注意缺陷多动障碍的小鼠模型及其构建方法和应用

1.本技术属于基因工程技术领域，具体涉及一种注意缺陷多动障碍小鼠模型及其构建方法和应用。


背景技术：

2.注意力缺陷多动障碍(attention-deficit/hyperactivity disorder，adhd)，简称多动症，是一种常见的由儿童时期起病的中枢神经发育疾病，包括三个核心症状：注意力不集中、冲动和/或多动。adhd是儿童和青少年最常见的精神疾病之一。目前adhd的临床诊断主要依赖行为评估，尚未发现具有足够敏感性和特异性的生物标志物辅助诊断，儿童早期诊断和治疗仍面临很大困难。


技术实现要素：

3.本技术的目的在于提供一种注意缺陷多动障碍小鼠模型及其构建方法和应用，以解决现有技术中adhd的临床诊断主要依赖行为评估，尚未发现具有足够敏感性和特异性的生物标志物辅助诊断，儿童早期诊断和治疗仍面临很大困难的技术问题。
4.为了实现上述目的，本技术采用的一个技术方案是：
5.提供一种注意缺陷多动障碍的小鼠模型的构建方法，包括：对小鼠侧脑室注射包括过表达mir-206前体片段的腺相关病毒。
6.在一个或多个实施方式中，所述过表达mir-206前体片段序列如seq id no：1所示。
7.在一个或多个实施方式中，还包括采用旷场实验、高架十字迷宫实验、宿主入侵实验和morris水迷宫实验对小鼠模型进行评价的步骤。
8.为了实现上述目的，本技术采用的另一个技术方案是：
9.提供一种采用上述任一实施方式所述的构建方法构建得到的注意缺陷多动障碍的小鼠模型，所述小鼠模型过表达mir-206。
10.在一个或多个实施方式中，相对于正常对照组，所述小鼠模型表现出趋避性增加、焦虑水平提高、攻击性更强、冲动性增加中一种或多种特征。
11.为了实现上述目的，本技术采用的又一个技术方案是：
12.提供一种上述任一实施方式所述的构建方法构建得到的小鼠模型在筛选预防或治疗注意缺陷多动障碍的药物中的应用。
13.在一个或多个实施方式中，通过将实验组和对照组执行旷场实验、高架十字迷宫实验、宿主入侵实验和morris水迷宫实验中一种或多种实验，来评估注意缺陷多动障碍的预防或治疗程度。
14.为了实现上述目的，本技术采用的又一个技术方案是：
15.提供一种用于检测注意缺陷多动障碍的试剂盒，包括用于测量受试样品中mir-206表达水平的试剂。
16.在一个或多个实施方式中，所述试剂包括mir-206逆转录反应体系试剂和荧光定量pcr反应体系试剂。
17.在一个或多个实施方式中，所述荧光定量pcr反应体系试剂包括针对mir-206的正向引物和反向通用引物，所述正向引物序列如seq id no：2所示，所述反向通用引物如seq id no：3所示。
18.区别于现有技术，本技术的有益效果是：
19.本技术小鼠模型通过将包括过表达mir-206前体的腺相关病毒注射在小鼠侧脑室得到，小鼠模型过表达mir-206，小鼠模型表征符合注意缺陷多动障碍的特征，能够应用于筛选预防或治疗注意缺陷多动障碍的药物中；
20.本技术的试剂盒采用mir-206作为分子标记物，实现了mir-206在诊断adhd中的应用，mir-206作为标记物，特异性强、灵敏度高，开发成检测试剂盒，检测快速方便、准确率高，可满足临床快速诊断adhd的需求。
21.本技术的试剂盒运用实时荧光定量pcr方法，检测血清中adhd患者和正常对照组的mirna表达水平的变化，mir-206的使用可以高表达地、很好地判断adhd的发生，通过检测mir-206的表达量，使得adhd的诊断及疗效预测变得可行。
附图说明
22.图1是本技术技术方案的流程示意图；
23.图2a是本技术实施例1中实验组小鼠的组织免疫荧光图；
24.图2b是本技术实施例1中小鼠组织mir-206-3p表达结果比对分析图(****p＜0.0001)；
25.图3是本技术实施例2中旷场实验的实验图，其中图3a是本技术实施例2中旷场实验的装置图，图3b是本技术实施例2中旷场实验的对照组小鼠运动轨迹图，图3c是本技术实施例2中旷场实验的实验组小鼠运动轨迹图，图3d是本技术实施例2中旷场实验的小鼠15分钟自发活动总路程图，图3e是本技术实施例2中旷场实验的小鼠15分钟自发活动平均速度图，图3f是本技术实施例2中旷场实验的小鼠中央区域活动路程占总路程的比例图；图3g是本技术实施例2中旷场实验的小鼠中央区域活动时间图；图3h是本技术实施例2中旷场实验的小鼠周围区域活动时间图；图3i是本技术实施例2中旷场实验的小鼠15分钟内后腿直立次数图(*p＜0.05)；
26.图4是本技术实施例2中高架十字迷宫实验的实验图，其中，图4a是本技术实施例2中高架十字迷宫实验的装置图；图4b是本技术实施例2中高架十字迷宫实验的对照组小鼠的运动轨迹图；图4c是申请实施例2中高架十字迷宫实验的实验组小鼠的运动轨迹图；图4d是本技术实施例2中高架十字迷宫实验的小鼠5分钟进臂总次数图；图4e是本技术实施例2中高架十字迷宫实验的小鼠5分钟进入封闭臂的次数图；图4f是本技术实施例2中高架十字迷宫实验的小鼠5分钟进入封闭臂的次数占总进臂总次数的比例图；图4g是本技术实施例2中高架十字迷宫实验的小鼠5分钟进入开放臂的次数图；图4h是本技术实施例2中高架十字迷宫实验的小鼠5分钟进入开放臂的次数占总进臂总次数的比例图；图4i是本技术实施例2中高架十字迷宫实验的小鼠在开放臂停留时间图；图4j是本技术实施例2中高架十字迷宫实验的小鼠在开放臂停留时间占总时间的比例图；图4k是本技术实施例2中高架十字迷宫
实验的小鼠在封闭臂停留时间图；图4l是本技术实施例2中高架十字迷宫实验的小鼠在封闭臂停留时间占总时间的比例图(*p＜0.05)；
27.图5是本技术实施例2中宿主入侵实验的实验图，其中，图5a是宿主入侵实验模型图，图5b是本技术实施例2中宿主入侵实验的小鼠攻击前潜伏时间图，图5c是本技术实施例2中宿主入侵实验的小鼠攻击次数图，图5d是本技术实施例2中宿主入侵实验的小鼠攻击频率图，图5e是实施例2中宿主入侵实验的小鼠5分钟内总攻击时间图(**p＜0.01)；
28.图6是本技术实施例2中morris水迷宫实验的实验图，其中，图6a是本技术实施例2中morris水迷宫实验的小鼠逃亡平台的路径图，图6b是本技术实施例2中morris水迷宫实验的小鼠游泳总路程图，图6c是本技术实施例2中morris水迷宫实验的小鼠游泳平均速度图，图6d是本技术实施例2中morris水迷宫实验的小鼠逃亡平台的逃逸潜伏期图，图6e是本技术实施例2中morris水迷宫实验的撤除平台后小鼠穿越平台次数图(*p＜0.05)；
29.图7a是本技术实施例3中多物种mir-206-3p成熟体序列比对分析图；
30.图7b是本技术实施例3中小鼠各器官的mir-206-3p表达量水平对比分析图；
31.图8是本技术实施例4中多物种的mir-206-3p的靶基因比对分析图；
32.图9a是本技术实施例4中细胞转染后的荧光素酶活性比对分析图；
33.图9b是本技术实施例4中小鼠中脑多巴胺神经元细胞系的nurr1的mrna水平和蛋白表达水平比对分析图；
34.图10是本技术实施例5中小鼠脑组织mir-206-3p的表达量与时间关系图；
35.图11是本技术实施例4中小鼠血清的多巴胺含量数据图；
36.图12是本技术实施例5的试剂盒进行mir-206单指标检测过程中qpcr的扩增曲线图；
37.图13是本技术实施例5的试剂盒进行mir-206单指标检测的roc曲线图。
具体实施方式
38.以下将结合各实施方式对本技术进行详细描述。但该等实施方式并不限制本技术，本领域的普通技术人员根据该等实施方式所做出的结构、方法、或功能上的变换均包含在本技术的保护范围内。
39.微小核糖核酸(microrna，mirna)是一种长度在21-24nt的短链、单链非编码rna。microrna表达和功能失调与多种神经疾病的发病机制有关，被认为是潜在的治疗靶点和疾病的生物标志物。目前认为多巴胺能神经递质系统在adhd中起到关键的作用，多巴胺的功能异常可能是adhd发病的重要原因之一。
40.为了研究注意力缺陷多动障碍的致病机制，同时验证mirna作为adhd新的分子诊断标记的可行性，申请人开发了一种注意缺陷多动障碍的小鼠模型。下述实施例中，若非特意表明，所用的试剂均为分析纯，所用试剂均可从商业渠道获得。文中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件如《分子克隆实验指南》所述的条件或制造商所建议的条件。文中使用的所有专业与科学用语均与本领域所描述的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。
41.具体地，请参阅图1，图1是本技术技术方案的流程示意图。如图1所示，本技术首先通过向小鼠注射病毒，使小鼠过表达mir-206；之后基于动物行为实验，验证过表达mir-206
小鼠的表征是否符合注意缺陷多动障碍的特征；基于实验验证的结果获得注意缺陷多动障碍的小鼠模型，并可以以mir-206作为标记物构建用于检测adhd患者的分子检测试剂盒。
42.下面结合具体实施例进一步详细阐述本技术的技术方案。
43.实施例1：小鼠模型构建
44.采用过表达mir-206前体的aav9-mmu-mir-206(69189-1)腺相关病毒对0.5-1日龄的新生c57bl/6j小鼠进行侧脑室注射，作为实验组；并同步对对0.5-1日龄的新生c57bl/6j小鼠进行侧脑室注射阴性对照病毒con336(9型)，作为对照组。其中，过表达mir-206前体的序列如seq id no：1所示；aav9-mmu-mir-206(69189-1)腺相关病毒由上海吉凯基因科技有限公司接收委托构建。
45.待小鼠长至3周龄后，给小鼠雌雄分笼并打耳标标记，继续饲养至4周龄，取1-2只小鼠进行灌注固定再取脑，制作冰冻切片做组织免疫荧光。若载体成功表达同时则同步表达绿色荧光蛋白(gfp)，通过观察绿色荧光可以判断病毒的转染情况。
46.请参阅图2a，图2a是本技术实施例1中实验组小鼠的组织免疫荧光图，图中sn为黑质，cotex为大脑皮层。如图2a所示，过表达mir-206-3p的腺相关病毒aav9-mmu-mir-206在鼠脑的黑质、海马和大脑皮层中均有较高的表达。
47.取实验组和对照组的小鼠，分别全脑提取rna，qpcr检测mir-206-3p的表达，得到图2b。
48.请参阅图2b，图2b是本技术实施例1中小鼠组织mir-206-3p表达结果比对分析图(****p＜0.0001)。
49.如图2b所示，过表达mir-206-3p小鼠鼠脑中mir-206-3p显著增高，即侧脑室注射腺相关病毒成功过表达mir-206-3p，因此成功构建了过表达mir-206-3p的小鼠模型。
50.实施例2：小鼠模型表型验证
51.通过旷场实验(open field test,oft)、高架十字迷宫实验(the elevatedplus maze,epm)、宿主入侵实验(resident-intruder test)和morris水迷宫实验(morris watermaze,mwz)，观察过表达mir-206-3p小鼠表现出的表型。
52.(1)旷场实验中将本技术的过表达mir-206-3p的小鼠作为实验组和正常的对照组小鼠分别放置在实验箱中，记录小鼠的运动轨迹、活动量、总路程和平均速度以及中央区域运滞留时间，得到图1。
53.请参阅图3，图3是本技术实施例2中旷场实验的实验图，其中图3a是本技术实施例2中旷场实验的装置图，图3b是本技术实施例2中旷场实验的对照组小鼠运动轨迹图，图3c是本技术实施例2中旷场实验的实验组小鼠运动轨迹图，图3d是本技术实施例2中旷场实验的小鼠15分钟自发活动总路程图，图3e是本技术实施例2中旷场实验的小鼠15分钟自发活动平均速度图，图3f是本技术实施例2中旷场实验的小鼠中央区域活动路程占总路程的比例图；图3g是本技术实施例2中旷场实验的小鼠中央区域活动时间图；图3h是本技术实施例2中旷场实验的小鼠周围区域活动时间图；图3i是本技术实施例2中旷场实验的小鼠15分钟内后腿直立次数图(*p＜0.05)。
54.如图3b、图3c所示，实验组的过表达mir-206-3p小鼠相对于对照组小鼠的活动量明显增加；
55.如图3d和图3e所示，在15分钟内过表达mir-206-3p小鼠的总路程和平均速度相对
于对照组均增加了20％；
56.如图3f和图3g所示，过表达mir-206-3p小鼠在中央区域的活动时间显著低于对照组，同时过表达mir-206-3p小鼠在中央区域的活动路程相对于对照组降低了20％。
57.上述实验结果表明，本技术的过表达mir-206-3p小鼠表现出“冒险”倾向更低，趋避性和焦虑水平更高，符合注意缺陷多动障碍的特征。
58.(2)高架十字迷宫实验中将过表达mir-206-3p的小鼠作为实验组和正常的对照组小鼠分别放置在包括两个封闭臂和两个开放臂的十字型迷宫中，记录小鼠进入封闭臂和开放臂的次数，得到图4。
59.请参阅图4，图4是本技术实施例2中高架十字迷宫实验的实验图，其中，图4a是本技术实施例2中高架十字迷宫实验的装置图；图4b是本技术实施例2中高架十字迷宫实验的对照组小鼠的运动轨迹图；图4c是申请实施例2中高架十字迷宫实验的实验组小鼠的运动轨迹图；图4d是本技术实施例2中高架十字迷宫实验的小鼠5分钟进臂总次数图；图4e是本技术实施例2中高架十字迷宫实验的小鼠5分钟进入封闭臂的次数图；图4f是本技术实施例2中高架十字迷宫实验的小鼠5分钟进入封闭臂的次数占总进臂总次数的比例图；图4g是本技术实施例2中高架十字迷宫实验的小鼠5分钟进入开放臂的次数图；图4h是本技术实施例2中高架十字迷宫实验的小鼠5分钟进入开放臂的次数占总进臂总次数的比例图；图4i是本技术实施例2中高架十字迷宫实验的小鼠在开放臂停留时间图；图4j是本技术实施例2中高架十字迷宫实验的小鼠在开放臂停留时间占总时间的比例图；图4k是本技术实施例2中高架十字迷宫实验的小鼠在封闭臂停留时间图；图4l是本技术实施例2中高架十字迷宫实验的小鼠在封闭臂停留时间占总时间的比例图(*p＜0.05)。
60.如图4b和图4c所示，对照组和实验组小鼠运动轨迹差异不大；如图4d、e和f所示，实验组的过表达mir-206-3p小鼠封闭臂进入次数占总进臂次数的百分比相对于对照组增高了8％；如图4g所示，实验组的过表达mir-206-3p小鼠进入开放臂的次数相对于对照组减少了28.9％；如图4h所示，实验组的过表达mir-206-3p小鼠进入开放臂的次数占总进臂次数的百分比相对于对照组降低了25％。
61.由上述数据可知，过表达mir-206-3p小鼠的焦虑水平相对于对照组更高，符合注意缺陷多动障碍的特征。
62.(3)宿主入侵实验中将过表达mir-206-3p小鼠作为实验组和正常的对照组小鼠分别放置在相同空间中，在空间中放入入侵者，记录小鼠攻击次数和时间，得到图5。
63.请参阅图5，图5是本技术实施例2中宿主入侵实验的实验图，其中，图5a是宿主入侵实验模型图，图5b是本技术实施例2中宿主入侵实验的小鼠攻击前潜伏时间图，图5c是本技术实施例2中宿主入侵实验的小鼠攻击次数图，图5d是本技术实施例2中宿主入侵实验的小鼠攻击频率图，图5e是实施例2中宿主入侵实验的小鼠5分钟内总攻击时间图(**p＜0.01)。
64.如图5b所示，实验组和对照组在发起攻击的时间上没有显著差异；如图5c所示，实验组的过表达mir-206-3p小鼠的攻击次数相对于对照组增加了128.6％；如图5d和图5e所示，在整个检测过程中，过表达mir-206-3p小鼠的累计攻击时间相对于对照小鼠增加了136.8％，攻击频率增加了128.6％。
65.由上述数据可知，过表达mir-206-3p小鼠的攻击性较对照组小鼠更强，更加冲动，
符合注意缺陷多动障碍的特征。
66.(4)morris水迷宫实验中将过表达mir-206-3p小鼠作为实验组和正常的对照组小鼠分别放置在具有平台的水池中，记录小鼠逃亡路径、游泳路程、游泳速度等数据，每天重复一次实验，7天后撤除平台，记录撤除平台后小鼠穿梭平台次数，得到图6。
67.请参阅图6，图6是本技术实施例2中morris水迷宫实验的实验图，其中，图6a是本技术实施例2中morris水迷宫实验的小鼠逃亡平台的路径图，图6b是本技术实施例2中morris水迷宫实验的小鼠游泳总路程图，图6c是本技术实施例2中morris水迷宫实验的小鼠游泳平均速度图，图6d是本技术实施例2中morris水迷宫实验的小鼠逃亡平台的逃逸潜伏期图，图6e是本技术实施例2中morris水迷宫实验的撤除平台后小鼠穿越平台次数图。(*p＜0.05)。
68.如图6b、c、d所示，实验组与对照组小鼠在空间记忆采集实验期间，总游泳距离、平均游泳速度和潜伏期没有显著差异；但在第七天训练时过表达mir-206-3p的小鼠的游泳距离与对照小鼠相比明显减少，并且潜伏期明显缩短，即过表达mir-206-3p小鼠能更快地找到并爬上平台。
69.如图6e所示，平台穿梭实验中，过表达mir-206-3p小鼠穿过平台的次数更多。
70.如图6a所示，两组小鼠典型的游泳轨迹表明两组小鼠寻找平台的采取的策略有差异，对照组小鼠更多采取重复环绕策略和系统搜索策略，即小鼠以环状轨迹系统地搜索平台，没有对目标象限清晰的空间定位；而过表达mir-206-3p小鼠更多采取空间策略和重复环绕策略，即小鼠更多地在平台所在象限或邻近象限进行搜索。
71.上述实验可知，过表达mir-206-3p的小鼠与对照组相比，虽然在学习能力上没有显著差异，但其采取的策略能更加有效地找到平台，过表达mir-206-3p的小鼠可能有更好的空间定位能力，符合注意缺陷多动障碍的高创造性特征。
72.基于上述实验，本技术实施例1构建的过表达mir-206-3p小鼠符合注意缺陷多动障碍特征，能够应用为注意缺陷多动障碍小鼠模型。
73.实施例3：mir-206-3p物种保守性及表达谱分析
74.为了为本技术的小鼠模型有效性提供生物学依据，对多个物种的mir-206-3p成熟体序列进行比对分析，多个物种包括小鼠、人类、斑马鱼、猴、鸡、黑猩猩、兔、牛、大鼠和狗，得到图7a数据。
75.请参阅图7a，图7a是本技术实施例3中多物种mir-206-3p成熟体序列比对分析图。
76.如图7a所示，mir-206-3p在多个物种中高度保守，这对本技术的小鼠模型的有效性提供了生物学依据。
77.进一步地，为了研究mir-206-3p在小鼠体内的表达谱情况，我们取小鼠的多种组织器官提取总rna，包括心脏、肝脏、脾、肺、肾、眼球、肌肉、嗅球、海马、大脑皮层、前脑、中脑、后脑。
78.将提取的总rna中mirna反转录为cdna后qpcr检测mir-206-3p表达量，得到图7b数据。
79.请参阅图7b，图7b是本技术实施例3中小鼠各器官的mir-206-3p表达量水平对比分析图。
80.如图7b所示，mir-206-3p在小鼠的多种组织器官中均有不同程度的表达，在肌肉
和眼球表达较高，在大脑、脾脏、肾脏等组织表达相对较弱，这为后续验证小鼠模型过表达mir-206提供依据。
81.实施例4：mir-206-3p的靶向基因验证
82.利用targetscan和mirdb数据库共同预测分析mir-206-3p的靶基因，包括小鼠、人类、大鼠、猪、猫、猴、象、松鼠、黑猩猩、猕猴，得到图8。
83.请参阅图8，图8是本技术实施例4中多物种的mir-206-3p的靶基因比对分析图。
84.如图8所示，发现mir-206-3p其中一个靶基因为孤核受体nurr1，即图中阴影部分，并且该识别位点在脊椎动物中高度保守，该发明进一步验证了本技术小鼠模型的可行性。
85.为了进一步分析mir-206-3p与孤核受体nurr1是否直接作用，我们克隆了小鼠的nurr1序列全长3’utr，并插入pmir report载体中构建荧光素酶报告质粒pmirluc-nurr1-3’utr。
86.将荧光素酶报告质粒pmirluc-nurr1-3’utr与mir-206-3p mimics共转染人胚肾细胞株(293t)细胞，作为实验组1；将pmirluc-nurr1-3’utr与mir-206-3p inhibitor共转染293t细胞，作为实验组2；将pmirluc-nurr1-3’utr与mir-206-3p mimics和mir-206-3p inhibitor共转染293t细胞，作为实验组3；将pmirluc-nurr1-3’utr与mir-nc(negtive control)共转染293t细胞，作为对照组1。
87.删除nurr13’utr上mir-206-3p的识别位点后构建了luc-nurr1 mutant3’utr荧光素酶报告质粒。
88.将荧光素酶报告质粒luc-nurr1 mutant 3’utr与mir-206-3p mimics共转染293t细胞，作为实验组4；将luc-nurr1 mutant 3’utr与mir-206-3p inhibitor共转染293t细胞，作为实验组5；将luc-nurr1 mutant 3’utr与mir-206-3p mimics和mir-206-3p inhibitor共转染293t细胞，作为实验组6；将luc-nurr1mutant 3’utr与mir-nc(negtive control)共转染293t细胞，作为对照组2。
89.其中，mir-206-3p mimics为针对mir-206-3p的成熟体设计并合成的小片段双链mirna，mir-206-3p inhibitor为化学修饰的针对细胞中mir-206-3p的抑制剂。
90.测量转染后的荧光素酶活性，得到图9a。请参阅图9a，图9a是本技术实施例4中细胞转染后的荧光素酶活性比对分析图。
91.如图9a所示，对照组1中转染negtive control后，不影响荧光素酶活性；实验组1中转染mir-206-3p mimics后过表达mir-206-3p，导致荧光素酶活性显著降低；实验组2中转染mir-206-3p inhibitor后，导致荧光素酶活性显著增高，推测是由于内源mir-206-3p表达受抑制所致；实验组3中转染共转染mimics和inhibitor后，荧光素酶活性与对照组1基本相同。
92.对照组2与实验组4对比，nurr13’utr上mir-206-3p的识别位点被删除后，实验组4转染mir-206-3p mimics后过表达mir-206-3p的荧光素酶活性与对照组2无明显差异，说明mir-206-3p失去了对nurr1的调控作用。
93.由上述实验可知，mir-206-3p通过直接作用于nurr13’utr调控nurr1表达。
94.为了进一步验证mir-206-3p在体内对nurr1的作用，我们培养了小鼠中脑多巴胺神经元细胞系(mn9d)，转染mir-206-3p mimics作为实验组1，转染mir-206-3p inhibitor作为实验组2，转染mir-nc(negtive control)作为对照组。
polymerase)、反转录缓冲液(10
×
reverse transcription buffer)、核糖核酸酶抑制剂(rnase inhibitor,20u/μl)和无核酸酶水(nuclease-free water)，试剂均可从商业渠道获得。反转录反应体系试剂逐瓶封装，用时按比例配成反转录反应体系，反转录反应体系为7μl/次，封装的体积为100次的用量。
114.逆转录反应体系试剂组成具体如下表所示：
[0115][0116]
2、荧光定量pcr反应体系试剂：
[0117]
试剂包括taqmantm small rnaassay(20
×
)、pcr master mix和无核酸酶水(nuclease-free water)。用于配制pcr反应体系的试剂逐瓶封装，使用时按一定的比例配制成pcr反应体系，pcr反应体系为9.34μl/次，封装的体积是100次的用量。
[0118]
荧光定量pcr反应体系试剂组成具体如下表：
[0119][0120]
用于配制pcr反应体系的正向引物为针对mir-206的正向引物，序列如seq id no：2所示，正向引物分开逐瓶封装。反向通用引物如seq id no：3所示。
[0121]
具体地，本实施例中的正向引物和反向通用引物由苏州泓迅生物科技有限公司合成。
[0122]
实施例8：试剂盒使用方法
[0123]
实施例7的检测试剂盒的具体检测步骤如下：
[0124]
1.mirna的提取
[0125]
用普通edta采血管采集adhd患儿及对照组健康儿童血液3ml。在已加入800μtrizol的1.5ml ep管内，加入200μ全血，室温静置裂解5分钟，使其充分裂解后进行下一步。加入1/5体积(即0.2ml)的氯仿(三氯甲烷)，颠倒至少10次，使其充分混匀，冰上静置5min。4℃，12000r/min，离心20min。小心吸取上层水相于新ep管内，加入等体积异丙醇(500-600μ)，颠倒混匀10次，冰上静置过夜。4℃，12000r/min，离心15min，弃上清，加预冷的75％乙醇(depc水配制)，使沉淀悬浮。重复4℃下离心、弃上清2次。将ep管倒扣，空气干燥5-10min。溶于30μrna-free水中。
[0126]
2.反转录反应
[0127]
反转录体系如下：原料(100mm dntps(with dttp))、多聚腺苷酸聚合酶、反转录缓冲液、核糖核酸酶抑制剂和无核酸酶水。将反应体系放入热循环器中，使用标准循环。逆转录程序如下：
[0128][0129]
3.荧光定量pcr反应
[0130]
荧光定量pcr反应体系：taqmantm small rnaassay(20
×
)、pcrmaster mix和无核酸酶水。每个cdna样本包括以下反应：
①
对每个cdna样本进行一次小rna检测；
②
每个cdna样本进行内源性参照分析(u6)；
③
平板上每次检测的无模板对照(ntcs)。选择适合主混合的循环模式，设置需要的热循环模式，选择适当的反应体积，将反应板放入qpcr仪中，启动开始pcr。
[0131]
参见使用仪器的相应文档，使用绝对或相对量化(δδct)方法分析结果，在结果表格中，查看每个样本和每个复制组的ct值。
[0132]
实施例9：试剂盒在辅助诊断adhd上的应用
[0133]
以24例adhd病人作为病例组，23例健康人作为对照组，分别提取病例组和对照组血清中的mirna，与一例mir-206阳性对照者进行比较。通过实施例5的检测试剂盒检测mir-206的表达量。
[0134]
图12是本技术实施例5的试剂盒进行mir-206单指标检测过程中qpcr的扩增曲线图。
[0135]
图13是本技术实施例5的试剂盒进行mir-206单指标检测的roc曲线图，取曲线上最接近左上角的一点(0.2500,0.9565)作为诊断标准的临界点，其敏感度和特异性俱佳。当
临界点为ct＝39时，其敏感度为75.0％，特异度为91.3％，具有一定的优势。当ct值《39时，则判断为adhd患者。
[0136]
本实施例的检测结果下表所示。
[0137][0138]
通过独立t检验(双侧α＝0.05)，假设h0：μ1＝μ2，即adhd组和健康对照组mir-206表达水平无差别；h1：μ1≠μ2，即adhd组和健康对照组人mir-206表达水平有差别。结果发现，t＝5.725》t0.05/2,21＝2.08，p《0.05。按α＝0.05水准，拒绝h0，接受h1，两组均数差异具有统计学意义，认为adhd组和健康对照组mir-206表达水平有显著差别。
[0139]
综上所述，本技术实施例7的试剂盒能够应用于adhd的诊断。
[0140]
本公开内容的上述描述被提供来使得本领域任何普通技术人员能够实现或者使用本公开内容。对于本领域普通技术人员来说，对本公开内容进行的各种修改是显而易见的，并且，也可以在不脱离本公开内容的保护范围的情况下，将本文所对应的一般性原理应用于其它变型。因此，本公开内容并不限于本文所描述的示例和设计，而是与符合本文公开的原理和新颖性特征的最广范围相一致。

技术特征：
1.一种注意缺陷多动障碍的小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括：对小鼠侧脑室注射包括过表达mir-206前体片段的腺相关病毒。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述过表达mir-206前体片段序列如seq id no：1所示。3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，还包括采用旷场实验、高架十字迷宫实验、宿主入侵实验和morris水迷宫实验对小鼠模型进行评价的步骤。4.一种采用权利要求1至3任一所述的构建方法构建得到的注意缺陷多动障碍的小鼠模型，其特征在于，所述小鼠模型过表达mir-206。5.根据权利要求4所述的小鼠模型，其特征在于，相对于正常对照组，所述小鼠模型表现出趋避性增加、焦虑水平提高、攻击性更强、冲动性增加中一种或多种特征。6.一种权利要求1至3任一所述的构建方法构建得到的小鼠模型在筛选预防或治疗注意缺陷多动障碍的药物中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，通过将实验组和对照组执行旷场实验、高架十字迷宫实验、宿主入侵实验和morris水迷宫实验中一种或多种实验，来评估注意缺陷多动障碍的预防或治疗程度。8.一种用于检测注意缺陷多动障碍的试剂盒，其特征在于，包括用于测量受试样品中mir-206表达水平的试剂。9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂包括mir-206逆转录反应体系试剂和荧光定量pcr反应体系试剂。10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光定量pcr反应体系试剂包括针对mir-206的正向引物和反向通用引物，所述正向引物序列如seq id no：2所示，所述反向通用引物如seq id no：3所示。

技术总结
本申请公开了一种注意缺陷多动障碍小鼠模型及其构建方法和应用，构建方法包括：对小鼠侧脑室注射包括过表达miR-206前体片段的腺相关病毒。本申请小鼠模型通过将包括过表达miR-206前体的腺相关病毒注射在小鼠侧脑室得到，小鼠模型过表达miR-206，其表征符合注意缺陷多动障碍的特征，能够应用于筛选预防或治疗注意缺陷多动障碍的药物中；试剂盒采用miR-206作为分子标记物，实现了miR-206在诊断ADHD中的应用，miR-206作为标记物，特异性强、灵敏度高，开发成检测试剂盒，检测快速方便、准确率高，可满足临床快速诊断ADHD的需求。可满足临床快速诊断ADHD的需求。可满足临床快速诊断ADHD的需求。


技术研发人员：黄健 李俊廷 王云 邓可如 赵玉洁 陶玉杰 柯子昂 何云菲 丁欣
受保护的技术使用者：苏州大学
技术研发日：2023.04.25
技术公布日：2023/9/22