一种吡唑并吡啶类化合物及其制备方法、应用

1.本发明属于医药技术领域，具体涉及一种新型吡唑并吡啶类似物及其药学上可接受的盐或载体，以及该类化合物用于治疗肝癌的应用。


背景技术：

2.世界卫生组织国际癌症研究机构(iarc)发布的最新《世界癌症报告》显示全球癌症新发病例达到1929万，癌症死亡996万人，其中肝癌死亡人数位居全球第三，是导致癌症相关死亡的三大原因之一。尽管在肝癌的诊断和治疗方面取得了较大进展，但是肝癌预后较差，且容易发生转移和耐药，其死亡率仍然较高。因此，开发安全、高效、创新性的肝癌靶向药物具有重要的意义。


技术实现要素：

3.针对现有技术的不足，本发明提出了一种吡唑并吡啶类化合物及其制备方法、应用。本发明的制备方法将吡唑并吡啶类似物和磺酰胺类化合物，利用骨架跃迁和拼合原理的化学设计方法有机结合在一起，获得更高活性和更好生物利用度的新型抗肝癌生物活性化合物。
4.本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
5.一种吡唑并吡啶类化合物的制备方法，包括以下步骤：
6.步骤1：取化合物3、无水磷酸钾、n,n-二甲基甲酰胺和蒸馏水，以及化合物1或化合物2，在气体保护下加热，加入四-三苯基磷钯进行混合反应；
7.步骤2：冷却后加入氯化铵溶液，经过萃取、干燥、抽滤浓缩，在经过洗脱、硅胶柱层析分离纯化得到化合物4或者化合物5；获得化合物4时转至步骤3，获得化合物5时转至步骤4；
8.步骤3：冰浴下，将化合物4和氢氧化钠的二氯甲烷混合液，再加入三种苯磺酰氯的二氯甲烷溶液，混合反应，经过萃取、干燥、抽滤浓缩，在经过洗脱、硅胶柱层析分离纯化得到化合物a；
9.步骤4：冰浴下，将化合物5、吡啶和4-二甲氨基吡啶的二氯甲烷混合，加入三种苯磺酰氯的二氯甲烷溶液，混合反应，经过萃取、干燥、抽滤浓缩，在经过洗脱、硅胶柱层析分离纯化得到化合物b；
10.其中，所述化合物a结构式为：
[0011][0012]
所述化合物b结构式为：
[0013][0014]
其中，r为h、4-f或者4-cf3；
[0015]
化合物1结构式为：
[0016]
化合物2结构式为：
[0017]
化合物3结构式为：
[0018]
化合物4结构式为：
[0019]
化合物5结构式为：
[0020]
可选地，所述步骤1完成后通过薄层色谱法检测反应。
[0021]
可选地，所述步骤2中的萃取过程中使用乙酸乙酯作为萃取剂。
[0022]
可选地，所述步骤2、步骤3和步骤4中的洗脱过程中使用乙酸乙酯和石油醚为洗脱剂。
[0023]
可选地，所述步骤3和步骤4中的萃取过程中使用二氯甲烷作为萃取剂。
[0024]
本发明的第二方面，涉及一种吡唑并吡啶类化合物，结构式为：
[0025]
或者
[0026]
r为h、4-f或者4-cf3。
[0027]
本发明的第三方面，涉及上述的化合物在制备抗肝癌药物中的应用。
附图说明
[0028]
下面结合附图对本发明作进一步的说明。
[0029]
图1为本技术的化合物的合成路线图；
[0030]
图2为本技术的化合物e5的氢谱图；
[0031]
图3为本技术的化合物e5的碳谱图；
[0032]
图4为本技术的化合物抗癌细胞增殖效应的实验结果；
[0033]
图5为本技术的化合物抗癌细胞迁移侵袭效应的实验结果；
[0034]
图6为本技术的化合物促癌细胞凋亡效应的实验结果。
具体实施方式
[0035]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
[0036]
实施例一：
[0037]
本实施例中公开了一种化合物a，其结构式为：
[0038][0039]
其中，r为h、4-f或者4-cf3。
[0040]
具体地，在本实施例中公开了化合物a的制备方法，如图1所示，具体可以包括以下步骤：
[0041]
将化合物1(1g,5mmol)，化合物3(1.25g,6mmol),无水磷酸钾(k3po4,1.59g,7.5mmol),n,n-二甲基甲酰胺(dmf,60ml)和蒸馏水(40ml)加入到250ml的圆底烧瓶中，氮气保护下反应30分钟。然后加入四-三苯基磷钯(pd(pph3)4,289mg,0.25mmol),100℃下反应2小时。薄层色谱法(tlc法)检测反应完全，冷却后加入饱和的氯化铵溶液，用乙酸乙酯萃取三遍，无水硫酸镁干燥，抽滤浓缩，残渣用乙酸乙酯和石油醚(体积比为1:9)为洗脱剂，硅胶柱层析分离纯化得到浅黄色粉末，产率约为60％。质谱、熔点和核磁数据如下：
[0042]
esi-ms m/z:199.23(m+h)
+
.m.p.:170-172℃.1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ11.60(s,1h),8.47(d,j＝2.1hz,1h),8.12(s,1h),8.08(d,j＝2.0hz,1h),7.89(s,1h),7.47
–
7.43(m,1h),6.42(dd,j＝3.4,1.8hz,1h),3.87(s,3h).
13
c nmr(101mhz,dmso-d6)δ147.40,140.39,135.85,127.24,126.60,124.04,120.70,120.41,119.69,99.69,38.65.
[0043]
化合物e1-e3的制备
[0044]
冰浴下，将化合物4(198mg,1mmol)和氢氧化钠固体(100mg,2.5mmol)的二氯甲烷(dcm,5ml)混合液置于100ml圆底烧瓶中，缓慢加入三种苯磺酰氯(4-h,4-f or 4-cf3,2mmol)的二氯甲烷溶液，在该温度下继续反应2小时。薄层色谱法(tlc法)检测反应完全，用2mol/l的盐酸溶液调节ph至弱酸性，用二氯甲烷萃取三遍，无水硫酸镁干燥，抽滤浓缩，残渣用乙酸乙酯和石油醚(体积比为1:9)为洗脱剂，硅胶柱层析分离纯化得到浅黄色粉末，产率约为70-75％。
[0045]
质谱、熔点和核磁数据如下：
[0046]
化合物e1：esi-ms m/z:339.39(m+h)
+
.m.p.:220-222℃.1h nmr(600mhz,cdcl3)δ8.54(d,j＝2.1hz,1h),8.19(dd,j＝8.5,1.1hz,2h),7.87(d,j＝2.1hz,1h),7.73(s,1h),7.71(d,j＝4.0hz,1h),7.61(s,1h),7.57(t,j＝7.5hz,1h),7.48(t,j＝7.9hz,2h),6.58(d,j＝4.0hz,1h),3.96(s,3h).
13
c nmr(151mhz,chloroform-d)δ146.18,143.00,138.54,
136.90,134.16,129.18,128.08,127.17,127.13,126.30,126.23,124.59,123.16,120.30,105.58,39.32.
[0047]
化合物e2：esi-ms m/z:357.38(m+h)
+
.m.p.:190-192℃.1h nmr(600mhz,cdcl3)δ8.54(d,j＝2.1hz,1h),8.24(dd,j＝9.0,5.0hz,2h),7.88(d,j＝2.1hz,1h),7.74(s,1h),7.69(d,j＝4.0hz,1h),7.61(s,2h),7.17
–
7.13(m,1h),6.59(d,j＝4.0hz,1h),3.96(s,3h).
13
c nmr(151mhz,chloroform-d)δ166.91,165.20,146.04,143.00,136.91,134.43,131.17,127.13,126.97,126.31,124.75,123.17,120.22,116.59,116.44,105.71,39.33.
[0048]
化合物e3：esi-ms m/z:407.38(m+h)
+
.m.p.:186-188℃.1h nmr(600mhz,cdcl3)δ8.55(d,j＝2.0hz,1h),8.35(d,j＝8.3hz,2h),7.89(d,j＝2.1hz,1h),7.78
–
7.73(m,2h),7.70(d,j＝4.0hz,1h),7.63(s,1h),6.62(d,j＝4.0hz,1h),3.98(s,3h).
13
c nmr(151mhz,chloroform-d)δ146.06,143.11,141.79,136.74,135.84,135.62,128.77,127.34,126.92,126.53,126.39,126.36,124.88,123.27,120.18,106.24,39.34.
[0049]
实施例二
[0050]
本实施例中公开了另一种化合物b，结构式为：
[0051][0052]
其中，r为h、4-f或者4-cf3；
[0053]
具体地，在本实施例中还公开了化合物b的制备方法，如图1所示，具体可以包括以下步骤：
[0054]
中间体化合物5的制备
[0055]
将化合物2(1g,5mmol)，化合物3(1.25g,6mmol),无水磷酸钾(k3po4,1.59g,7.5mmol),n,n-二甲基甲酰胺(dmf,60ml)和蒸馏水(40ml)加入到250ml的圆底烧瓶中，氮气保护下反应30分钟。然后加入四-三苯基磷钯(pd(pph3)4,289mg,0.25mmol),100℃下反应2小时。薄层色谱法(tlc法)检测反应完全，冷却后加入饱和的氯化铵溶液，用乙酸乙酯萃取三遍，无水硫酸镁干燥，抽滤浓缩，残渣用乙酸乙酯和石油醚(体积比为1:9)为洗脱剂，硅胶柱层析分离纯化得到浅黄色粉末，产率约为65％。质谱、熔点和核磁数据如下：
[0056]
esi-ms m/z:175.21(m+h)
+
.m.p.:217-219℃.1h nmr(600mhz,dmso-d6)δ8.13(d,j＝1.9hz,1h),7.94(s,1h),7.70(d,j＝0.7hz,1h),7.53(dd,j＝8.5,2.4hz,1h),6.45(d,j＝8.5hz,1h),5.83(s,2h),3.82(s,3h).
13
c nmr(151mhz,dmso-d6)δ158.20,144.20,135.08,134.22,126.31,119.74,116.99,107.97,38.55.
[0057]
化合物e4-e6的制备
[0058]
冰浴下，将化合物5(174mg,1mmol)，吡啶(200μl)和4-二甲氨基吡啶(dmap,0.1mmol)的二氯甲烷(dcm,5ml)混合液置于100ml圆底烧瓶中，缓慢加入三种苯磺酰氯(4-h,4-f or 4-cf3,2mmol)的二氯甲烷溶液，在该温度下继续反应2小时。薄层色谱法(tlc法)检测反应完全，用2mol/l的盐酸溶液调节ph至弱酸性，用二氯甲烷萃取三遍，无水硫酸镁干燥，抽滤浓缩，残渣用乙酸乙酯和石油醚(体积比为1:9)为洗脱剂，硅胶柱层析分离纯化得到浅黄色粉末，产率约为75-80％。质谱、熔点和核磁数据如下：
[0059]
化合物e4：esi-ms m/z:315.36(m+h)
+
.m.p.:170-172℃.1h nmr(600mhz,dmso-d6)δ8.32(s,1h),8.09(s,1h),7.89(dd,j＝7.9,4.8hz,3h),7.83(s,1h),7.59(t,j＝7.3hz,1h),7.55(t,j＝7.4hz,2h),7.15(d,j＝8.8hz,1h),3.83(s,3h).
13
c nmr(151mhz,dmso-d6)δ150.35,141.36,135.87,132.48,129.41,129.04,128.24,127.70,126.67,117.77,113.32,38.69.
[0060]
化合物e5(如图2和图3)：esi-ms m/z:333.35(m+h)
+
.m.p.:222-224℃.1h nmr(600mhz,dmso-d6)δ8.31(s,1h),8.10(s,1h),7.95(dd,j＝8.9,5.2hz,2h),7.91(dd,j＝8.8,2.4hz,1h),7.83(d,j＝0.8hz,1h),7.38(t,j＝8.8hz,2h),7.15(d,j＝8.7hz,1h),3.83(s,3h).
13
c nmr(151mhz,dmso-d6)δ164.89,163.23,137.93,135.88,129.72,129.66,127.73,117.68,116.22,116.07,113.54,38.69.
[0061]
化合物e6：esi-ms m/z:383.36(m+h)
+
.m.p.:210-212℃.1h nmr(600mhz,dmso-d6)δ8.27(s,1h),8.09(d,j＝8.3hz,3h),7.96(dd,j＝8.9,2.4hz,1h),7.92(d,j＝8.4hz,2h),7.84(d,j＝0.8hz,1h),7.22(d,j＝8.9hz,1h),3.83(s,3h).
13
cnmr(151mhz,dmso-d6)δ151.11,146.16,135.92,131.78,127.81,127.47,126.23,124.46,122.65,117.38,114.36,38.71。
[0062]
实施例三
[0063]
本实施例中，公开了对于上述实施例一与实施例二中所制得化合物的抗肝癌效应的试验验证方法，具体可以包括以下步骤：
[0064]
(1)细胞增殖能力：将对数生长期的肝癌细胞(hepg2细胞)以5000个细胞/孔接种于96孔板，在含10％fbs的dmem培养基中培养。待细胞贴壁后，化合物e1-e6(10μm)分别处理细胞48h，添加20μl mtt(4mg/ml)孔于37℃继续培养4h，每孔更换为200μl dmso室温震荡10min，酶标仪上于490nm读取光密度，结果如图4a所示，根据实验结果，筛选出化合物e5的抑制率最高。
[0065]
如图4b所示，然后根据以上mtt法测定不同浓度(0.78,1.56,3.13,6.25,12.5,25μm)的化合物e5的细胞活力。抑制率(％)计算公式：1-[(od实验组-od空白组)/(od对照组-od空白组)
×
100％。利用graphpad prism 8软件非线性拟合得到ic
50
。实验结果至少通过三次实验获得。细胞增殖能力实验结果表明索拉非尼(sfb)和化合物e5的ic
50
值分别为ic
50
＝10.06μm和9.41μm。
[0066]
(2)克隆形成能力，如图4c所示：将对数生长期的hepg2细胞以1000个/孔的量接种在6孔板中，细胞过夜培养后，不同浓度(0,0.5,1,2μm)的化合物e5分别处理细胞48h。更换新鲜培养基，并将细胞继续在37℃下培养至形成肉眼可见的细胞集落。4％多聚甲醛固定并用结晶紫染色15min。根据克隆的数量和大小评估药物抗增殖效应差异。克隆形成能力实验结果表明化合物e5具有明显的抗增殖能力和浓度依赖性。
[0067]
(3)细胞迁移能力，如图5a所示：将对数生长期细胞接种在24孔板中，过夜培养至细胞汇合度达100％，垂直于孔板底部划痕。1
×
pbs清洗三次，换用无fbs培养基，不同浓度(0,2.5,5,10μm)的化合物e5处理细胞。放入37℃、5％co2培养箱中培养，按0h、24h、48h进行拍照。细胞划痕愈合实验结果表明化合物e5具有明显的抗迁移能力，并且具有时间依赖性和浓度依赖性。
[0068]
(4)细胞侵袭能力，如图5b所示：在transwell上室中加入5
×
104个细胞/孔的200μ
l无血清培养基，并在底部加入700μl含有10％fbs的培养基。在两个腔室中加入不同浓度的化合物e5(0,5μm)。允许细胞迁移48小时，膜上表面的非迁移细胞用棉签轻轻刮掉，将迁移的细胞固定在4％多聚甲醛中30分钟，并用0.1％结晶紫染色15分钟。在倒置显微镜下对三个随机选择区域中的迁移细胞进行计数。细胞transwell实验结果表明化合物e5具有明显的抗侵袭能力。
[0069]
(5)线粒体膜电位如图6所示：将对数生长期细胞接种于6孔板，培养过夜，待细胞贴壁后，分组处理。吸弃培养液，pbs洗3遍，每次2分钟，每孔加500μl10μg/ml的jc-1培养液，恢复至室温，轻摇混匀。细胞在37℃孵育15-20分钟。孵育结束后，吸弃上清，用pbs洗涤2次。加入500μl的pbs，用荧光显微镜观察jc-1聚合物红色荧光强度与jc-1单体绿色荧光强度。线粒体膜电位实验结果表明化合物e5处理细胞以后，出现绿色荧光说明线粒体膜电位下降。随着化合物e5的浓度增大，绿色荧光强度逐渐增大，红色荧光强度逐渐减小，说明化合物e5具有明显的促凋亡能力和浓度依赖性。制备不同浓度(0,2.5,5,10μm)的化合物e5处理组的全细胞裂解液，经蛋白质定量后，变性蛋白。将校正好的蛋白裂解物于sds-page中电泳后转移到pvdf膜上，脱脂牛奶中封闭1h后，将膜分别与目标蛋白一抗在4℃孵育过夜，对应二抗在室温下孵育1h。通过化学发光染色来检测等关键促凋亡蛋白caspase 3、bcl-2蛋白的水平和磷酸化水平。蛋白质印迹实验结果表明化合物e5处理细胞以后，caspase 3、和bcl-2的蛋白水平和磷酸化水平逐渐升高，再一次证明化合物e5具有明显的促凋亡能力。
[0070]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
[0071]
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。

技术特征：
1.一种吡唑并吡啶类化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：取化合物3、无水磷酸钾、n,n-二甲基甲酰胺和蒸馏水，以及化合物1或化合物2，在气体保护下加热，加入四-三苯基磷钯进行混合反应；步骤2：冷却后加入氯化铵溶液，经过萃取、干燥、抽滤浓缩，在经过洗脱、硅胶柱层析分离纯化得到化合物4或者化合物5；获得化合物4时转至步骤3，获得化合物5时转至步骤4；步骤3：冰浴下，将化合物4和氢氧化钠的二氯甲烷混合液，再加入三种苯磺酰氯的二氯甲烷溶液，混合反应，经过萃取、干燥、抽滤浓缩，在经过洗脱、硅胶柱层析分离纯化得到化合物a；步骤4：冰浴下，将化合物5、吡啶和4-二甲氨基吡啶的二氯甲烷混合，加入三种苯磺酰氯的二氯甲烷溶液，混合反应，经过萃取、干燥、抽滤浓缩，在经过洗脱、硅胶柱层析分离纯化得到化合物b；其中，所述化合物a结构式为：所述化合物b结构式为：其中，r为h、4-f或者4-cf3；化合物1结构式为：化合物2结构式为：化合物3结构式为：化合物4结构式为：化合物5结构式为：2.根据权利要求1所述的吡唑并吡啶类化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤1完成后通过薄层色谱法检测反应。3.根据权利要求1所述的吡唑并吡啶类化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤2中
的萃取过程中使用乙酸乙酯作为萃取剂。4.根据权利要求1所述的吡唑并吡啶类化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤2、步骤3和步骤4中的洗脱过程中使用乙酸乙酯和石油醚为洗脱剂。5.根据权利要求1所述的吡唑并吡啶类化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤3和步骤4中的萃取过程中使用二氯甲烷作为萃取剂。6.一种吡唑并吡啶类化合物，结构式为：或者r为h、4-f或者4-cf3。7.权利要求6所述的化合物在制备抗肝癌药物中的应用。

技术总结
本发明公开了一种吡唑并吡啶类化合物及其制备方法、应用，属于医药技术领域。本发明将吡唑并吡啶类似物和磺酰胺类化合物，利用骨架跃迁和拼合原理的化学设计方法有机结合在一起，与现有药物(例如索拉非尼)相比，本发明的化合物具有更好的抗癌效果。化合物具有更好的抗癌效果。化合物具有更好的抗癌效果。


技术研发人员：余盼 曹伟娅 余海洋 夏艾芯 严瑞卿 王元 谈新兰
受保护的技术使用者：安徽理工大学
技术研发日：2023.04.27
技术公布日：2023/9/22