一种艾地骨化醇有关异构体杂质、制备方法和应用与流程

1.本发明属于药物化学合成技术领域，具体涉及一种艾地骨化醇有关异构体杂质的制备方法和应用。


背景技术：

2.艾地骨化醇(eldecalcitol)，化学名为：(1r,2r,3r,5z,7e)-2-(3-羟基丙氧基)-9,10-开环胆甾-5,7,10(19)-三烯-1,3,25-三醇，结构式为：
[0003][0004]
艾地骨化醇是一种具有生理活性的维生素d3衍生物，其制剂剂型主要为软胶囊，规格为0.5μg和0.75μg，适应症为骨质疏松症。艾地骨化醇软胶囊原研厂家为日本中外制药株式会社，于2011年1月21日在日本获批上市，商品名为edirol。在预防骨质疏松骨折方面，艾地骨化醇疗效优于阿法骨化醇，且安全性与阿法骨化醇相当。
[0005]
艾地骨化醇生理活性高，单次服用剂量极小，且性质不稳定，对光和热敏感，含有多个手性中心，传统合成路线较长，在合成过程中无可避免的容易产生一些异构体杂质及其它有关物质，难于分离纯化，因而合成工艺技术门槛高、难度大。我们在开发艾地骨化醇原料药的合成工艺中，在步骤八的微生物转化反应中，除了会在25-位羟化，也会在26-位或者27-位发生羟化反应，生成两个25-位异构体杂质。该杂质在艾地骨化醇粗品中的含量超过3.0％，经传统的柱层析、重结晶等纯化方式难以清除，会给产品安全性带来隐患。


技术实现要素：

[0006]
本发明的目的是提供一种艾地骨化醇有关异构体杂质、制备方法和应用。本发明旨在保护杂质f的制备方法，建立检测方法，分析杂质含量，并确定合理的杂质限度，以保证艾地骨化醇的产品质量及用药安全性。
[0007]
实现上述发明目的的技术方案是：
[0008]
第一方面，本发明提供一种艾地骨化醇杂质f，其具有如下所示结构：
[0009][0010]
进一步地，所述杂质f由两个互为异构体的杂质组成，结构式如下：
[0011][0012]
所述式(i)和式(ii)互为异构体。
[0013]
第二方面，本发明提供一种艾地骨化醇杂质f的制备方法，反应路线如下：
[0014][0015]
所述的制备方法步骤如下：
[0016]
(1)以式1化合物为原料，经微生物转化反应，在式1化合物的26-位或27-位上羟基得到式2化合物；
[0017]
(2)式2化合物在1,3-丙二醇和碱的作用下，发生环氧开环反应得到式3化合物；
[0018]
(3)式3化合物在光敏剂和碱的作用下，经光化学及热异构化反应得到含有杂质f的粗品；
[0019]
(4)将步骤(3)所得粗品溶解后，采用dac-50动态轴向压缩制备柱色谱系统对粗品进行制备分离和纯化，最终得杂质f。
[0020]
根据本发明实施方案，步骤(1)中所述微生物转化反应是将式1化合物作为反应底物，然后将假诺卡氏菌hrw001进行发酵培养、离心分离后得到假诺卡氏菌hrw001菌体，并将所述菌体应用于微生物转化，在式1化合物的26-位或27-位上羟基得到式2化合物；
[0021]
根据本发明实施方案，所述微生物转化反应在有机溶剂中进行，所述溶剂选自乙醇、甲醇、丙二醇、四氢呋喃、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮中的一种或至少两种的组合；优选地，所述溶剂选自乙醇。
[0022]
根据本发明实施方案，步骤(1)中假诺卡氏菌hrw001，经中国普通微生物菌种保藏管理中心鉴定，分类命名为假诺卡氏菌pseudonocardia sp.hrw001，该菌株已于2019年04月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.17524，保藏地址：中国北京。
[0023]
根据本发明实施方案，步骤(2)中所述碱选自碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化钾、氢氧化钠、叔丁醇钠、叔丁醇钾、甲醇钾、三乙胺、n,n-二异丙基乙胺中的一种或至少两种的组合；所述式2化合物与碱的摩尔比为1:2～4；
[0024]
优选地，所述碱选自叔丁醇钾，所述式2化合物与碱的摩尔比为1：3；式2化合物与1,3-丙二醇的质量比为1：20；
[0025]
优选地，所述反应在氮气保护下进行，反应温度控制在100～120℃，反应时间为2～4h。
[0026]
进一步优选地，反应温度控制在110℃，反应时间为3h。
[0027]
根据本发明实施方案，步骤(3)光化学及热异构化反应是在有机溶剂中进行，所述溶剂选自乙醇、甲醇、丙二醇、四氢呋喃、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮中的一种或至少两种的组合；
[0028]
根据本发明实施方案，所述碱选自碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化钾、氢氧化钠、叔丁醇钠、叔丁醇钾、甲醇钾、三乙胺、n,n-二异丙基乙胺中的一种或至少两种的组合；所述式2化合物与碱的摩尔比为1:2～4；
[0029]
优选地，所述溶剂选四氢呋喃，所述碱选自三乙胺，所述式3化合物与碱的摩尔比为1：3；
[0030]
优选地，所述光敏剂蒽类光敏剂，具体可以是蒽、9-乙酰基蒽、2-乙酰基蒽、蒽-9-甲酸、9,10-二苯基蒽中的一种；
[0031]
进一步优选地，所述光敏剂为蒽，所述式3化合物与蒽的摩尔比是1:0.5～1。
[0032]
进一步优选地，步骤(3)中光化学及热异构化反应是将式3化合物溶于四氢呋喃中，加入蒽和三乙胺，氮气保护下，于-5
±
5℃时，500w高压紫外汞灯进行光化学反应，保温反应5h，然后升温至65℃，保温反应4h，将反应液减压浓缩，柱层析纯化，得到含有杂质f的粗品。
[0033]
根据本发明实施方案，步骤(4)中采用dac-50动态轴向压缩制备柱色谱系统对粗品进行制备分离和纯化，取粗品溶液进样，洗脱剂为乙腈和水的混合溶液，其中乙腈和水的
体积比为：乙腈/水＝55/45，流速：80ml/min，波长：265nm。
[0034]
第三方面，本发明还提供所述艾地骨化醇发酵杂质f在药物工艺研究中的应用，其可用于艾地骨化醇杂质研究。
[0035]
第四方面，本发明提供一种检测艾地骨化醇原料药中杂质f的方法，具体包括以下步骤：
[0036]
(1)样品配制：
[0037]
供试品溶液取本品约3mg，置10ml量瓶中，加2ml甲醇振摇使溶解，用稀释剂稀释至刻度，摇匀(于30分钟内进样)。
[0038]
对照溶液精密量取供试品溶液1ml，置20ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀；再精密量取1ml，置10ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀。
[0039]
系统适用性溶液取杂质f对照品1mg，置同一50ml量瓶中，加甲醇振摇使溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取3ml，置10ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为杂质储备液。取艾地骨化醇对照品3mg，置10ml量瓶中，先加2ml甲醇振摇使溶解，精密加入杂质储备液1ml，再用稀释剂稀释至刻度，摇匀。
[0040]
(2)色谱条件设置：
[0041]
色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
[0042]
流速：0.5～1.1ml/min；
[0043]
柱温：20～40℃；
[0044]
波长：260～270nm；
[0045]
进样量：30～50μl；
[0046]
流动相：以乙腈流动相a，以水为流动相b进行梯度洗脱；
[0047]
(3)检测：
[0048]
精密量取上述溶液各50μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，按照面积归一化法计算样品中杂质f含量。
[0049]
根据本发明实施方案，步骤(1)中稀释剂为80％甲醇溶液。
[0050]
根据本发明实施方案，步骤(2)中色谱柱型号为：ymc-pack ods-am，4.6mm
×
150mm，3μm。
[0051]
根据本发明实施方案，步骤(2)中按照下表进行梯度洗脱：
[0052][0053][0054]
根据本发明实施方案，步骤(2)中流速可以设置为0.5ml/min,0.8ml/min,1.0ml/min,1.1ml/min；优选为1.0ml/min；步骤(2)中柱温可以设置为20℃，25℃，30℃，35℃，40
℃；优选为30℃；步骤(2)中波长设置为260nm，265nm，270nm，优选为265nm；步骤(2)中进样量为30μl，40μl，50μl，优选为50μl；运行时间：20min～60min；
[0055]
(3)检测：
[0056]
精密量取上述溶液各50μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，按照面积归一化法计算样品中各杂质含量。
[0057]
与现有技术相比，本发明涉及的有益效果在于：
[0058]
(1)本发明提供了一种全新结构的艾地骨化醇发酵杂质f，经制备和结构确认，该杂质是艾地骨化醇合成工艺中产生的25-位异构体杂质，杂质f在艾地骨化醇粗品中的含量超过3.0％，且经传统纯化方式难以清除，给产品安全性带来隐患。本发明提供了一种新的制备杂质f的方法，其液相纯度均高于95.0％，对杂质对照品的制备具有重要的现实意义。
[0059]
(2)本发明通过制备获取该杂质，并对其进行结构确证从而确认该化合物的结构，并公开hplc检测方法用于检测艾地骨化醇原料药中杂质f的方法。本发明的实施有助于更好地控制艾地骨化醇的质量，对于研究和控制药物生产质量，以及研究药物受体的不良反应具有重要的意义。
附图说明
[0060]
图1是艾地骨化醇粗品有关物质检测hplc图谱。
[0061]
图2是式(i)化合物的hplc图谱。
[0062]
图3是式(i)化合物的氢谱。
[0063]
图4是式(i)化合物的碳谱。
[0064]
图5是式(ii)化合物的hplc图谱。
[0065]
图6是式(ii)化合物的氢谱。
[0066]
图7是式(ii)化合物的碳谱。
[0067]
图8是艾地骨化醇纯品有关物质检测hplc图谱。
具体实施方式
[0068]
下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围，如无特别说明，所用原料均可通过市售或自制获得。
[0069]
我们在开发艾地骨化醇原料药的合成工艺中，意外发现其中有一步反应，即化合物ad-m07经微生物转化反应得中间产物ad-m08的过程中，由于菌种的不纯，除了会在ad-m07的25位-上羟基生成ad-m08外，还会在ad-m07的26-位或27-位上羟基生成ad-m08的异构体杂质，该杂质会经步骤九和步骤十反应并向后传递，最终生成杂质f。杂质f由两个互为25-位异构体杂质组成，结构式如下：
[0070][0071]
由于这两个异构体杂质化学结构和性质极为相似，因此，在艾地骨化醇的质量控制中，将其合并一起控制，该杂质在艾地骨化醇粗品中的含量超过3.0％，艾地骨化醇粗品有关物质hplc检测结果如表1，对应检测图谱见图1。
[0072]
表1
[0073]
组分名称杂质d艾地骨化醇粗品杂质f保留时间(min)25.89128.91634.341含量(％)3.7187.953.45
[0074]
上述杂质经传统的柱层析、重结晶等纯化方式难以清除，也无法在反应过程中完全去除，会给产品安全性带来隐患。具体工艺研究与考察过程如下：
[0075]
反应式：
[0076][0077]
艾地骨化醇合成工艺中的步骤八为微生物转化反应，反应底物为ad-m07，经微生物转化反应在25-位反应位点羟化后生成产物ad-m08。而微生物转化过程中的羟化反应在菌体细胞内，通过菌体代谢完成。参与反应的菌体胞内酶系成分复杂，并非单一酶参与反应。因此，步骤八中不可避免的会在ad-m07的24-位、26-位、27-位反应位点羟化生成不同的杂质，其中，26-位和27-位生成的杂质相同，经步骤九环氧开环和步骤十的光化学反应后生成杂质f，而杂质f由两个艾地骨化醇的25-位异构体杂质组成，化学结构和理化性质与艾地骨化醇相近，通过传统的柱层析和重结晶方式无法完全清除。
[0078]
本发明经艾地骨化醇中间产物ad-m07微生物转化反应，再与1,3-丙二醇环氧开环，然后经光化学反应和热异构化反应，最后经dac制备分离纯化得到杂质f，并经结构确证，其结构式和命名如下：
[0079]
杂质f，命名为：(1r,2r,3r,5z,7e)-2-(3-羟基丙氧基)-9,10-开环胆甾-5,7,10(19)-三烯-1,3,26-三醇
[0080]
化学结构式：
[0081][0082]
本发明旨在保护杂质f的制备方法，建立检测方法，分析杂质含量，并确定合理的杂质限度，以保证艾地骨化醇的产品质量及用药安全性。
[0083]
实施例1杂质f的制备方法
[0084]
反应式：
[0085][0086]
步骤一：取100g式1化合物溶于800ml的无水乙醇中，作为反应底物，然后通过对假诺卡氏菌hrw001进行四级扩大培养(一级、二级、三级种子培养和发酵培养)后获得大量菌体细胞，利用菌体细胞内的p450相关羟化酶系进行微生物转化，对底物的26-位或27-位碳进行羟化。再将发酵液固液分离后进行萃取、干燥、浓缩，经柱层析纯化得到40g含有式2的化合物。
[0087]
本发明所述微生物转化方法，可参考专利cn110527650a说明书公开的方法，微生物发酵采用的假诺卡氏菌hrw001，经中国普通微生物菌种保藏管理中心鉴定，分类命名为假诺卡氏菌pseudonocardia sp.hrw001，该菌株已于2019年04月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.17524。
[0088]
步骤二：将上述式2化合物和800g的1,3-丙二醇加入反应瓶中，开启搅拌，降温至0～20℃，缓慢分批加入32g叔丁醇钾。氮气保护，升温至110℃，保温反应2h，取样tlc监控，直至式2化合物反应完全，降至室温，分别用水和乙腈洗涤、乙酸乙酯和正己烷搅洗过滤，再用甲醇重结晶，过滤干燥，得到20g含有式3的化合物。
[0089]
步骤三：将上述化合物溶于2l四氢呋喃中，加入3.5g蒽和6g三乙胺，氮气保护，降温至-5
±
5℃时，500w高压紫外汞灯进行光化学反应，保温反应5h，然后转移至反应瓶中，升温至65℃，保温反应4h，将反应液于45℃减压浓缩，再柱层析纯化，得到7g含有杂质f的粗品。
[0090]
步骤四：将上述粗品溶于60ml甲醇中，采用dac-50动态轴向压缩制备柱色谱系统对粗品进行制备分离和纯化，洗脱剂为乙腈和水的混合溶液，其中乙腈和水的体积比为：乙腈/水＝55/45，流速：80ml/min，波长：265nm；取粗品溶液进样，每次上样约1g，分别收集目标制备液，再分别合并后，减压浓缩。再分别用乙酸乙酯和正己烷重结晶，过滤，真空干燥，最终得450mg式(i)化合物和200mg式(ii)化合物。
[0091]
式(i)化合物的hplc纯度：98.6％，保留时间34.963min，hplc谱图见图2，核磁共振氢谱见图3、碳谱见图4，[m+na]
+
的m/z为513.35413，数据如表2和表3所示。
[0092]
式(ii)化合物的hplc纯度：97.0％，保留时间33.832min，hplc谱图见图5，核磁共振氢谱见图6、碳谱见图7，[m+h]
+
的m/z为491.37296，数据如表4和表5所示。
[0093]
表2式(i)化合物核磁共振氢谱测定结果
[0094]
[0095][0096]
表3式(i)化合物核磁共振碳谱测定结果
[0097]
[0098]
[0099][0100]
表4式(ii)化合物核磁共振氢谱测定结果
[0101]
[0102][0103]
表5式(ii)化合物核磁共振碳谱测定结果
[0104]
[0105]
[0106][0107]
实施例2
[0108]
一种艾地骨化醇有关物质的检测方法，可以有效分离杂质f及其他已知杂质，具体包括以下步骤：
[0109]
(1)样品配制：
[0110]
供试品溶液取本品约3mg，置10ml量瓶中，加2ml甲醇振摇使溶解，用80％甲醇稀释至刻度，摇匀(于30分钟内进样)。
[0111]
对照溶液精密量取供试品溶液1ml，置20ml量瓶中，用80％甲醇稀释至刻度，摇匀；再精密量取1ml，置10ml量瓶中，用80％甲醇稀释至刻度，摇匀。
[0112]
系统适用性溶液取杂质f对照品1mg，置同一50ml量瓶中，加甲醇振摇使溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取3ml，置10ml量瓶中，加80％甲醇稀释至刻度，摇匀，作为杂质储备液。取艾地骨化醇对照品3mg，置10ml量瓶中，先加2ml甲醇振摇使溶解，精密加入杂质储备液1ml，再用80％甲醇稀释至刻度，摇匀。
[0113]
(2)色谱条件设置：
[0114]
色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(ymc-pack ods-am，4.6mm
×
150mm，3μm或效能相当的色谱柱)；
[0115]
流速：1.0ml/min；
[0116]
柱温：30℃；
[0117]
波长：265nm；
[0118]
进样量：50μl；
[0119]
运行时间：60min；
[0120]
流动相a为乙腈，流动相b为水，按下表进行梯度洗脱：
[0121]
时间(min)流动相a(％)流动相b(％)04555305050358020361000501000514555604555
[0122]
(3)检测：
[0123]
精密量取上述溶液各50μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，按照面积归一化法计算样品中各杂质含量。
[0124]
实施例3
[0125]
一种艾地骨化醇的纯化方法，具体包括以下步骤：将艾地骨化醇粗品溶于甲醇中，超声溶解至澄清，采用sfc200型超临界二氧化碳流体色谱系统进行制备分离，以co2为流动相a，甲醇为流动相b。设定总流速为150ml/min，柱温40℃，流动相b进样比例30％，检测波长265nm，进样体积不超过20ml。收集目标产物溶液，制备液中控，将中控检验合格段制备液合并，减压浓缩至无液体滴出，向残余物中加入乙酸乙酯和正己烷，室温下搅拌析晶，过滤干燥，得到艾地骨化醇。sfc分离后的艾地骨化醇有关物质hplc检测结果如表6，对应检测图谱见图8。由检测结果可知，通过sfc制备分离纯化，我们有效控制了艾地骨化醇中杂质f的含量，限度控制在0.10％以内。
[0126]
表6
[0127]
组分名称杂质d艾地骨化醇杂质f保留时间(min)rrt：0.89528.67934.232含量(％)未检出99.610.05

技术特征：
1.一种艾地骨化醇发酵杂质f，其具有如下所示结构：2.根据权利要求1所述的艾地骨化醇发酵杂质f，其特征在于，所述杂质f由两个互为异构体的杂质组成，结构式如下：所述式(i)和式(ii)互为异构体。3.一种艾地骨化醇发酵杂质f的制备方法，反应路线如下：所述制备方法步骤如下：(1)以式1化合物为原料，经微生物转化反应，在式1化合物的26-位或27-位上羟基得到式2化合物；
(2)式2化合物在1,3-丙二醇和碱的作用下，发生环氧开环反应得到式3化合物；(3)式3化合物在光敏剂和碱的作用下，经光化学及热异构化反应得到含有杂质f的粗品；(4)将步骤(3)所得粗品溶解后，采用dac-50动态轴向压缩制备柱色谱系统对粗品进行制备分离和纯化，最终得杂质f。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述微生物转化反应是将式1化合物作为反应底物，然后将假诺卡氏菌hrw001进行发酵培养、离心分离后得到假诺卡氏菌hrw001菌体，并将所述菌体应用于微生物转化，在式1化合物的26-位或27-位上羟基得到式2化合物；所述微生物转化反应在有机溶剂中进行，所述溶剂选自乙醇、甲醇、丙二醇、四氢呋喃、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮中的一种或至少两种的组合；优选地，所述溶剂选自乙醇。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中假诺卡氏菌hrw001，经中国普通微生物菌种保藏管理中心鉴定，分类命名为假诺卡氏菌pseudonocardiasp.hrw001，该菌株已于2019年04月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.17524。6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述碱选自碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化钾、氢氧化钠、叔丁醇钠、叔丁醇钾、甲醇钾、三乙胺、n,n-二异丙基乙胺中的一种或至少两种的组合；所述式2化合物与碱的摩尔比为1:2～4；优选地，所述碱选自叔丁醇钾，所述式2化合物与碱的摩尔比为1：3；式2化合物与1,3-丙二醇的质量比为1：20；所述反应在氮气保护下进行，反应温度控制在100～120℃，反应时间为2～4h；优选地，反应温度控制在110℃，反应时间为3h。7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)光化学及热异构化反应是在有机溶剂中进行，所述溶剂选自乙醇、甲醇、丙二醇、四氢呋喃、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮中的一种或至少两种的组合；所述碱选自碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化钾、氢氧化钠、叔丁醇钠、叔丁醇钾、甲醇钾、三乙胺、n,n-二异丙基乙胺中的一种或至少两种的组合；所述式2化合物与碱的摩尔比为1:2～4；优选地，所述溶剂选四氢呋喃，所述碱选自三乙胺，所述式3化合物与碱的摩尔比为1：3；所述光敏剂为蒽类光敏剂，具体可以是蒽、9-乙酰基蒽、2-乙酰基蒽、蒽-9-甲酸、9,10-二苯基蒽中的一种；优选地，所述光敏剂为蒽，所述式3化合物与蒽的摩尔比是1:0.5～1。8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中光化学及热异构化反应是将式3化合物溶于四氢呋喃中，加入蒽和三乙胺，氮气保护下，于-5
±
5℃时，500w高压紫外汞灯进行光化学反应，保温反应5h，然后升温至65℃，保温反应4h，将反应液减压浓缩，柱层析纯化，得到含有杂质f的粗品。9.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中采用dac-50动态轴向压缩制备柱色谱系统对粗品进行制备分离和纯化，取粗品溶液进样，洗脱剂为乙腈和水的混合
溶液，其中乙腈和水的体积比为：乙腈/水＝55/45，流速：80ml/min，波长：265nm。10.权利要求1所述的艾地骨化醇发酵杂质f在药物工艺研究中的应用，其可用于艾地骨化醇杂质研究。

技术总结
本发明公开了一种艾地骨化醇有关异构体杂质、制备方法和应用。本发明旨在保护一种全新结构的艾地骨化醇发酵杂质F，经制备和结构确认，该杂质是艾地骨化醇合成工艺中产生的25-位异构体杂质，杂质F在艾地骨化醇粗品中的含量超过3.0%，且经传统纯化方式难以清除，给产品安全性带来隐患。本发明提供了一种新的制备杂质F的方法，其液相纯度均高于95.0%，对杂质对照品的制备具有重要的现实意义。质对照品的制备具有重要的现实意义。质对照品的制备具有重要的现实意义。


技术研发人员：葛元丽 丁伯祥 王雪萌 胡永康 王继芳
受保护的技术使用者：南京海融医药科技股份有限公司
技术研发日：2023.04.24
技术公布日：2023/9/22