一种用于还原脱氯的生物炭基菌剂材料的制备方法和应用

1.本发明涉及一种用于原位强化生物脱氯的生物炭固定化菌剂材料及其制备方法和应用，属于环境工程和污染处理工程技术领域。


背景技术：

2.土壤是生态圈的重要组成部分，是人类繁衍生息的最重要自然资源。土壤污染修复与水污染和大气污染的修复治理的区别较大，其修复过程耗费时间长，资金需求量大且处理过程相对复杂，并且很容易引发土壤的二次污染。同时，土壤污染类型较多，部分区域土壤污染问题严重，有的甚至呈现一次污染物和二次污染物并存，有机无机复合污染物并存的情况，导致现有土壤污染修复治理面临的形式十分严峻。
3.现有土壤污染的主要修复技术有生物修复、物理化学修复及联合修复技术等。其中原位生物修复法对土的扰动较小、成本较低且对环境更为友好更为环保，因此在土壤修复工程中研究广泛。土壤原位生物脱氯技术是模拟土壤自净过程，微生物在缺氧环境下通过呼吸作用发生还原脱氯反应，实现卤代有机物的脱氯脱毒。但是现有厌氧还原脱氯反应的脱卤呼吸菌在面对负载冲击、高度异质的环境介质时，在很大程度上受到限制，故在实验及工程中通常将微生物负载在生物炭、麦麸和蒙脱石等载体上。但在土壤原位生物修复过程中，所需要的微生物固定化菌剂量较大，上述载体无法满足。因此，提供一种能够稳定规模化应用于土壤原位强化生物脱氯的生物炭固定化菌剂，在为还原脱氯菌提供庇护所的同时，降低复杂环境带来的修复风险，来强化土壤原位生物修复过程是十分必要的。


技术实现要素：

4.本发明针对现有厌氧还原脱氯反应的脱卤呼吸菌难以面对负载冲击、高度异质的环境介质，且难以稳定规模化制备生物炭固定化菌剂的问题，提供一种用于原位强化生物脱氯的生物炭固定化菌剂材料及其制备方法和应用，该生物炭固定化菌剂材料适用于规模化的土壤原位强化生物脱氯，实现土壤中卤代有机物污染的强化和可持续性修复。
5.本发明的技术方案：
6.本发明的目的之一是提供一种表面活性剂改性生物炭载体的方法，该方法具体为：将生物质生物炭在tx-100溶液或feso4溶液中浸泡24h，过滤，沉淀洗涤至中性，烘干，得到改性后生物炭。
7.进一步限定，tx-100溶液的质量浓度为1％。
8.进一步限定，feso4溶液浓度为1mol/l。
9.进一步限定，生物质生物炭制备过程为将：生物质烘干后置于管式炉中，以5℃/min的速率升温至600℃，保温2h，降至室温，过筛，得100～200目生物质生物炭。
10.更进一步限定，生物质为玉米秸秆。
11.本发明的目的之二是提供一种上述表面活性剂改性生物炭载体负载脱卤呼吸菌的方法，具体的该方法为：
12.将无菌初始培养液置于厌氧发酵罐中，加入终浓度为200μmol/l的目标卤代有机物，然后接种脱卤呼吸菌，并加入上述方法制备的表面活性剂改性生物炭载体，培养14天后，得到生物炭固定化菌剂材料。培养期间定期补充碳源以及目标卤代有机物。
13.进一步限定，无菌初始培养液ph为7.0。
14.更进一步限定，使用pbs缓冲体系调节无菌初始培养液的ph。
15.进一步限定，脱卤呼吸菌为以卤代有机物为电子受体的厌氧微生物，接种质量为无菌初始培养液体积的10％。
16.更进一步限定，脱卤呼吸菌包括但不限于硬壁菌门的脱硫杆菌属(desulfitobacterium spp.)，脱毛杆菌属(dehalobacterspp.)，变形菌门的地杆菌属(geobacterspp.)，脱硫菌(desulfomonilespp.)，脱氯性厌氧杆菌(anaeromyxobacterdehalogenans)，去氯鸟粪脱硫弧菌(desulfovibriodechloracetivorans)和硫孢子菌属(sulfosprillumspp.)，绿弯菌门的dehalococcoidesspp。
17.更进一步限定，脱卤呼吸菌为针对具体卤代有机物为目标污染物驯化的复合菌群或分离的单一菌种。
18.进一步限定，目标卤代有机物为2,4,6-tcp(2,4,6-三氯酚)。
19.本发明的目的之三是提供一种上述方法制备得到的生物炭固定化菌剂材料的应用，具体的用于原位强化生物对土壤、地表水、地下水和厌氧反应器中卤代有机污染物的脱氯脱毒。
20.进一步限定，生物炭固定化菌剂材料用于土壤原位强化生物脱氯的方法为：采用土壤追肥方式，将生物炭固定化菌剂材料投加到土壤中，同时在土壤上覆膜保持厌氧状态，并防止水分蒸发保持土壤中含水率大于20％。
21.本发明利用表面活性剂对生物质生物炭进行改性，强化生物炭的亲水性或电子传递效率，并采用混合厌氧培养使脱卤呼吸菌在改性后生物炭上分布更均匀，大大增加微生物的负载量，使制得的负载脱卤呼吸菌的生物炭固定化菌剂材料集吸附和生物修复功能为一体，其中生物炭可以预先集中污染物，或者促进微生物的聚集，从而缩短污染物和微生物之间的接触距离；并且在某些不同微生物之间的共培养中，生物炭也可以促进了种间直接电子传递，对生物修复过程起到了强化作用；同时生物炭可以降低环境中的污染物浓度，为功能微生物提供了良好的反应环境，使得生物炭固定化菌剂在土壤中持续作用时间长，尽可能降低了外加物质对土壤的影响，是一种理想的土壤原位生物修复功能材料。此外，本发明提供的生物炭固定化菌剂材料的方法更适用于规模化生产，更容易应用于实际的工程修复中。
附图说明
22.图1为实施例1制备的生物炭固定化菌剂材料的实物图；
23.图2为实施例1制备的生物炭固定化菌剂材料降解2,4,6-tcp的污染物及产物浓度变化曲线；
24.图3为实施例1制备的生物炭固定化菌剂材料的xrd曲线；
25.图4为实施例2制备的生物炭固定化菌剂材料降解2,4,6-tcp的污染物及产物浓度
变化曲线；
26.图5为实施例2制备的生物炭固定化菌剂材料的傅里叶红外光谱曲线。
具体实施方式
27.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。所用材料、试剂、方法和仪器，未经特殊说明，均为本领域常规材料、试剂、方法和仪器，本领域技术人员均可通过商业渠道获得。
28.下述实施例中使用的玉米秸秆为北京和牧同兴农牧科技有限公司生产，粒径为小于60目；feso4·
7h2o为上海阿拉丁生化科技股份有限公司生产；曲拉通tx-100为上海阿拉丁生化科技股份有限公司生产，无色透明粘稠液体。
29.实施例1：
30.步骤1：制备改性后生物炭
31.首先，取玉米秸秆洗净，然后在105℃烘箱中烘干处理24h，将得到的粉末装于棕色瓶中保存。
32.然后，称取10g秸秆粉末于管式炉中，烧制生物炭。具体的升温程序为：5℃/min，上升至目标温度600℃，保持2h。待热解结束温度降至室温时，称重并将制得生物炭的过筛，保留100～200目生物炭。
33.最后，将10g上述生物炭浸泡于100ml1mol/lfeso4·
7h2o中，24h后过滤并用蒸馏水淋洗生物炭至中性，70℃烘干后，得到改性后生物炭，如图1所示。
34.步骤2：制备生物炭固定化菌剂材料
35.首先，按照下列配方以去离子水配制lb液体培养基：25g/llb肉汤；将配制好的lb液体培养基0.8l倒入1l锥形瓶内，盖上封口膜，121℃高压蒸汽灭菌30min，得到无菌lb液体培养基。将菌株接种到无菌lb液体培养基中，放在气浴恒温振荡器中于150rpm、30℃下振荡48h。将制备好的菌液取出6000rpm离心10分钟，用0.85％生理盐水溶液洗涤两次后，重悬于生理盐水中，调整od
600
＝0.1，得到脱卤呼吸菌母液。
36.然后，按照下列配方以去离子水配制厌氧液体培养基：1g/lnacl，0.2g/lmgcl2·
6h2o，2.31g/lna2hpo4·
12h2o，0.554g/lnah2po4·
2h2o，0.13g/lnh4cl，0.3g/lkcl，0.012g/lcacl2，0.1ml/l矿质元素。矿质元素基础液配方为：0.5mg/lmncl2·
4h2o，0.5mg/lzncl2，0.5mg/lnicl2·
6h2o，0.5mg/lh3bo3，0.5mg/lna2moo4·
2h2o，2.5mg/lcocl2·
6h2o，0.5mg/lnh4vo3，2.5mg/lki，10mg/l(napo3)
16
；将配制好的厌氧培养基1l倒入1.2l血清瓶内。
37.再然后，将10g改性后的生物炭载体加入到上述血清瓶中，高纯氮气吹脱20min进行除氧处理，封闭容器，121℃高压蒸汽灭菌30min，得到无菌初始培养液。向血清瓶内依次注入终浓度为2mmol/lna2s溶液、1ml浓度为2mol/l的乙酸钠溶液、1ml维生素、终浓度为200μmol/l2,4,6-三氯酚(2,4,6-tcp)溶液，接种体积为无菌初始培养液体积10％的脱卤呼吸菌母液。
38.最后，将血清瓶放入30℃恒温培养箱中培养，期间定期取样检测2,4,6-三氯酚及其脱氯产物2,4-二氯酚、4-氯酚的浓度，并定期补充乙酸钠溶液和2,4,6-三氯酚。培养14天后获得生物炭固定化菌剂材料。
39.另取一个120ml血清瓶，按照上述成分配制同样的厌氧液体培养基，将配制好的厌
氧培养基100ml倒入120ml血清瓶内，将已获得的附着厌氧脱氯菌的生物炭固定化菌剂材料0.1g加入到血清瓶内，纯氮气吹脱20min进行除氧处理，封闭容器。向血清瓶内依次注入终浓度为2mmol/lna2s溶液、0.1ml浓度为2mol/l乙酸钠溶液、0.1ml维生素、终浓度为200μmol/l2,4,6-三氯酚(2,4,6-tcp)溶液。定期检测目标污染物2,4,6-tcp以及脱氯产物浓度。获得的目标污染物定期检测结果如图2所示，由图可知，2,4,6-tcp首次加入后立即被功能材料大量吸附，吸附量为15％左右；在第5天溶液中2,4,6-tcp浓度降低为0，且脱氯产物2,4-二氯酚和4-氯酚的浓度明显增加；在第6天溶液中4-氯酚浓度增加到75μm左右，2,4-二氯酚浓度降低为0，材料对4-氯酚吸附量为55％左右。结果表明：生物炭固定化菌剂材料为脱卤呼吸菌提供了良好的反应场所，对生物脱氯反应起到了强化作用。且材料吸附性佳，先吸附再降解的模式使修复效率大大增加。
40.对本实施例得到的生物炭固定化菌剂材料进行xrd表征，结果如图3所示，采用fe
2+
改性后的生物炭上有羟基氧化铁(feooh)出现，即针铁矿的主要成分，由于半导体矿物介导微生物种间电子传递过程在生物圈中，微生物分泌的代谢物也可以被其他微生物所利用，寄养微生物对代谢物的消耗会加速供养微生物的代谢以产生更多的代谢物，同时矿物在微生物与终端电子受体之间可以起到介导电子传递作用，综上可以确定，生物炭固定化菌剂材料的生物炭上feooh的生成，对cp-1降解2,4,6-tcp有一定的促进效果。
41.实施例2：
42.步骤1：制备改性后生物炭
43.首先，取玉米秸秆洗净，在105℃烘箱中烘干处理24h，将秸秆粉末装于棕色瓶中保存。
44.然后，称取10g上述秸秆粉末于管式炉中，烧制生物炭。具体的升温程序为：5℃/min，上升至目标温度600℃，保持2h。待热解结束温度降至室温时，称重并将制得生物炭的过筛，保留100～200目生物炭。
45.最后，将10g上述生物炭浸泡于100ml1wt％tx-100中，24h后过滤并用蒸馏水淋洗生物炭至中性，70℃烘干后，得到改性后生物炭。
46.步骤2：制备生物炭固定化菌剂材料
47.首先，按照下列配方以去离子水配制lb液体培养基：25g/llb肉汤；将配制好的lb液体培养基0.8l倒入1l锥形瓶内，盖上封口膜，121℃高压蒸汽灭菌30min，得到无菌lb液体培养基。将菌株接种到无菌lb液体培养基中，放在气浴恒温振荡器中于150rpm、30℃下振荡48h。将制备好的菌液取出6000rpm离心10分钟，用0.85％生理盐水溶液洗涤两次后，重悬于生理盐水中，调整od
600
＝0.1，得到脱卤呼吸菌母液。
48.然后，按照下列配方以去离子水配制厌氧液体培养基：1g/lnacl，0.2g/lmgcl2·
6h2o，2.31g/lna2hpo4·
12h2o，0.554g/lnah2po4·
2h2o，0.13g/lnh4cl，0.3g/lkcl，0.012g/lcacl2，0.1ml/l矿质元素。矿质元素基础液配方为：0.5mg/lmncl2·
4h2o，0.5mg/lzncl2，0.5mg/lnicl2·
6h2o，0.5mg/lh3bo3，0.5mg/lna2moo4·
2h2o，2.5mg/lcocl2·
6h2o，0.5mg/lnh4vo3，2.5mg/lki，10mg/l(napo3)
16
；将配制好的厌氧培养基1l倒入1.2l血清瓶内。
49.再然后，将10g改性后的生物炭载体加入到上述血清瓶中，高纯氮气吹脱20min进行除氧处理，封闭容器，121℃高压蒸汽灭菌30min，得到无菌初始培养液。向血清瓶内依次注入终浓度为2mmol/lna2s溶液、1ml浓度为2mol/l的乙酸钠溶液、1ml维生素、终浓度为200
μmol/l2,4,6-三氯酚(2,4,6-tcp)溶液，接种体积为无菌初始培养液体积10％的脱卤呼吸菌母液。
50.最后，将血清瓶放入30℃恒温培养箱中培养，期间定期取样检测2,4,6-三氯酚及其脱氯产物2,4-二氯酚、4-氯酚的浓度，并定期补充乙酸钠溶液和2,4,6-三氯酚。培养14天后获得生物炭固定化菌剂材料。
51.另取一个120ml血清瓶，按照上述成分配制同样的厌氧液体培养基，将配制好的厌氧培养基100ml倒入120ml血清瓶内，将已获得的附着厌氧脱氯菌的生物炭固定化菌剂材料0.1g加入到血清瓶内，纯氮气吹脱20min进行除氧处理，封闭容器。向血清瓶内依次注入终浓度为2mmol/lna2s溶液、0.1ml浓度为2mol/l乙酸钠溶液、0.1ml维生素、终浓度为200μmol/l2,4,6-三氯酚(2,4,6-tcp)溶液。定期检测目标污染物2,4,6-tcp以及脱氯产物浓度。获得的目标污染物定期检测结果如图4所示，2,4,6-tcp首次加入后立即被功能材料大量吸附，吸附量为10％左右；在第5天溶液中2,4,6-tcp浓度降低为0，且脱氯产物2,4-二氯酚和4-氯酚的浓度明显增加；在第6天溶液中4-氯酚浓度增加到80μm左右，2,4-二氯酚浓度降低为0，材料对4-氯酚吸附量为60％左右。结果表明：生物炭固定化菌剂材料为脱卤呼吸菌提供了良好的反应场所，对生物脱氯反应起到了强化作用。且材料吸附性佳，先吸附再降解的模式使修复效率大大增加。
52.对本实施例得到的生物炭固定化菌剂材料进行傅里叶红外光谱表征，结果如图5所示，改性后的生物炭材料主要的吸收峰存在于3400cm-1
、1600cm-1
、1100cm-1
附近，其对应官能团分别为o-h、c＝o和c-o。羧基(-cooh)、羟基(-oh)和羰基(-c＝o)等均为强极性基团，具有极性基团的物质亲水性较好。由傅里叶红外光谱图可以看出，改性后生物炭官能团强度有所增强，有利于亲水性提高。由于很多微生物属于亲水性微生物，亲水性强的多孔载体附着微生物稳定性好，将表现出更高的挂膜速度。同时，改性提升了生物炭的亲水性，对亲水性有机物的吸附量增加，而对疏水性有机物的吸附量减少。实验涉及污染物2,4,6-tcp疏水性较强，而产物2,4-dcp与4-cp随着氯离子的脱除亲水性逐渐增强，与实验中生物炭对2,4,6-tcp和4-cp吸附效果相吻合。
53.综上，由实施例1和实施例2可知，以feso4·
7h2o或曲拉通tx-100两种不同改性药剂改性的生物炭固定化菌剂材料均可强化脱卤呼吸菌对2,4,6-三氯酚的脱氯反应。以曲拉通tx-100改性的生物炭固定化菌剂材料因其使生物炭的亲水性增强、微生物负载量增加使降解速率更快。进一步的采用1.2l的体系模拟生产中改性生物炭负载脱卤呼吸菌的步骤，其结果表明规模化生产采用此方法同样适用。本发明提供的生物炭固定化菌剂材料的制备方法、脱卤呼吸菌的负载方法、土壤中卤代有机污染原位生物修复方法在规模化应用中均具有显著优势并值得进一步推广。
54.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，鉴于本发明所属领域的技术人员可以对上述实施方式进行适当的变更和修改，因此，本发明并不局限于上面所述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围之内。

技术特征：
1.一种表面活性剂改性生物炭载体的方法，其特征在于，将生物质生物炭在tx-100溶液或feso4溶液中浸泡24h，过滤，沉淀洗涤至中性，烘干，得到改性后生物炭。2.根据权利要求1所述的表面活性剂改性生物炭载体的方法，其特征在于，tx-100溶液的质量浓度为1％。3.根据权利要求1所述的表面活性剂改性生物炭载体的方法，其特征在于，feso4溶液浓度为1mol/l。4.根据权利要求1所述的表面活性剂改性生物炭载体的方法，其特征在于，生物质生物炭制备过程为将：生物质烘干后置于管式炉中，以5℃/min的速率升温至600℃，保温2h，降至室温，过筛，得100～200目生物质生物炭。5.一种权利要求1所述的方法得到的表面活性剂改性生物炭载体的应用，其特征在于，用于负载脱卤呼吸菌。6.一种生物炭基菌剂材料的方法，其特征在于，该方法为：将无菌初始培养液置于厌氧发酵罐中，加入终浓度为200μmol/l的目标卤代有机物，然后接种脱卤呼吸菌，并加入权利要求1～4任一项所述的方法制备的表面活性剂改性生物炭载体，30℃恒温培养14天后，得到生物炭基菌剂材料。7.根据权利要求6所述的生物炭基菌剂材料的方法，其特征在于，无菌初始培养液ph为7.0，使用pbs缓冲体系调节无菌初始培养液的ph。8.根据权利要求6所述的生物炭基菌剂材料的方法，其特征在于，脱卤呼吸菌为以卤代有机物为电子受体的厌氧微生物，接种体积为无菌初始培养液体积的10％。9.根据权利要求6所述的生物炭基菌剂材料的方法，其特征在于，脱卤呼吸菌包括硬壁菌门的脱硫杆菌属、脱毛杆菌属、变形菌门的地杆菌属、脱硫菌、脱卤性厌氧杆菌、去氯鸟粪脱硫弧菌、硫孢子菌属(sulfosprillumspp.)和绿弯菌门的dehalococcoidesspp。10.一种权利要求6所述的方法制备得到的生物炭基菌剂材料的应用，其特征在于，用于强化生物对土壤、地表水、地下水和厌氧反应器中卤代有机污染物的还原脱氯脱毒。

技术总结
本发明公开了一种用于还原脱氯的生物炭基菌剂材料的制备方法和应用，属于环境工程和污染处理工程技术领域。本发明解决了现有厌氧还原脱氯反应的脱卤呼吸菌难以面对负载冲击、高度异质的环境介质，且难以稳定规模化制备生物炭固定化菌剂的问题。本发明利用表面活性剂对生物质生物炭进行改性，强化生物炭的亲水性或电子传递效率，并采用混合厌氧培养使脱卤呼吸菌在改性后生物炭上分布更均匀，大大增加微生物的负载量，使制得的负载脱卤呼吸菌的生物炭固定化菌剂材料集吸附和生物修复功能为一体，增加在土壤中持续作用时间的同时，尽可能降低了外加物质对土壤的影响，是一种理想的土壤原位生物修复功能材料。壤原位生物修复功能材料。壤原位生物修复功能材料。


技术研发人员：李智灵 杨温欣 王爱杰 陈雪琪 孙凯
受保护的技术使用者：哈尔滨工业大学
技术研发日：2023.05.18
技术公布日：2023/9/22