一种鉴别慢羽公鸡慢羽基因座基因型的方法

1.本发明涉及生物育种领域，特别是涉及一种鉴别鸡慢羽性状位点基因分型的方法。


背景技术：

2.现代养鸡生产中采用多种方法区分初生雏鸡的性别，主要有翻肛鉴别法、金银羽自别雌雄法、快慢羽自别雌雄法等。快慢羽自别雌雄法不受羽色限制，只要父本和母本组合正确，对任何羽色的初生雏鸡都可以使用，但快慢羽自别雌雄法也有其适用条件，只有在分别选育出快羽纯系和慢羽纯系，并进行合理的杂交配套，其后代初生雏鸡才能进行快慢羽自别雌雄。这种办法直观快捷，只需在雏鸡出壳后，肉眼观察翅膀上的羽毛生长速度即可，且雏鸡的应激反应小，不易对其造成伤害，而且简便易学，是目前广泛使用的自别雌雄的方法。培育快慢羽自别配套系的关键是慢羽公鸡纯合子的选育。在培育快羽纯系和慢羽纯系的过程中，最初的方法是根据表型鉴别，最适宜的鉴别时间是出雏后24h内，将主翼羽长于覆主翼羽2mm以上的表型划分为快羽型，其余的全归为慢羽型。根据表型鉴别存在一定的局限性，首先是有最佳鉴别时间限制；第二是公鸡的慢羽表型有纯合和杂合两种基因型所以仅凭表型鉴别需要至少3个世代才能培育出慢羽纯系，这样培育快慢羽自别雌雄配套系所需的时间就长；另外就是可以通过测交方法鉴别，该方法理论上一个世代即可纯合慢羽基因座，但是该方法费时费力，过程极易出错。综上，迫切需要用分子生物学方法鉴别鸡快慢羽基因型缩短慢羽纯系培育时间、降低养殖成本。
3.据相关报道，在分子水平研究发现，内源病毒21(ev21)与慢羽表型紧密连锁。经过多年的研究和发展，在慢羽鸡基因组中一个包括部分催乳素受体基因和部分编码精子鞭毛蛋白的基因的串联重复被发现，通过taqman技术对其进行检测可以鉴定慢羽鸡，但稳定性和精确度仍然有待提高。实时荧光定量pcr(quantitative real-time pcr)能在dna扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(pcr)循环后产物总量，通过内参或者外参法对待测样品中的特定dna序列进行定量分析，但是准确性差。最近研究中，李俊英提供了一种鉴别快慢羽基因型的新方法，该方法是针对与慢羽性状完全连锁的snp位点进行基因分型。该方法采用了酶切的方法对目的位点进行基因分型，根据酶切产物的片段大小判断快慢羽基因型。所述基因型的判断标准如下:酶切产物出现452bp和499bp两条特征条带，为快羽纯合基因型；酶切产物仅出现951bp一条特征条带，为慢羽纯合基因型；酶切产物出现452bp、499bp和951bp三条特征条带，为慢羽杂合基因型。专利内容显示这种鉴别鸡快慢羽基因型的分子方法，适用于国内多种地方鸡种以及国外引进的白来航鸡种，该方法在寿光鸡、自来航鸡、农大矮小鸡、北京油鸡、茶花鸡等品种中鉴别准确率达100％。
4.目前而言导致慢羽性状的致因突变已经鉴定，针对慢羽基因座分型的也有不同的思路，一种是用荧光定量pcr的方法针对致因位点进行分型，一种是针对与慢羽性状连锁的snp位点进行分型，两种方案各有优缺点。荧光定量pcr方法虽然是针对致因位点进行分型，但是其试验过程存在较大系统误差，针对snp位点进行分型方法简单，但是其并非针对致因
突变。因此，筛选一种可以应用于育种实践的简单、准确的快速鉴定慢羽性状的方法对于现存的技术问题的解决非常关键。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种鉴别慢羽公鸡慢羽慢羽基因座基因型的方法，以解决上述现有技术存在的问题，该方法通过目的snp位点两个峰值的信号高低就可以准确的区分慢羽纯合子和杂合子，简单易实现并且准确率高。
6.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
7.本发明提供一种鉴别慢羽公鸡慢羽慢羽基因座基因型的方法，包括以下步骤：以待测鸡的基因组dna为模板，利用引物对进行pcr扩增，获得扩增引物；对所述扩增引物进行直接测序后，对snp位点的测序结果进行解析，根据解析结果确定基因型；其中，所述目的snp位点位于鸡z染色体上第11534451bp，该位点存在a/g突变，所述z染色体的基因号为genbank:cp100594.1。
8.优选的是，所述引物对的核苷酸序列如下所示：
9.lff：5
’‑
gaactaactaccacagagagga-3’10.lfr：5
’‑
tcagctacctataaactaga-3’11.优选的是，所述基因型的判断方法为：若解析结果为“r”则判定为慢羽纯合子，若是g判定为慢羽杂合子。
12.本发明公开了以下技术效果：
13.本发明以已知基因型的慢羽杂合子和慢羽纯合子为材料，通过直接测序(sanger测序)鉴定与慢羽连锁的snp位点基因型的方法，直接测序后，对测序结果进行解析，根据解析结果对目的snp位点进行分型结果显示：若解析结果为“r”则判定为慢羽纯合子，若是g判定为慢羽杂合子。通过目的snp位点测序结果的解析就能直接判断慢羽纯合子和杂合子，相比通过荧光定量pcr方法鉴定慢羽突变相关致因突变基因型方法，在数据未处理前，无法完全准确区分纯合子和杂合子，在对原始数据进行处理后则可以区分慢羽纯合子和杂合子的情况，明显利用连锁snp方法分型的方法相对更为简单方便，且准确率达100％。本发明提供了一种新的鉴别慢羽性状的方法，为慢羽纯合子的选育提供理论基础。
附图说明
14.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
15.图1为目的位点基因型示意图；(a)为慢羽纯合子，(b)为慢羽杂合子；
具体实施方式
16.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
17.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发
明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
18.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
19.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
20.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
21.实施例1
22.1实验材料
23.已知基因型的慢羽纯合子良凤花鸡和杂合子良凤花鸡。dna模板来源于江西省地方鸡种遗传改良重点实验室；处理的血样来源于江西省地方鸡种遗传改良重点实验室。
24.2 实验方法
25.2.1 血样采集
26.翅下静脉采集血液0.5ml，置于含有70μl抗凝剂的离心管，-20℃保存备用。
27.2.2dna提取
28.基因组dna抽提按照omega公司的血液dna抽提说明书进行。将提取出来的dna样品用thermo nanodrop-2000进行检测浓度。
29.2.3引物设计
30.表1基因检测使用引物
[0031][0032]
2.4pcr扩增
[0033]
测定最适引物退火温度，进行引物退火温度梯度测定。该反应需配制20μl pcr反应体系，如表2所示：
[0034]
表2pcr反应体系
[0035][0036]
pcr反应程序设定如表3所示：
[0037]
表3pcr反应程序
[0038][0039]
2.5测序
[0040]
将扩增产物交由上海捷瑞生物工程有限公司进行测序。获得的慢羽性状相关目的位点序列如seq id no:3所示：
[0041]
[0042]
上述序列中标识底色阴影的部分时引物，[]为snp位点。
[0043]
3、结果与分析
[0044]
研究以已知基因型的24个慢羽纯合子和24个杂合子为材料，通过测序的方法对目的位点进行了基因分型。利用sequencing analysis software v7.0对测序数据进行解析，将“mixed bases settings.”设置为60％，若解析结果为“r”则判定为慢羽纯合子，如果是g判定为慢羽杂合子，见图1。说明可以通过对测序数据解析对慢羽个体的慢羽位点进行基因分型。
[0045]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

技术特征：
1.一种鉴别慢羽公鸡慢羽慢羽基因座基因型的方法，其特征在于，包括以下步骤：以待测鸡的基因组dna为模板，利用引物对进行pcr扩增，获得扩增引物；对所述扩增引物进行直接测序后，对snp位点的测序结果进行解析，根据解析结果确定基因型；其中，所述目的snp位点位于鸡z染色体上第11534451bp，该位点存在a/g突变，所述z染色体的基因号为genbank:cp100594.1。2.根据权利要求1所述的鉴别慢羽公鸡慢羽慢羽基因座基因型的方法，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列如下所示：lff：5
’‑
gaactaactaccacagagagga-3’lfr：5
’‑
tcagctacctataaactaga-3’。3.根据权利要求1所述的鉴别慢羽公鸡慢羽慢羽基因座基因型的方法，其特征在于，所述基因型的判断方法为：若解析结果为“r”则判定为慢羽纯合子，若是g判定为慢羽杂合子。

技术总结
本发明公开了一种鉴别慢羽公鸡慢羽基因座基因型的方法，属于生物育种领域。本发明以已知基因型的慢羽杂合子和慢羽纯合子为材料，通过直接测序后对SNP位点的测序结果进行解析，结果显示：若解析结果为“R”则判定为慢羽纯合子，若是G判定为慢羽杂合子。该方法通过直接测序后对SNP位点进行解析就能判断基因型，相比通过荧光定量PCR方法鉴定慢羽突变相关致因突变基因型方法，虽然两种都能区分慢羽纯合子和杂合子，但是本发明的方法更加简单便利，并且准确率为100％。且准确率为100％。且准确率为100％。


技术研发人员：许继国 贡继尚 柴学文 涂序堂 崔芳芳 马荆鄂 占雅婷 陈春燕
受保护的技术使用者：南昌师范学院
技术研发日：2023.05.26
技术公布日：2023/9/22