片离子+h的理论值为318.1898,实测值为318.1918；lys-ser-thr-cys分子离子+h的理论值为438.2017,实测值为438.2019。这样一来,碎片离子及分子离子构成了符合逻辑的证据链,支撑寡肽族在hplc-tof-ms中12.600分钟的组分为lys-ser-thr-cys。
[0083]
本发明从n端到c端逐个计算tof-es-ms中的碎片离子的精确质量数,解析表2的寡肽族各时间点组分的质谱图:12.977分钟的组分的tof-es-ms质谱图中的gly碎片离子+h的理论值为59.0366,实测值为59.0407；gly-ala碎片离子+h的理论值为130.0737,实测值为130.0694；gly-ala-asn分子离子+h的理论值为261.1193,实测值为261.1237。这样一来,碎
片离子及分子离子构成了符合逻辑的证据链,支撑寡肽族在hplc-tof-ms中12.977分钟的组分为gly-ala-asn。
[0084]
本发明从n端到c端逐个计算tof-es-ms中的碎片离子的精确质量数,解析表2的寡肽族各时间点组分的质谱图:13.717分钟的组分的tof-es-ms质谱图中的met碎片离子+h的理论值为133.0556,实测值为133.0580；met-trp碎片离子+h的理论值为319.1349,实测值为319.1345；met-trp-ala分子离子+h的理论值为407.1748,实测值为407.1775。这样一来,碎片离子及分子离子构成了符合逻辑的证据链,支撑寡肽族在hplc-tof-ms中13.717分钟的组分为met-trp-ala。
[0085]
本发明从n端到c端逐个计算tof-es-ms中的碎片离子的精确质量数,解析表2的寡肽族各时间点组分的质谱图:14.734分钟的组分的tof-es-ms质谱图中的thr碎片离子+h的理论值为103.0628,实测值为103.0577；thr-ala碎片离子+h的理论值为174.0999,实测值为174.0943)；thr-ala-val碎片离子+h的理论值为273.1683,实测值为273.1646；thr-ala-val-lys分子离子+h的理论值为418.2660,实测值为418.2608。这样一来,碎片离子及分子离子构成了符合逻辑的证据链,支撑寡肽族在hplc-tof-ms中14.734分钟的组分为thr-ala-val-lys。
[0086]
本发明从n端到c端逐个计算tof-es-ms中的碎片离子的精确质量数,解析表2的寡肽族各时间点组分的质谱图:14.848分钟的组分的tof-es-ms质谱图中的glu碎片离子+h的理论值为131.0577,实测值为131.0568；glu-thr碎片离子+h的理论值为232.1054,实测值为232.1025；glu-thr-arg分子离子+h的理论值为405.2092,实测值为405.2071。这样一来,碎片离子及分子离子构成了符合逻辑的证据链,支撑寡肽族在hplc-tof-ms中14.848分钟的组分为glu-thr-arg。
[0087]
本发明从n端到c端逐个计算tof-es-ms中的碎片离子的精确质量数,解析表2的寡肽族各时间点组分的质谱图:15.332分钟的组分的tof-es-ms质谱图中的glu碎片离子+h的理论值为131.0577,实测值为131.0568；glu-trp碎片离子+h的理论值为317.1370,实测值为317.1416；glu-trp-ala分子离子+h的理论值为405.1769,实测值为405.1720。这样一来,碎片离子及分子离子构成了符合逻辑的证据链,支撑寡肽族在hplc-tof-ms中15.332分钟的组分为glu-trp-ala。
[0088]
本发明从n端到c端逐个计算tof-es-ms中的碎片离子的精确质量数,解析表2的寡肽族各时间点组分的质谱图:16.022分钟的组分的tof-es-ms质谱图中的tyr碎片离子+h的理论值为165.0784,实测值为165.0751；tyr-his碎片离子+h的理论值为302.13731,实测值为302.1433；tyr-his-lys分子离子+h的理论值为447.2350,实测值为447.2290。这样一来,碎片离子及分子离子构成了符合逻辑的证据链,支撑寡肽族在hplc-tof-ms中16.022分钟的组分为tyr-his-lys。
[0089]
本发明从n端到c端逐个计算tof-es-ms中的碎片离子的精确质量数,解析表2的寡肽族各时间点组分的质谱图:16.476分钟的组分的tof-es-ms质谱图中的his碎片离子+h的理论值为139.074,实测值为139.0754；his-his碎片离子+h的理论值为276.1329,实测值为276.1302；his-his-val分子离子+h的理论值为392.2041,实测值为392.2048。这样一来,碎片离子及分子离子构成了符合逻辑的证据链,支撑寡肽族在hplc-tof-ms中16.476分钟的组分为his-his-val。
[0090]
本发明从n端到c端逐个计算tof-es-ms中的碎片离子的精确质量数,解析表2的寡肽族各时间点组分的质谱图:17.479分钟的组分的tof-es-ms质谱图中的thr碎片离子+h的理论值为103.0628,实测值为103.0577；thr-trp碎片离子+h的理论值为289.1421,实测值为289.1388；thr-trp-thr碎片离子+h的理论值为390.1898,实测值为390.1848；thr-trp-thr-his分子离子+h的理论值为544.2514,实测值为544.2513。这样一来,碎片离子及分子离子构成了符合逻辑的证据链,支撑寡肽族在hplc-tof-ms中17.479分钟的组分为thr-trp-thr-his。
[0091]
本发明从n端到c端逐个计算tof-es-ms中的碎片离子的精确质量数,解析表2的寡肽族各时间点组分的质谱图:17.999分钟的组分的tof-es-ms质谱图中的asp碎片离子+h的理论值为117.042,实测值为117.0382；asp-val碎片离子+h的理论值为216.1104,实测值为216.1103；asp-val-val分子离子+h的理论值为332.1816,实测值为332.1848。这样一来,碎片离子及分子离子构成了符合逻辑的证据链,支撑寡肽族在hplc-tof-ms中17.999分钟的组分为asp-val-val。
[0092]
本发明从n端到c端逐个计算tof-es-ms中的碎片离子的精确质量数,解析表2的寡肽族各时间点组分的质谱图:21.569分钟的组分的tof-es-ms质谱图中的arg碎片离子+h的理论值为158.1162,实测值为158.1125；arg-gly碎片离子+h的理论值为215.1377,实测值为215.1361；arg-gly-gly碎片离子+h的理论值为272.1592,实测值为272.1628；arg-gly-gly-ser分子离子+h的理论值为376.1939,实测值为376.1908。这样一来,碎片离子及分子离子构成了符合逻辑的证据链,支撑寡肽族在hplc-tof-ms中21.569分钟的组分为arg-gly-gly-ser。
[0093]
本发明从n端到c端逐个计算tof-es-ms中的碎片离子的精确质量数,解析表2的寡肽族各时间点组分的质谱图:22.330分钟的组分的tof-es-ms质谱图中的asn碎片离子+h的理论值为116.058,实测值为116.0628；asn-trp碎片离子+h的理论值为302.1373,实测值为302.1357；asn-trp-thr分子离子+h的理论值为420.1878,实测值为420.1910。这样一来,碎片离子及分子离子构成了符合逻辑的证据链,支撑寡肽族在hplc-tof-ms中22.330分钟的组分为asn-trp-thr。
[0094]
本发明从n端到c端逐个计算tof-es-ms中的碎片离子的精确质量数,解析表2的寡肽族各时间点组分的质谱图:23.667分钟的组分的tof-es-ms质谱图中的glu碎片离子+h的理论值为131.0577,实测值为131.0618；glu-tyr碎片离子+h的理论值为294.1210,实测值为294.1251；glu-tyr-trp分子离子+h的理论值为497.2031,实测值为497.2038。这样一来,碎片离子及分子离子构成了符合逻辑的证据链,支撑寡肽族在hplc-tof-ms中23.667分钟的组分为glu-tyr-trp。
[0095]
本发明从n端到c端逐个计算tof-es-ms中的碎片离子的精确质量数,解析表2的寡肽族各时间点组分的质谱图:24.264分钟的组分的tof-es-ms质谱图中的gln碎片离子+h的理论值为130.0737,实测值为130.0694；gln-phe碎片离子+h的理论值为277.1421,实测值为277.1465；gln-phe-cys碎片离子+h的理论值为380.1513,实测值为380.1545；gln-phe-cys-ser分子离子+h的理论值为484.186,实测值为484.1811。这样一来,碎片离子及分子离子构成了符合逻辑的证据链,支撑寡肽族在hplc-tof-ms中24.264分钟的组分为gln-phe-cys-ser。
[0096]
本发明从n端到c端逐个计算tof-es-ms中的碎片离子的精确质量数,解析表2的寡肽族各时间点组分的质谱图:24.350分钟的组分的tof-es-ms质谱图中的gln碎片离子+h的理论值为130.0737,实测值为130.0694；gln-tyr碎片离子+h的理论值为293.1369,实测值为293.1379；gln-tyr-trp分子离子+h的理论值为496.2190,实测值为496.211。这样一来,碎片离子及分子离子构成了符合逻辑的证据链,支撑寡肽族在hplc-tof-ms中24.350分钟的组分为gln-tyr-trp。
[0097]
本发明从n端到c端逐个计算tof-es-ms中的碎片离子的精确质量数,解析表2的寡肽族各时间点组分的质谱图:24.407分钟的组分的tof-es-ms质谱图中的asp碎片离子+h的理论值为117.042,实测值为117.0429；asp-tyr碎片离子+h的理论值为280.1052,实测值为280.1043；asp-tyr-trp分子离子+h的理论值为483.1873,实测值为483.1924。这样一来,碎片离子及分子离子构成了符合逻辑的证据链,支撑寡肽族在hplc-tof-ms中24.407分钟的组分为asp-tyr-trp。
[0098]
本发明从n端到c端逐个计算tof-es-ms中的碎片离子的精确质量数,解析表2的寡肽族各时间点组分的质谱图:26.604分钟的组分的tof-es-ms质谱图中的val碎片离子+h的理论值为101.0835,实测值为101.0823；val-gly碎片离子+h的理论值为158.1050,实测值为158.1015；val-gly-ala碎片离子+h的理论值为229.1421,实测值为229.1398；val-gly-ala-thr分子离子+h的理论值为347.1925,实测值为347.1944。这样一来,碎片离子及分子离子构成了符合逻辑的证据链,支撑寡肽族在hplc-tof-ms中26.604分钟的组分为val-gly-ala-thr。
[0099]
本发明从n端到c端逐个计算tof-es-ms中的碎片离子的精确质量数,解析表2的寡肽族各时间点组分的质谱图:26.910分钟的组分的tof-es-ms质谱图中的pro碎片离子+h的理论值为99.0679,实测值为99.0651；pro-tyr碎片离子+h的理论值为262.1284,实测值为262.1332；pro-tyr-ser分子离子+h的理论值为366.1631,实测值为366.1595。这样一来,碎片离子及分子离子构成了符合逻辑的证据链,支撑寡肽族在hplc-tof-ms中26.910分钟的组分为pro-tyr-ser。
[0100]
18个寡肽序列的文字见正文。解析34个寡肽序列的tof-es(+)-ms质谱图见图3至图20。有必要说明,酶解产物含18种寡肽,正文把酶解产物的18种寡肽称为寡肽族。
[0101]
按照上述描述解析的18个时间点的寡肽序列及精确质量数见表2。与图1的对正离子流中峰的峰面积及百分含量见表3。
[0102]
表2对应于正离子流中峰的保留时间的寡肽序列及质量数
[0103]
[0104][0105]
表3对应于正离子流色谱中峰的峰面积及寡肽百分含量
[0106]
峰号保留时间序列峰面积百分含量112.600lys-ser-thr-cys270092.52％212.977gly-ala-asn463394.41％313.717met-trp-ala206821.93％414.734thr-ala-val-lys19234217.93％514.848glu-thr-arg848137.91％615.332glu-trp-ala424793.96％716.022tyr-his-lys189571.76％816.476his-his-val109301.02％917.479thr-trp-thr-his52080.49％1017.999asp-val-val521324.87％1121.569arg-gly-gly-ser31103429.01％1222.330asn-trp-thr666866.22％1323.667glu-tyr-trp166161.54％1424.264gln-phe-cys-ser731626.83％1524.350gln-tyr-trp535444.99％1624.407asp-tyr-trp164711.53％1726.604val-gly-ala-thr165711.54％1826.910pro-tyr-ser167711.57％
[0107]
实施例4评价寡肽族的抗炎作用
[0108]
正如知道的那样,抑制急性炎症反应可阻断许多重要疾病发病。为此,本文描述二甲苯引起的小鼠耳肿胀急性炎症模型。icr雄性小鼠(体重22
±
3g)在温度为25℃的环境静息2天,自由饮水和进食。之后,小鼠随机分为阳性对照组,阴性对照组及寡肽族组。阿司匹林被公认是治疗急性炎症的临床用药,评价时选择阿司匹林为阳性对照药。阿司匹林不溶于水,口服时将阿司匹林悬浮于5
‰
cmc-na中(剂量为167μmol/kg,10只小鼠)。于是,5
‰
cmc-na为阴性对照(剂量为10ml/kg,10只小鼠)。同样,寡肽族也悬浮于5
‰
cmc-na中(0.5mg/kg,10只小鼠)。按双盲和序贯原则给予小鼠cmc-na,或阿司匹林,或寡肽族。给药30分钟后,往小鼠的左耳廓均匀涂抹30μl二甲苯,2小时后小鼠用乙醚麻醉,断颈椎处死,剪下左右两耳,用7毫米打孔器在两耳的相同位置取圆形耳片,称重,两耳重量差作为肿胀度。即肿胀度＝左耳圆片重量
–
右耳圆片重量。用microsoft word excel程序对各组小鼠的耳肿胀度进行统计处理,得出均值及标准差。组间比较,得t值。
[0109]
表4的数据表明,在二甲苯诱发的小鼠耳肿胀模型上0.5mg/kg口服剂量的寡肽族有优秀的抗炎活性(与cmc-na比p《0.01)。表4的数据还表明,在二甲苯诱发的小鼠耳肿胀模型上0.5mg/kg口服剂量的寡肽族的抗炎活性与服剂量为167μmol/kg口服剂量的阿司匹林的抗炎活性无显著性差异(p》0.05)。
[0110]
表4寡肽族对二甲苯诱发的小鼠耳肿胀度的影响
[0111]
治疗剂口服剂量耳肿胀度,均值
±
sdmgcmc-na10ml/kg6.51
±
1.98阿司匹林167μmol/kg4.08
±
2.85a寡肽族0.5mg/kg3.02
±
2.10b[0112]
a)与cmc-na比p《0.05；与阿司匹林比p》0.05；b)与cmc-na比p《0.01,与阿司匹林比p》0.05；n＝12
[0113]
实施例5评价寡肽族恢复氢化可的松损伤的睾丸功能的活性
[0114]
促进睾丸发育对男性健康至关重要。为此,本发明评价了寡肽族对睾丸发育的影响。评价时6周龄icr雄性小鼠(12g-14g)口服氢化可的松(剂量为69μmol/kg/天,1天1次,连续16天),伤害睾丸发育。之后,小鼠随机分组。小鼠或口服cmc-na(剂量为10ml/kg/天,16只小鼠,1天1次,连续10天,16只小鼠)或寡肽族(剂量为5mg/kg/天,1天1次,连续10天,16只小鼠)。此外,还有16只6周龄icr雄性小鼠(12g-14g)口服cmc-na,1天1次,连续26天作为正常发育的睾丸对照。第27天小鼠眼眶取血,用于酶联免疫测定。小鼠乙醚麻醉,断颈椎处死,取睾丸。睾丸用4％组织固定液固定24小时,然后脱水,石蜡包埋,切片,he染色,最终得到睾丸的病理切片。
[0115]
图2的病理切片表明,正常发育的睾丸间质中分布着圆形的胞浆噬伊红的间质细胞；在氢化可的松损伤的小鼠睾丸模型上,氢化可的松损伤睾丸间质几乎没有圆形的胞浆噬伊红的间质细胞。图2进一步表明,在氢化可的松损伤的小鼠睾丸模型上,寡肽族使氢化可的松损伤的睾丸间质回复正常,睾丸间质中又分布着圆形的胞浆噬伊红的间质细胞。
[0116]
图2的小鼠睾丸的精曲小管表明,在正常发育的精曲小管中发育成熟的长形精子细胞成双成对分布在生精上皮表面,氢化可的松导致的精曲小管发育异常使得其中既没有发育成熟的长形精子细胞成双成对分布在生精上皮表面,寡肽族使氢化可的松损伤的精曲小管恢复正常使得又有发育成熟的长形精子细胞成双成对分布在生精上皮表面。图2的小鼠睾丸的精曲小管表明,正常精曲小管中既有发育成熟的长形精子细胞成双成对分布在生精上皮表面,也有接近发育成熟的长形精子细胞单个分布在生精上皮表面,还有发育阶段的圆形精子细胞分布在腔面下；氢化可的松导致的精曲小管发育异常使得其中既没有发育成熟的长形精子细胞成双成对分布在生精上皮表面,也没有接近发育成熟的长形精子细胞单个分布在生精上皮表面,还没有发育阶段的圆形精子细胞分布在腔面下；寡肽族对氢化
可的松导致的精曲小管发育异常有治疗作用使得其中既有发育成熟的长形精子细胞成双成对分布在生精上皮表面,也有接近发育成熟的长形精子细胞单个分布在生精上皮表面,还有发育阶段的圆形精子细胞分布在腔面下。总之,对于促进进睾丸发育寡肽族有优秀的活性。
[0117]
实施例6评价寡肽族对血清细胞因子浓度的影响
[0118]
氢化可的松损伤睾丸修复评价的小鼠第27天眼眶取得的血于4℃加入浓度为3.8％(g/100ml)枸橼酸钠的生理盐水溶液(v/v＝9:1),3000g离心15分钟,然后吸取上清液作为il-2,il-6,il-8和tnf-α酶联免疫测定样本。氢化可的松损伤睾丸修复评价的小鼠第27天取得的睾丸于4℃制备匀浆,3000g离心15分钟,然后吸取上清液作为il-2,il-6,il-8和tnf-α酶联免疫测定样本。
[0119]
elisa法定量测定血清样本或匀浆样本中il-2,il-6,il-8和tnf-α时,用纯化的il-2,il-6,il-8和tnf-α抗体包被微孔板。按照elisa试剂盒的方法实施操作,即向包被单抗的微孔中依次加入标准品或cmc-na治疗的氢化可的松损伤的小鼠的血清样本或匀浆样本或寡肽族治疗的氢化可的松损伤的小鼠的血清样本或匀浆样本,加生物素化的il-2,il-6,il-8和tnf-α抗体,以及辣根过氧化物酶标记的亲和素。然后,彻底的洗涤微孔板并加底物tmb显色。显色时,先看到过氧化物酶作用诱发的蓝色,后看到在酸作用下蓝色转为黄色。黄色的深度与样本中il-2,il-6,il-8和tnf-α的浓度正相关。在450nm的波长下用酶标仪测定标准品的吸光度(od),绘制标准曲线。在450nm的波长下用酶标仪测定cmc-na治疗的氢化可的松损伤的小鼠的血清样本或匀浆样本或寡肽族治疗的氢化可的松损伤的小鼠的血清样本或匀浆样本的吸光度(od),通过标准曲线计算cmc-na治疗的氢化可的松损伤的小鼠的血清样本或匀浆样本或寡肽族治疗的氢化可的松损伤的小鼠的血清样本或匀浆样本的il-2,il-6,il-8和tnf-α的浓度。每个样本重复6次。
[0120]
表5的数据表明,酶联免疫测定揭示氢化可的松导致损伤小鼠血清il-2,il-6,il-8和tnf-α浓度降低(与健康小鼠比p《0.01),口服寡肽族使氢化可的松损伤小鼠血清il-2,il-6,il-8和tnf-α浓度恢复到健康小鼠水平(与健康小鼠比p》0.05)。
[0121]
表5寡肽族对氢化可的松损伤小鼠血清细胞因子浓度的影响
[0122][0123]
a)与健康小鼠比p《0.01；b)与健康小鼠比p《0.01；c)与健康小鼠比p《0.01；d)与健康小鼠比p》0.05；e)与健康小鼠比p》0.05；f)与健康小鼠比p》0.05；g)与健康小鼠比p《0.01；h)与健康小鼠比p》0.05；n＝16.
[0124]
实施例7评价寡肽族的舒血管活性
[0125]
评价时sd大鼠先用乙醚麻醉以便断其颈椎处死,然后开胸腔取大鼠的胸主动脉,最后将大鼠的胸主动脉剪成2mm长的胸主动脉环。制得的大鼠胸主动脉环应置于通氧的k-h缓冲液中使保持活力。
[0126]
去甲肾上腺素被公认为血管收缩剂,乙酰胆碱被公认为血管舒张剂。评价寡肽族
的血管舒张活性时,用去甲肾上腺素(终浓度为20μg/ml)诱发大鼠胸主动脉环收缩,用乙酰胆碱(终浓度为2μg/ml)作为阳性对照。寡肽族为治疗剂(提供一系列终浓度例如50μg/ml,100μg/ml,150μg/ml和200μg/ml)。
[0127]
评价中,开启生理二道仪(运行软件为m3000),打开育槽的循环水,育槽里注k-h缓冲液并通氧。设置张力换能器并定标。将大鼠胸主动脉环挂到张力换能器上,张力换能器慢慢下降,大鼠胸主动脉环跟随下降的张力换能器慢慢浸泡于育槽的k-h缓冲液中,大鼠胸主动脉环的张力稳定于基线后,育槽里加20μl去甲肾上腺素水溶液使大鼠胸主动脉环收缩。大鼠胸主动脉环的张力稳定在高水平后,张力换能器慢慢上升,用k-h缓冲液轻轻洗净附着在大鼠胸主动脉环上的去甲肾上腺素,更换育槽里的用k-h缓冲液,张力换能器慢慢下降,大鼠胸主动脉环跟随下降的张力换能器慢慢浸泡于育槽的k-h缓冲液中。育槽或加20μl乙酰胆碱水溶液,或加20μl寡肽族水溶液,张力稳定后计算大鼠胸主动脉环张力降低值,即计算乙酰胆碱或寡肽族对去甲肾上腺素引起的大鼠胸主动脉环收缩的拮抗作用。
[0128]
按照上述操作,每个浓度乙酰胆碱或寡肽族重复测定6次,取平均并换算为张力降低。用microsoft word excel程序对各组大鼠胸主动脉环张力降低值进行统计处理,得出均值及标准差并做t检验。
[0129]
表6的数据表明,在大鼠胸主动脉条舒张模型上,浓度为15mg/ml的寡肽族对去甲肾上腺素收缩的大鼠胸主动脉条有优秀的舒张活性(与k-h缓冲液比p《0.01)。对于舒张血管,寡肽族有意想不到的技术效果。
[0130]
表6寡肽族舒张胸主动脉条的活性
[0131]
治疗剂浓度舒张率,均值
±
sd％k-h缓冲液 0.35
±
0.11乙酰胆碱2mg/ml95.40
±
3.72寡肽族15mg/ml56.36
±
10.67a[0132]
a)与k-h缓冲液比p《0.01；n＝6
[0133]
实施例8合成gln-tyr-trp
[0134]
按照图21的合成路线本发明液相合成了gln-tyr-trp。合成中采用了以下操作。1制备boc-tyr-trp-obzl
[0135]
室温将boc-tyr(20.00g,71.17mmol)和n-羟基苯并三唑(hobt,9.60g,71.17mmol)溶于无水四氢呋喃,0℃下用n-甲基马啉调节ph值到8-9,并向反应混合物中加二环己基羰二亚胺(dcc,14.66g,71.17mmol)的无水四氢呋喃溶液,搅拌20分钟并有大量二环己基脲析出。之后向反应混合物加入trp-obzl(23.25g,59.31mmol)。30分钟后室温搅拌12小时。滤去二环己基脲,滤液减压浓缩。得到的黄色粘稠液体用300ml乙酸乙酯溶解,然后依次用饱和碳酸氢钠水溶液洗(200ml
×
3),饱和食盐水溶液洗(200ml
×
2),5％khso4水溶液洗(200ml
×
3),饱和食盐水溶液洗(200ml
×
2)洗涤,用无水硫酸钠干燥12小时,过滤,滤液减压浓缩。得到的黄色残留物用乙醚反复洗,得36.473g(92％)目标物,为淡黄色固体,不经过柱层析分离直接用于下步反应。esi-ms(m/e):558.[m+h]
+
。
[0136]
2制备tyr-trp-obzl
[0137]
将boc-tyr-trp-obzl(5g,9mmol)溶于100ml浓度为4n的氯化氢的无水乙酸乙酯溶液,0℃搅拌50分钟。向反应混合物加入无水乙醚,减压浓缩,直至氯化氢气完全抽净。得
4.2g(95％)目标物,为无色固体,直接用于下一步反应。esi
+-ms(m/e):458[m+h]
+
。
[0138]
3制备gln-tyr-trp
[0139]
将boc-gln-tyr-trp-obzl(500mg,71μmol)溶于甲醇,加入75mgpd/c,通入氢气,氢解48小时。滤除pd/c,减压浓缩除去甲醇,得到的棕红色粉末用乙醚磨洗(30ml
×
3)。0℃下将磨洗后的粉末溶解于5ml氯化氢的无水乙酸乙酯溶液,搅拌2小时,加入石油醚析出322mg gln-tyr-trp(83％),为淡黄色粉末。rf值:0.6(meoh:chcl3＝1:1)；mp:128-130℃；[
ɑ
]
d25
＝31.5(c＝1.08,ch3oh)；esi-ms(m/e):496[m+h]
+
；ir(kbr):υ＝3302,3194,3057,2929,2854,2821,1715,1654,1649,1516,1452,1419,1340,1232,1105,1010,829,746cm-1
；1h-nmr(500hz,dmso-d6):δppm＝10.88(s,1h),9.18(s,1h),8.26(d,j＝7.7hz,1h),7.95(d,j＝8.8hz,1h),7.77(s,1h),7.55(d,j＝7.5hz,1h),7.33(d,j＝7.5hz,1h),7.17(s,2h),7.08(t,j＝7.4hz,2h),7.00(m,3h),6.58(d,j＝8.4hz,2h),4.50(m,2h),3.20(dd,j＝5.0hz,j＝15.0hz,2h),3.09(dd,j＝7.8hz,j＝15.0hz,1h),2.92(dd,j＝5.0hz,j＝15.0hz,1h),2.68(dd,j＝7.8hz,j＝15.0hz,1h),2.02(m,1h)；
13
c-nmr(125hz,dmso-d6):δppm＝177.8,174.4,173.5,172.6,156.2,136.57,130.5,128.1,128.0,127.7,124.0,121.3,118.8,118.6,115.4,115.3,111.8,110.1,56.5,54.4,53.4,37.1,33.8,31.1,31.0。
[0140]
实施例9合成asp-tyr-trp
[0141]
按照图21的合成路线本发明液相合成了asp-tyr-trp。合成中采用了以下操作。1制备boc-tyr-trp-obzl
[0142]
采用实施例8的操作从boc-tyr(20.00g,71.17mmol)和trp-obzl(23.25g,59.31mmol)得36.473g(92％)目标物,为淡黄色固体,不经过柱层析分离直接用于下步反应。esi-ms(m/e):558.[m+h]
+
。
[0143]
2制备tyr-trp-obzl
[0144]
将boc-tyr-trp-obzl(5g,9mmol)溶于100ml浓度为4n的氯化氢的无水乙酸乙酯溶液,0℃搅拌50分钟。向反应混合物加入无水乙醚,减压浓缩,直至氯化氢气完全抽净。得4.2g(95％)目标物,为无色固体,直接用于下一步反应。esi-ms(m/e):458[m+h]
+
。
[0145]
3制备boc-asp-tyr-trp-obzl
[0146]
采用实施例8的方法从403mgboc-asp(2.13mmol)和1.0g tyr-trp-obzl(2.07mmol)得到870mg(79％)目标物,为黄色固体。esi-ms(m/e):763[m+h]
+
。
[0147]
4制备asp-tyr-trp
[0148]
采用实施例8的方法从boc-asp-tyr-trp-obzl(500mg,0.66mmol)得到100mg(60％)目标物,为黄色固体。rf值:0.4(meoh:chcl3＝1:1)；mp:189-191℃；[
ɑ
]
d25
＝38.7(c＝1.08,ch3oh)；esi
+-ms(m/e):483[m+h]
+
；ir(kbr):υ＝3442,3300,3249,2926,1690,1647,1600,1527,1456,1396,1242,1165,1107,827,748；1h-nmr(500hz,dmso-d6):δppm＝10.83(s,1h),8.35(d,j＝8.0hz,1h),7.98(d,j＝7.5hz,1h),7.56(d,j＝7.5hz,1h),7.32(d,j＝7.5hz,1h),7.19(s,1h),7.03(m,4h),6.62(d,j＝8.4hz,2h),4.34(m,2h),3.72(m,1h),3.22(m,4h),2.77(d,j＝6.5hz,2h),2.09(s,1h)；
13
c-nmr(75hz,dmso-d6):δppm＝171.1,156.1,136.5,130.2,129.0,128.2,123.9,120.9,118.9,118.4,115.4,111.6,56.5,55.5,52.7,45.9,36.6,28.7。
[0149]
实施例10合成glu-tyr-trp
[0150]
按照图21的合成路线本发明液相合成了glu-tyr-trp。合成中采用了以下操作。1制备boc-tyr-trp-obzl
[0151]
采用实施例8的方法从boc-tyr(20.00g,71.17mmol)和trp-obzl(23.25g,59.31mmol)得36.473g(92％)目标物,为淡黄色固体,不经过柱层析分离直接用于下步反应。esi-ms(m/e):558.[m+h]
+
。
[0152]
2制备tyr-trp-obzl
[0153]
采用实施例8的方法从boc-tyr-trp-obzl(5g,9mmol)得4.2g(95％)目标物,为无色固体,直接用于下一步反应。esi-ms(m/e):458[m+h]
+
。
[0154]
3制备boc-glu-tyr-trp-obzl
[0155]
采用实施例8的方法从403mg boc-glu(2.13mmol)和1.0g tyr-trp-obzl(2.07mmol)得到760mg(79％)目标物,为无色固体。esi-ms(m/e):777[m+h]
+
。
[0156]
4制备glu-tyr-trp
[0157]
采用实施例8的方法从500mg boc-glu(obzl)-tyr-trp-obzl(0.64mmol)得242mg(88％)目标物,为淡黄色固体。rf值:0.4(meoh:chcl3＝1:1)；mp:154-155℃；[
ɑ
]
d25
＝52.6(c＝1.05,ch3oh)；esi
+-ms(m/e):497[m+h]
+
；ir(kbr):υ＝3432,3300,2926,1710,1651,1600,1516,1436,1396,1232,1174,1107,819,748cm-1
；1h-nmr(300hz,dmso-d6):δppm＝10.87(s,1h),9.24(s,2h),8.57(d,j＝8hz,1h),8.47(d,j＝7.5hz,1h),7.55(d,j＝7.5hz,1h),7.35(d,j＝7.5hz,1h),7.18(s,1h),7.08(m,4h),6.65(d,j＝8.4hz,2h),4.50(m,2h),3.74(m,1h),2.98(m,2h),2.75(m,2h),2.40(d,j＝7hz,2h),2.10(s,1h),1.98(m,2h)；
13
c-nmr(75hz,dmso-d6):δppm＝174.0,173.5,171.3,168.7,156.3,136.5,130.5,128.0,127.7,124.1,121.3,118.8,115.4,111.8,110.0,55.0,53.5,51.9,36.8,29.6,27.5,27.0。
[0158]
实施例11评价glu-tyr-trp,asp-tyr-trp和gln-tyr-trp的抗炎活性
[0159]
为了展示寡肽族的优越性,本发明比较了寡肽族与glu-tyr-trp,asp-tyr-trp和gln-tyr-trp的抗炎活性。比较时本发明采用了二甲苯引起的小鼠耳肿胀急性炎症模型。icr雄性小鼠(体重22
±
3g)在温度为25℃的环境静息2天,自由饮水和进食。之后,小鼠随机分为阳性对照组,阴性对照组及寡肽族组。阿司匹林被公认是治疗急性炎症的临床用药,评价时选择阿司匹林为阳性对照药。阿司匹林不溶于水,口服时将阿司匹林悬浮于5
‰
cmc-na中(剂量为1110μmol/kg,10只小鼠)。于是,5
‰
cmc-na为阴性对照(剂量为10ml/kg,10只小鼠)。同样,glu-tyr-trp,asp-tyr-trp或者gln-tyr-trp也悬浮于5
‰
cmc-na中(5mg/kg,10只小鼠)。寡肽族也悬浮于5
‰
cmc-na中(0.5mg/kg,10只小鼠)。按双盲和序贯原则给予小鼠cmc-na,或阿司匹林,或glu-tyr-trp,或asp-tyr-trp,或gln-tyr-trp,或寡肽族。给药30分钟后,往小鼠的左耳廓均匀涂抹30μl二甲苯,2小时后小鼠用乙醚麻醉,断颈椎处死,剪下左右两耳,用7毫米打孔器在两耳的相同位置取圆形耳片,称重,两耳重量差作为肿胀度。即肿胀度＝左耳圆片重量
–
右耳圆片重量。用microsoft word excel程序对各组小鼠的耳肿胀度进行统计处理,得出均值及标准差。组间比较,得t值。
[0160]
表9的数据表明,在二甲苯诱发的小鼠耳肿胀模型上5mg/kg口服剂量的glu-tyr-trp,asp-tyr-trp和gln-tyr-trp有优秀的抗炎活性(与cmc-na比p《0.01,与口服剂量为167μmol/kg的阳性对照阿司匹林比p》0.05)。表9的数据还表明,5mg/kg口服剂量的glu-tyr-trp,asp-tyr-trp和gln-tyr-trp的抗炎活性显著性弱于寡肽族的抗炎活性(p《0.01)。在口
服剂量只有glu-tyr-trp,asp-tyr-trp或者gln-tyr-trp的1/10口服剂量时,寡肽族仍然显示更强的抗炎活性。这种现象不仅表明寡肽族有意想不到的技术效果,而且表明由18种按照所述百分含量构成的寡肽配方的合理性。本发明有意想不到的技术效果。
[0161]
表9寡肽族及寡肽对二甲苯诱发的小鼠耳肿胀度的影响
[0162]
治疗剂口服剂量耳肿胀度,均值
±
sdmgcmc-na10ml/kg7.51
±
1.55阿司匹林167μmol/kg5.12
±
0.45gln-tyr-trp5mg/kg5.02
±
0.42aglu-tyr-trp5mg/kg5.22
±
0.44aasp-tyr-trp5mg/kg5.01
±
0.42a寡肽族0.5mg/kg3.48
±
0.46
[0163]
a)与cmc-na及寡肽族比p《0.01,与阿司匹林比p》0.05；n＝10。

技术特征：
1.一种从小龙虾虾壳中提取的寡肽族，其特征在于，所述寡肽族包含18种寡肽序列，所述的18种寡肽序列为lys-ser-thr-cys；gly-ala-asn；met-trp-ala；thr-ala-val-lys；glu-thr-arg；glu-trp-ala；tyr-his-lys；his-his-val；thr-trp-thr-his；asp-val-val；arg-gly-gly-ser；asn-trp-thr；glu-tyr-trp；gln-phe-cys-ser；gln-tyr-trp；asp-tyr-trp；val-gly-ala-thr和pro-tyr-ser。2.权利要求1所述的一种从小龙虾虾壳中提取的寡肽族，其特征在于，所述寡肽族的18种寡肽序列的百分比含量为：lys-ser-thr-cys,2.52％；gly-ala-asn,4.41％；met-trp-ala,1.93％；thr-ala-val-lys,17.93％；glu-thr-arg,7.91％；glu-trp-ala,3.96％；tyr-his-lys,1.76％；his-his-val,1.02％；thr-trp-thr-his,0.49％；asp-val-val,4.87％；arg-gly-gly-ser,29.01％；asn-trp-thr,6.22％；glu-tyr-trp,1.54％；gln-phe-cys-ser,6.83％；gln-tyr-trp,4.99％；asp-tyr-trp,1.53％；val-gly-ala-thr,1.54％和pro-tyr-ser,1.57％。3.制备权利要求1或2所述的寡肽族的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤:(1)将小龙虾虾壳经过洗净、烘干、粉碎，得到小龙虾虾壳粉末；(2)取小龙虾壳粉末加入人工胃液，搅拌酶解4-6小时,加入nahco3粉末到酶解液中，猝灭酶解反应；(3)将酶解液离心,将上清液冷冻后冷冻干燥,得到冻干粉；(4)将溶胀好的sephadex g-50悬浮液倾入柱,静置沉降使柱内sephadex g-50的高度恒定；(5)将溶胀好的sephadex g-25悬浮液倾入柱,静置沉降使柱内sephadex g-25的高度恒定；(6)将冻干粉用水溶解后离心,将上清液加载到sephadex g-50层析柱上,以甲酸水溶液洗脱,恒流泵控制流速,紫外检测器检测,收集的组分确定为肽,冷冻干燥得初级冻干粉；(7)将初级冻干粉,用水溶解后离心加载到sephadex g-25层析柱上,以甲酸水溶液洗脱,恒流泵控制流速,紫外检测器检测，收集的组分冷冻干燥,得终级级冻干粉。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2所述的酶解为在37℃下搅拌酶解，所述的加入nahco3粉末到酶解液中，使酶解液的ph为7；步骤3所述的酶解液于4℃及3000g离心10-15分钟,所述的上清液-80℃冷冻,24小时后干燥,得到初级冻干粉；步骤6-7所述的离心转速为10000g离心10-15分钟，所述的甲酸水溶液用量为0.1％，所述恒流泵控制流速为0.5ml/分钟。5.权利要求3所述方法,其特征在于，进一步将所述终级冻干粉的纯化，包括：将高级冻干粉用低压层析柱纯化，以甲酸水溶液梯度洗脱，收集的组分冷冻干燥，得纯化的冻干粉。6.权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的纯化时层析柱的固定相为粒径1.8μm的高强度硅胶,低压柱的压力为0.1公斤,流动相流速为0.1ml-0.4ml/分钟，所述的甲酸水溶液浓度为0.1％-0.5％，所述的梯度洗脱时间为60分钟。7.权利要求1或2所述的从小龙虾虾壳中提取的寡肽族在制备舒血管药物中的应用。8.权利要求1或2所述的从小龙虾虾壳中提取的寡肽族在制备抗炎药物中的应用。9.权利要求1或2所述的从小龙虾虾壳中提取的寡肽族在制备恢复损伤的睾丸功能药
物中的应用。10.权利要求1或2所述的从小龙虾虾壳中提取的寡肽族在制备提高血清细胞因子浓度的药物中的应用。

技术总结
本发明公开了从小龙虾虾壳粉末在人工胃液中酶解后提取的寡肽族,公开了寡肽族的18种寡肽的序列,公开了酶解产物中18种寡肽的舒血管活性,抗炎活性以及恢复氢化可的松损伤的睾丸功能活性和提高血清细胞因子浓度的活性。通过本发明所述的方法,得到的小龙虾虾壳粉末酶解的寡肽族，该寡肽族包含18种寡肽。实验证明,本发明的寡肽族有优秀的舒血管活性,抗炎活性,恢复氢化可的松损伤的睾丸功能活性以及提高血清细胞因子浓度的活性。因而提出本发明为舒血管,抗炎,恢复氢化可的松损伤的睾丸功能以及提高血清细胞因子浓度提供了有效的技术手段。手段。手段。


技术研发人员：卢斌 彭师奇 赵明 杨一帆
受保护的技术使用者：奇明达（北京）植物药物技术开发有限公司
技术研发日：2023.04.21
技术公布日：2023/9/22