LATS1蛋白在阿霉素肾病足细胞损伤中的调控应用

lats1蛋白在阿霉素肾病足细胞损伤中的调控应用
技术领域
1.本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及lats1蛋白在阿霉素肾病足细胞损伤中的调控应用。


背景技术：

2.慢性肾脏疾病(chronic kidney disease，ckd)目前已经成为危害社会的重大公共卫生问题并随着发病率的增加加重了医疗和社会资源负担。局灶性节段性肾小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis，fsgs)是世界范围内肾脏疾病的病因，也是终末期肾脏疾病的重要原因。然而，fsgs的机制还有待研究。目前认为fsgs的共同特征是足细胞损伤和脱落。足细胞作为一种高度分化的不可再生细胞，维持了肾小球滤过屏障的完整性，并且参与了肾小球疾病的发生、发展。此外，在正常状态下足细胞可以分泌纤维连接蛋白(fibular connexin，fn)和iv型胶原，在促肾纤维化因子的刺激下足细胞还可以分泌组织蛋白酶和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，mmps),fn和iv型胶原是肾小球基底膜的主要组成成分，而mmps和组织蛋白酶具有降解肾小球基底膜的作用。因此足细胞可以参与肾小球基底膜的代谢平衡。然而，足细胞损伤后的修复机制尚不明确。
3.此前已知hippo信号通路可以调节器官的大小和生长，但近期更多的证据表明hippo信号通路在肿瘤发生、转移、细胞增殖和细胞凋亡中发挥着关键作用。这一通路最初是在黑腹果蝇中被发现并进行研究的，它在不同的物种间高度保守。hippo信号通路中的哺乳动物ste20样蛋白激酶1(mammalian ste20-like protein kinase 1，mst1/2)激酶在发生磷酸化以后可以激活大型肿瘤抑制蛋白激酶1(large tumor suppressor kinase 1，lats1/2)及其辅助因子mob激酶活化因子1(mob kinase activator 1，mob1)，而激活的lats1可以磷酸化并抑制下游的效应因子yes相关转录调控因子(yes associated transcriptionalregulator，yap)，阻止其转位到细胞核。非磷酸化状态的yap进入细胞核可以引起teads、smad、runx和cygf等转录因子的激活。hippo信号通路在维持足细胞稳态、肾小球滤过屏障完整性和肾纤维化中发挥了不可或缺的作用。最近有研究表明，hippo信号通路中的mst1/2的缺乏可以导致ckd。
4.lats1/2激酶可以磷酸化下游的yap和含ww结构与的转录调节因子(ww domain containing transcription regulator 1，taz)，是hippo信号通路中肿瘤抑制子之一。除了在hippo信号通路中的关键作用外，lats1还可以通过调控细胞凋亡和细胞周期进程抑制体外细胞增殖。研究表明，lats1缺失会导致生殖细胞凋亡增加。有报道称，抑制lats1可以减轻神经元的凋亡。阿霉素肾病模型(adriamycin nephropathy，an)是一种利用阿霉素(adriamycin，adr)干预动物或体外细胞，使其表现出与局灶性节段性硬化性肾病患者相似的病理特征的慢性肾脏病模型。而balb/c小鼠对阿霉素的敏感性较高，因此本发明采用此实验动物。许多研究表明，adr引起的肾损伤受非免疫和免疫因素的调节，并促进了对肾小管间质损伤机制的研究。但目前adr对足细胞的作用机制探索尚不全面，lats1是否参与阿霉素诱导足细胞凋亡的相关研究，国内外尚未见报道。


技术实现要素：

5.(一)解决的技术问题
6.针对现有技术的不足，本发明提供了lats1蛋白在阿霉素肾病足细胞损伤中的调控应用，具体的本发明通过模拟构建体内外阿霉素损伤模型，进而探讨lats1在阿霉素诱导的足细胞凋亡及上皮间质转化中的作用，阐述了hippo信号通路中的lats1蛋白对足细胞的损伤修复机制，为fsgf的发病机制和治疗开辟了新的思路。
7.(二)技术方案
8.为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：
9.本发明提供了lats1蛋白在阿霉素肾病足细胞损伤中的调控应用，所述阿霉素肾病足细胞损伤是阿霉素通过hippo信号通路诱导了足细胞损伤，所述lats1蛋白在阿霉素肾病足细胞损伤中的调控应用是通过控制lats1的表达来调控对阿霉素肾病足细胞损伤的修复实现的。
10.具体地，是通过上调lats1的表达实现改善阿霉素诱导的足细胞损伤的细胞凋亡和上皮间质转化的情况。
11.具体地，是通过上调lats1的表达逆转阿霉素诱导的足细胞中n-cadherin蛋白水平的升高和e-cadherin蛋白水平的减少，进而实现改善阿霉素诱导的足细胞损伤的上皮间质转化的情况。
12.具体地，last1是通过cytokine-cytokine受体相互作用中对足细胞产生影响，具体地，在阿霉素诱导的足细胞损伤中，lats1的表达下调，通过上调lats1的表达进而降低了ccl2和csf3的表达，lats1是修复阿霉素诱导的足细胞损伤的关键信号。
13.(三)有益效果
14.本发明提供了lats1蛋白在阿霉素肾病足细胞损伤中的调控应用，具体的本发明通过模拟构建体内外阿霉素损伤模型，进而探讨lats1在阿霉素诱导的足细胞凋亡及上皮间质转化中的作用，阐述了hippo信号通路中的lats1蛋白对足细胞的损伤修复机制；所述lats1蛋白在阿霉素肾病足细胞损伤中的调控应用是通过控制lats1的表达来调控对阿霉素肾病足细胞损伤的修复实现的；具体地，是通过上调lats1的表达实现改善阿霉素诱导的足细胞损伤的细胞凋亡和上皮间质转化的情况。因此，lats1蛋白能够作为局灶性节段性肾小球硬化细胞损伤修复调控的新靶标，有利于开发更多用于预防或治疗局灶性节段性肾小球硬化病症的药物，为fsgf的发病机制和治疗开辟了新的思路。
附图说明
15.图1为adr组和nc组第0天、第7天、第14天，第28天的24小时尿蛋白(图1a)、血总胆固醇(图1b)、血肌酐(图1c)、血白蛋白(图1d)水平的变化图。
16.图2为第28天检测结束后取adr组和nc组肾脏组织的he染色图。
17.图3为第28天检测结束后取adr组和nc组肾脏组织的tunel染色图。
18.图4为阿霉素刺激12小时对足细胞凋亡的影响，其中图4a为小鼠足细胞凋亡相关蛋白免疫印迹及半定量分析，gapdh作为对照，(n＝3)“*”代表p《0.05，“**”代表p《0.01；图4b为tunel检测，蓝色代表细胞核，红色代表凋亡细胞；图4c为流式细胞术检测阿霉素刺激前后小鼠足细胞凋亡数目，其中q1：(annexin v-apc)-/pi+：坏死细胞；q2：(annexin vapc)
+/pi+：晚期凋亡细胞；q3：(annexi9n v-apc)+/pi-：早期凋亡细胞；q4：(annexin v-apc)-/pi-：活细胞“*”代表p《0.05。
19.图5为阿霉素刺激小鼠足细胞后的差异表达分析(图5a)全转录组mrna火山图和差异表达mrna聚类分析热图(图5b)。
20.图6为转录组测序中的hippo信号通路中关键基因的表达变化；“*”代表p《0.05，“**”代表p《0.01。
21.图7为阿霉素干预前后hippo信号通路关键基因的mrna水平变化；“*”代表p《0.05，“**”代表p《0.01。
22.图8为阿霉素干预前后小鼠肾脏组织免疫组织化学染色检测lats1的表达变化。
23.图9为阿霉素干预前后小鼠肾小球中yap的定位表达情况。
24.图10为阿霉素干预小鼠足细胞后hippo信号通路关键蛋白表达变化。
25.图11为阿霉素干预签好后足细胞中yap的定位。
26.图12为将小鼠足细胞置于含有过表达lats1质粒的培养基中培养48小时后，用western-blot检测lats1蛋白表达，gapdh作为对照；q-pcr检测lats1基因表达水平，gapdh作为对照；“*”代表p《0.05，“**”代表p《0.01。
27.图13为将小鼠足细胞置于含有过表达lats1质粒的培养基中培养48小时后，用western-blot检测lats、p-yap-s397、p-yaps127和yap蛋白的表达，gapdh作为对照；“*”代表与对照组(adr-，lv-lats1-)相比p《0.05，“#”代表与阿霉素组(adr+，lv-lats1-)相比p《0.05。
28.图14为过表达lats1后小鼠足细胞中凋亡水平变化；其中图14a为western-blot检测c-parp、c-caspase 3蛋白的表达，柱状图为对应的免疫印迹半定量结果；图14b为流式细胞术检测小鼠足细胞凋亡q1：(annexin v-apc)-/pi+：坏死细胞；q2：(annexin v-apc)+/pi+：晚期凋亡细胞；q3：(annexin v-apc)+/pi-：早期凋亡细胞；q4：(annexin v-apc)-/pi-：活细胞：“*”代表与对照组(adr-，lv-lats1-)相比p《0.05，“**”代表与对照组(adr-，lv-lats1-)相比p《0.01，“#”代表与阿霉素组(adr+，lv-lats1-)相比p《0.05，“##”代表与阿霉素组(adr+，lv-lats1-)相比p《0.01。
29.图15为过表达lats1对足细胞上皮间质转化的影响；其中图15a为western-blot检测ecadheri及n-cadherin蛋白的表达，“*”代表与对照组(adr-，lv-lats1-)相比p《0.05，“**”代表与对照组(adr-，lv-lats1-)相比p《0.01，“#”代表与阿霉素组(adr+，lv-lats1-)相比p《0.05；其中图15b为将状态良好的小鼠足细胞均匀的铺进激光共聚焦培养皿中，实验组转染lats1过表达质粒36小时后更换培养基并加入阿霉素，12小时后用激光共聚焦显微镜观察e-cadherin的定位及表达。
30.图16为小鼠足细胞过表达lats1后的差异表达分析，其中图16a为全转录差异表达基因火山图；16b为差异表达基因聚类分析热图；16c为聚类id着色的网络图；16d为由p值着色的网络图；16e为显示了上调或下调排名前十的基因，相对基因表达用fpkm值表示。
31.图17为差异表达基因gd和kegg富集分析。
具体实施方式
32.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，
对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
33.实施例
34.1阿霉素肾病模型的构建
35.1.1阿霉素肾病小鼠模型生化指标的改变
36.选择8周龄的balb/c雄性小鼠，适应性饲养一周后将其随机分为两组，阿霉素干预组简称adr组，对照组简称nc组。分别于第1天、第8天、第15天按照adr浓度为4mg/kg对小鼠进行尾静脉注射给药。分别测第0天、第7天、第14天，第28天的24小时尿蛋白(图1a)、血总胆固醇(图1b)、血肌酐(图1c)、血白蛋白(图1d)水平的变化。
37.结果显示，adr组与nc组相比，24小时尿蛋白在第7天、第14天、第28天增加率分别为50.81％、218.33％和319.12％，差异有统计学意义(p《0.05)。与24小时尿蛋白的结果一致，adr组血总胆固醇水平在第14天、第28天增加率分别为66.89％和82.77％，差异有统计学意义(p《0.05)。adr组较nc组血肌酐在第14天、第28天的增加率分别为31.05％和50.94％，差异有统计学意义(p《0.05)。adr组血白蛋白水平在14天出现显著降低，下降率为8.23％，28天时进一步降低，下降率为21.56％，差异有统计学意义(p《0.05)。说明adr可以引起balb/c雄性小鼠出现肾脏损伤。
38.1.2阿霉素引起局灶节段性肾小球硬化
39.第28天检测结束后取肾脏后做he染色，结果发现正常对照组的小鼠肾小球未发生明显的病变。adr组的小鼠肾脏切片可以观察到皮髓交界处肾小球内系膜区细胞外基质增多，局部发生球囊粘连、硬化。此外，adr组肾小管可见明显的透明管型，结果如图2所示。
40.1.3阿霉素诱导小鼠肾脏凋亡细胞增加
41.在阿霉素干预小鼠后4周后分别取两组小鼠肾脏做tunel染色。结果发现，阿霉素处理后的小鼠凋亡细胞数较nc组增加，结果图3所示。
42.1.4阿霉素诱导足细胞凋亡
43.western-blot结果显示(图4a左)，0.5μg/ml阿霉素干预小鼠足细胞12小时后，cleaved-papr(c-parp)、cleaved-caspase 3(c-caspase 3)凋亡蛋白表达明显增多(图4a右)，差异有统计学意义(p《0.05)。tunel检测adr组与nc组相比凋亡的足细胞数增加(图4b)。流式细胞计数显示阿霉素刺激后凋细胞明显增加(图4c)，差异有统计学意义(p《0.05)。
44.2阿霉素刺激小鼠足细胞后转录组测序分析
45.2.1差异表达分析
46.对足细胞实验组(0.5μg/ml阿霉素处理12小时)和对照组进行了mrna测序并按照校正后的p《0.001，|log2fold change|》1筛选了差异表达mrna。我们共筛选出4894个差异表达的mrna，其中有3000个mrna表达上调，1894个mrna表达下调(图5a)。如图5b所示，我们对筛选出的4894个差异表达的mrna进行热图双向聚类分析以了解差异表达mrna在阿霉素干预前后的表达水平变化。
47.2.2rna-seq中hippo信号通路关键mrna的相对表达
48.将转录组测序中的hippo信号通路中关键基因的相对表达量进行了比较，发现adr
组中sav1、mst1、mob1b和yap1的表达较nc组增多，差异有统计学意义(p《0.05)。adr组与nc组相比lats1的表达减少(图6)，差异有统计学意义(p《0.05)。
49.2.3q-pcr检测hippo信号通路关键mrna的相对表达量
50.为了验证转录组测序中hippo信号通路的改变，我们利用q-pcr检测了hippo信号通路中关键mrna的相对表达量，发现adr组mst1和mob1b的表达较nc组增多，差异有统计学意义(p《0.05)，这与转录组测序中的变化趋势一致。adr组与nc组相比lats1的表达减少，差异有统计学意义(p《0.05)这也验证了转录组测序中的变化趋势(图7)。
51.3阿霉素对hippo信号通路的影响
52.3.1阿霉素肾病小鼠肾脏中lats1表达
53.对阿霉素诱导的肾病模型肾组织进行lats1免疫组织化学染色发现，lats1在肾小管及肾小球均表达，并且发现阿霉素可以降低lats1在细胞质及细胞核中的表达(图8)，差异有统计学意义(p《0.05)。
54.3.2阿霉素肾病小鼠肾脏中yap定位
55.对小鼠肾小球进行免疫荧光染色，结果如图9所示，阿霉素诱导后的小鼠与对照组小鼠肾小球相比yap的定位无明显改变。
56.3.3小鼠足细胞中hippo信号通路关键蛋白表达变化
57.western-blot结果及其灰度图显示，阿霉素可以导致lats1蛋白表达水平降低(图10a)；也可以导致yap蛋白在ser397及ser127位点的磷酸化水平降低，差异有统计学意义(p《0.05)(图10b)。对sav1、mst1、mob1总蛋白表达影响不大。此外，mob1蛋白在thr35位点的磷酸化水平升高(图10d)，差异有统计学意义(p《0.05)。
58.3.4阿霉素可以促进小鼠足细胞中yap的转核
59.对将状态良好的小鼠足细胞均匀的铺在激光共聚焦培养皿中，阿霉素干预小鼠足细胞12小时后，用激光共聚焦显微镜观察yap的定位。结果如图11所示，结果显示阿霉素刺激12小时后的小鼠足细胞细胞质中yap明显向细胞核转移。
60.4过表达lats1对小鼠足细胞的影响
61.4.1过表达lats1验证
62.western-blot实验显示，转染了lats1过表达的质粒的小鼠足细胞中lats1蛋白水平较对照组升高(图12a)，差异具有统计学意义(p《0.05)。实时定量pcr检测显示转染过表达lats1质粒的小鼠足细胞中lats1水平明显升高(图12b)，差异具有统计学意义(p《0.05)。
63.4.2过表达lats1对足细胞中yap的改变
64.利用western-blot检测转染lats1过表达质粒对阿霉素刺激的小鼠足细胞中lats1蛋白水平的影响(图13a)，结果显示阿霉素刺激下lats1蛋白表达升高，差异具有统计学意义(p《0.05)。此外，我们检测了p-yap-s397、p-yap-s127和yap蛋白的表达变化(图13b)，结果显示lats1可以使yap在ser397及ser127位点发生磷酸化，差异具有统计学意义(p《0.05)。
65.4.3过表达lats1改善阿霉素诱导的足细胞凋亡
66.对小鼠足细胞转染了过表达lats1质粒36小时后加入阿霉素刺激12小时，western blot检测凋亡蛋白c-parp、c-caspase 3表达变化。结果如图14所示，结果显示，lats1可以逆转阿霉素诱导的c-parp、c-caspase 3蛋白的增多，差异有统计学意义(p《0.05)。此外，我
们利用流式细胞术检测凋亡水平变化，发现其变化与蛋白表达一致的趋势，差异有统计学意义(p《0.05)。
67.4.4过表达lats1改善阿霉素诱导的足细胞上皮间质转化
68.western-blot结果及其半定量灰度分析显示(图15a)，阿霉素可以导致小鼠足细胞中的上皮间质转化标志蛋白e-cadherin蛋白减少，n-cadherin蛋白增加，差均有统计学意义(p《0.05)。过表达lats1后可以部分逆转这一趋势，差异有统计学意义(p《0.05)。采用免疫荧光法观察e-cadherin在小鼠足细胞中的定位及变化(图15b)，结果显示阿霉素可以诱导e-cadherin蛋白减少。过表达lats1后，e-cadherin表达增多。
69.5小鼠足细胞过表达lats1后转录组测序分析
70.5.1小鼠足细胞过表达lats1后的差异表达分析
71.我们利用转录组分析检测过表达lats1后足细胞中的mrna改变。以p.value《0.05，fold change》1.5作为显著性变化条件筛选差异表达mrna，结果筛选出114个差异表达mrna。与对照组相比，lats1过表达组共发现28个高表达mrna，86个低表达mrna(图16)。
72.利用metascape网站对差异表达mrna进行富集分析。结果显示差异表达mrna主要富集在cytokine-cytokine受体相互作用、糖尿病并发症中的agerage信号通路、细胞死亡的正向调节、wnt信号通路等方面(图16c)。此外，我们结合p.value和fold change分别筛选出上调最显著的十个基因和下调最显著十个基因(图16e)。
73.5.2过表达lats1小鼠足细胞差异表达基因功能富集分析
74.为了进一步分析lats1引起的差异基因的功能，使用david网站(https://david.ncifcrf.gov/)进行go富集分析和kegg富集。结果如图17a所示。go的富集主要分为三个部分：生物过程、细胞组成和分子功能。从生物学过程来看，差异表达基因主要富集在免疫反应、趋化因子介导的信号通路、炎症反应、细胞对白细胞介素的反应等方面。在分子功能分类中，趋化因子活性显著富集。从细胞组成来看，差异表达基因主要富集于细胞趋化性和细胞对白细胞介素1的反应。然后，通过david对差异表达基因进行kegg富集，并识别出一些通路(图17b)，包括cytokine-cytokine receptor相互作用、chemokine信号通路、pi3k-akt信号通路、tnf信号通路等。
75.6结论
76.(1)阿霉素可以通过hippo信号通路诱导足细胞损伤。
77.(2)上调lats1可以改善阿霉素诱导的足细胞凋亡。
78.(3)上调lats1可以改善阿霉素诱导的上皮间质转化。
79.(4)lats1可能通过cytokine-cytokine受体相互作用对足细胞产生影响。
80.以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

技术特征：
1.lats1蛋白在阿霉素肾病足细胞损伤中的调控应用。2.根据权利要求1所述的lats1蛋白在阿霉素肾病足细胞损伤中的调控应用，其特征在于，通过控制lats1的表达来调控对阿霉素肾病足细胞损伤的修复。3.根据权利要求2所述的lats1蛋白在阿霉素肾病足细胞损伤中的调控应用，其特征在于，通过上调lats1的表达改善阿霉素诱导的足细胞损伤的细胞凋亡情况。4.根据权利要求2所述的lats1蛋白在阿霉素肾病足细胞损伤中的调控应用，其特征在于，通过上调lats1的表达改善阿霉素诱导的足细胞损伤的上皮间质转化情况。5.根据权利要求4所述的lats1蛋白在阿霉素肾病足细胞损伤中的调控应用，其特征在于，通过上调lats1的表达逆转阿霉素诱导的足细胞中n-cadherin蛋白水平的升高和e-cadherin蛋白水平的减少，进而实现改善阿霉素诱导的足细胞损伤的上皮间质转化的情况。6.根据权利要求1所述的lats1蛋白在阿霉素肾病足细胞损伤中的调控应用，其特征在于，阿霉素通过hippo信号通路诱导了足细胞损伤。7.根据权利要求1所述的lats1蛋白在阿霉素肾病足细胞损伤中的调控应用，其特征在于，last1在cytokine-cytokine受体相互作用中对足细胞产生影响，具体地，在阿霉素诱导的足细胞损伤中，lats1的表达下调，通过上调lats1的表达降低了ccl2和csf3的表达，lats1是修复阿霉素诱导的足细胞损伤的关键信号。

技术总结
本发明提供了LATS1蛋白在阿霉素肾病足细胞损伤中的调控应用，涉及生物医学技术领域。本发明通过模拟构建体内外阿霉素损伤模型，进而探讨LATS1在阿霉素诱导的足细胞凋亡及上皮间质转化中的作用，阐述了Hippo信号通路中的LATS1蛋白对足细胞的损伤修复机制；所述LATS1蛋白在阿霉素肾病足细胞损伤中的调控应用是通过控制LATS1的表达来调控对阿霉素肾病足细胞损伤的修复实现的；具体地，是通过上调LATS1的表达实现改善阿霉素诱导的足细胞损伤的细胞凋亡和上皮间质转化的情况。因此，LATS1蛋白能够作为局灶性节段性肾小球硬化细胞损伤修复调控的新靶标，有利于开发更多用于预防或治疗局灶性节段性肾小球硬化病症的药物，为FSGF的发病机制和治疗开辟了新的思路。的发病机制和治疗开辟了新的思路。的发病机制和治疗开辟了新的思路。


技术研发人员：周思捷 路雁惠 胡明阳 吕林晓 雷寓淇 常江 王慧娟 李嘉诚 潘少康 刘东伟 刘章锁
受保护的技术使用者：郑州大学第一附属医院
技术研发日：2023.05.19
技术公布日：2023/9/22