基于qNMR与色谱技术融合的RCF的测定方法

基于qnmr与色谱技术融合的rcf的测定方法
技术领域
1.本发明涉及有机化合物分析测试技术领域，具体涉及一种基于核磁共振定量技术(qnmr)与色谱技术融合的相对摩尔校正因子(或称相对校正因子，rcf)的测定方法。


背景技术：

2.常用的计算相对校正因子的方法有三种：斜率比值法、多点法、吸光系数比值法。这些方法建立时都需要用到标准品，但对于三类标准品不仅难以购买而且价格昂贵：(1)稀有化合物，例如低含量植物活性成分、药物杂质等；(2)不稳定化合物，如受到光、热等作用易发生构型转化的顺反异构体等；(3)个性化需求的特殊化合物，如特殊催化剂、荧光传感器等。
3.定量核磁(qnmr)的分析对象为化合物分子中所含有的原子(如1h、
13
c、
19
f、
31
p)，不需要和分析物完全相同的标准品，只需含有相同原子的化合物做内标即可实现绝对定量，无需制作标准曲线，已广泛用于药物分析、天然产物表征和参考物质质量控制等领域。根据国际计量委员会对基准分析方法的定义，qnmr已满足基准定量方法的要求(fardus-reid,f.,warren,j.,le gresley,a.,validating heteronuclear 2d quantitative nmr[j],analytical methods,2016,8(9):2016-2019)。
[0004]
在qnmr同一次测定中，所有激发原子的光谱常数相同且nmr信号强度与原子个数成正比，可采用稳定价廉的化合物或体系中其他化合物作为内标，由核磁信号计算内标与待测化合物的物质的量之比，运用色谱技术测定内标与待测化合物的色谱峰面积之比，进而将两者结果融合，即可计算出待测有机化合物的色谱rcf，从而达到由易得、稳定、价廉的化合物来测定不稳定、不易获得、昂贵的化合物rcf的目的。
[0005]
现有技术中，公告号为cn111579663b的中国专利文献公开了一种无标样情况下测定甲氧基甲醇中甲醇相对校正因子的方法和应用，该方法利用甲氧基甲醇中的甲醛与试剂反应，释放出甲氧基甲醇中的甲醇，甲醇含量的增加量与甲氧基甲醇含量的减少量的比值就是甲氧基甲醇中的甲醇相对游离甲醇的校正因子。公开号为cn110687239a的中国专利文献公开了一种针对纯度不高的试样测定其杂质衍生物色谱响应相对质量校正因子的方法，该方法需通过衍生化的方法对试样中杂质衍生化后进行气相色谱或液相色谱响应校正。
[0006]
采用上述方法测定校正因子不仅步骤较为繁琐，需要称量、稀释或者衍生化等操作，而且使用范围较为局限，对人员操作要求高。因此有必要开发一种操作简单、便捷、快速的相对校正因子测定方法。


技术实现要素：

[0007]
本发明提供了一种基于qnmr与色谱技术融合的rcf的测定方法，可在无标样情况下基于核磁共振定量技术和色谱技术融合测定相对摩尔校正因子。本发明的目的是，解决标准品难以购买的化合物rcf测定难的问题。本方法尤其适用于昂贵、不稳定、难以获得标准品的化合物rcf的测定。
[0008]
具体技术方案如下：
[0009]
参见图1，一种基于qnmr与色谱技术融合的rcf的测定方法，在qnmr同一次测定中，所有激发原子的光谱常数相同且nmr信号强度与原子个数成正比，采用稳定的化合物或体系中其他化合物作为内标，由核磁信号计算内标化合物和待测化合物的物质的量之比，运用色谱技术测定内标化合物和待测化合物的色谱峰面积之比，将两种结果融合，计算出待测化合物的色谱rcf，从而达到即使在没有待测物标准品的情况下，也可由易得、稳定、价廉的化合物来测定不稳定、不易获得、昂贵的化合物rcf的目的；
[0010]
所述色谱rcf按下式计算：
[0011][0012]
式中：
[0013]
f表示待测化合物相对于内标化合物的相对摩尔校正因子；
[0014]
ia表示核磁谱图中待测化合物指定峰的积分面积；
[0015]
ib表示核磁谱图中内标化合物指定峰的积分面积；
[0016]
na表示核磁谱图中待测化合物指定峰代表的原子数；
[0017]
nb表示核磁谱图中内标化合物指定峰代表的原子数；
[0018]aa
表示色谱图中待测化合物的峰面积；
[0019]ab
表示色谱图中内标化合物的峰面积。
[0020]
本发明测定方法的创新点在于：充分利用qnmr测定中所有激发原子的光谱常数相同的特点，首次将核磁共振定量技术与色谱技术融合用于化合物相对摩尔校正因子的测定，可实现无标样情况下化合物相对校正因子的测定，克服了传统方法必须使用与待测物完全相同的标准品的局限性。
[0021]
所述核磁谱图可为氢谱、氟谱、磷谱或碳谱。
[0022]
所述指定峰优选为非重叠信号、单峰信号，没有单峰时再选有裂分的信号峰用于计算。
[0023]
由于各原子在磁场中的空间环境不同，造成弛豫时间不同，弛豫时间不足时，积分比会产生误差。作为优选，qnmr测定中弛豫延迟时间(d1)需设定为所述指定峰代表原子的纵向弛豫时间(t1)的5倍及以上。
[0024]
qnmr测定中扫描次数以所述指定峰代表原子信号的信噪比大于250为佳。
[0025]
所述色谱技术可采用气相色谱技术或液相色谱技术。优化色谱条件至最佳条件，使各峰均能实现基线分离，测定两种化合物的色谱峰面积之比。
[0026]
由于本方法为首次提出，为了保证方法准确可靠，随机选择了两种常见化合物，采用常规的计算相对校正因子的方法(斜率比值法、多点法)以及本发明的方法，分别计算rcf值，并对结果进行比较，从而验证方法的准确性。
[0027]
在本发明的一个实施例中，所述待测化合物为对苯二甲酸二甲酯；所述内标化合物为香豆素；所述核磁谱图为氢谱；qnmr测定条件：脉冲角度90
°
，弛豫延迟时间40s，扫描次数16次；所述指定峰为对苯二甲酸二甲酯的h-6和h-6’，δ3.89，以及香豆素的h-3，δ6.50；所述色谱技术采用液相色谱仪，色谱条件：岛津inertsustain c18柱，250mm
×
4.6mm，粒径5μm，流动相为80vol％乙腈水溶液，流速1.0ml/min，柱温40℃，检测波长254nm，进样量10μl。
该实施例结果显示，用传统的斜率比值法、多点法以及本研究提出的融合技术测定的对苯二甲酸二甲酯相对于香豆素的rcf值一致，表明本发明方法可行、测定结果准确，验证了方法的准确性。
[0028][0029]
由于本发明的初衷是解决无标样情况下化合物rcf测定难的问题，故在另一实施例中，选择不稳定、无法购买标准品的维生素d3前体作为待测化合物。所述待测化合物为维生素d3前体(pre-vit d3)；所述内标化合物为维生素d3。所述核磁谱图为氢谱；qnmr测定条件：脉冲角度90
°
，弛豫延迟时间10s，扫描次数64次；所述指定峰为维生素d3的h-19，δ5.02，以及维生素d3前体pre-vit d3的h-9，δ5.45；所述色谱技术采用液相色谱仪，色谱条件：ymc carotenoid柱，250mm
×
4.6mm，粒径5μm，流动相为98vol％甲醇水溶液，流速1.0ml/min，柱温40℃，检测波长265nm，进样量10μl；
[0030]
[0031][0032]
本发明与现有技术相比，有益效果有：
[0033]
1)本发明巧妙地将核磁共振定量技术与色谱技术融合，从而达到由易得、稳定、价廉的化合物来测定不稳定、不易获得、昂贵的化合物rcf的目的。
[0034]
2)本发明提出的方法无需衍生化、多次稀释或称量等操作，过程简单，减少了误差来源。
[0035]
3)本发明解决了不稳定、不易获得、价格昂贵的化合物rcf测定难的问题。
[0036]
4)本发明可实现无标样情况下化合物的rcf测定。
[0037]
5)本发明方法概括出的基于qnmr与色谱技术融合的rcf的测定方法原理，不仅适用于实施例中提到的化合物，而且也同样适用于能够用色谱技术分离检测并能够使用核磁共振技术测得氢谱、氟谱、磷谱或碳谱的化合物rcf的测定。
附图说明
[0038]
图1为本发明的基于核磁共振定量技术与色谱技术融合的相对摩尔校正因子的测定方法的流程示意图，其中a类化合物代表待测化合物，b类化合物代表内标化合物，ca、cb分别代表化合物a和化合物b的物质的量浓度；f、fa、fb分别代表化合物a相对于化合物b的摩尔校正因子、化合物a的校正因子、化合物b的校正因子；aa、ab分别代表色谱图中化合物a和化合物b的峰面积；na、nb分别代表化合物a和化合物b的物质的量；ia、ib分别代表核磁谱图中化合物a和化合物b指定峰的积分面积；na、nb分别代表核磁谱图中化合物a和化合物b指定峰代表的原子数。
[0039]
图2为对苯二甲酸二甲酯和香豆素结构示意图。
[0040]
图3为对苯二甲酸二甲酯和香豆素的氢谱图。
[0041]
图4为对苯二甲酸二甲酯和香豆素的色谱图。
[0042]
图5为维生素d3原型及前体结构示意图。
[0043]
图6为维生素d3和维生素d3前体的氢谱局部放大图。
[0044]
图7为维生素d3溶液避光隔绝空气条件下，80℃加热前(before)、后(after)色谱图。
具体实施方式
[0045]
下面结合附图及具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
[0046]
下列实施例中未注明具体条件的操作方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0047]
实施例1
[0048]
运用传统的斜率比值法、多点法以及本发明提出的融合技术测定对苯二甲酸二甲酯相对于香豆素的rcf，通过对结果的比较，验证本发明提出的方法的可靠性。
[0049]
样品制备：准确称取对苯二甲酸二甲酯和香豆素各5mg溶于1ml dmso-d6中，随后用dmso-d6稀释成不同浓度标准溶液用于定量氢谱测定。同时将系列标准溶液用乙腈稀释100倍后用液相色谱测定各化合物色谱峰面积。
[0050]
步骤一、测定试样的核磁谱图，选择用于定量的原子信号峰，计算目标信号峰面积比。定量核磁共振氢谱测定条件：脉冲角度90
°
，弛豫延迟时间40s，扫描次数16次。数据使用jeol delta 6.0.0软件处理，线宽因子0.2hz，进行手动相位校正和基线校正，积分时，选定积分区域，每个峰积分3～5次，相对标准偏差(rsd)小于1％时取平均值。参见图2、图3，通过对谱图分析可知，对苯二甲酸二甲酯在δ8.09、3.89处存在单峰，但δ8.09信号峰与香豆素峰有重叠，故选择δ3.89处的信号作为对苯二甲酸二甲酯的指定峰参与计算。香豆素在δ8.08、7.73、7.63、7.41、7.36、6.50处有信号，但这些信号均有裂分，故选非重叠δ6.50处信号作为香豆素的指定峰参与计算。
[0051]
步骤二、采用设定的色谱条件分离、分析试样，由数据采集处理器采集数据并进行处理，计算化合物的色谱峰面积比(参见图4)。色谱条件：岛津inertsustain c18柱(250mm
×
4.6mm，粒径5μm)；流动相：80vol％乙腈水溶液；流速：1.0ml/min；柱温：40℃；检测波长254nm；进样量：10μl。
[0052]
步骤三、按下式计算对苯二甲酸二甲酯相对于香豆素的rcf：
[0053][0054]
式中：
[0055]
f表示对苯二甲酸二甲酯相对于香豆素的相对摩尔校正因子；
[0056]
ia表示核磁谱图中对苯二甲酸二甲酯指定峰的积分面积；
[0057]
ib表示核磁谱图中香豆素指定峰的积分面积；
[0058]
na表示核磁谱图中对苯二甲酸二甲酯指定峰代表的原子数；
[0059]
nb表示核磁谱图中香豆素指定峰代表的原子数；
[0060]aa
表示色谱图中对苯二甲酸二甲酯的峰面积；
[0061]ab
表示色谱图中香豆素的峰面积。
[0062]
测量数据及计算结果详见下表1。
[0063]
表1
[0064]
[0065]
运用传统的斜率比值法计算对苯二甲酸二甲酯相对于香豆素的rcf。分别以浓度为横坐标，以“步骤二”测得的色谱峰面积为纵坐标进行线性拟合，对苯二甲酸二甲酯和香豆素的线性方程分别为y＝3.162
×
109x-1842(r2＝1.00)，y＝6.042
×
109x-1899(r2＝1.00)，斜率比值即对苯二甲酸二甲酯相对于香豆素的rcf为0.52。
[0066]
运用传统的多点法计算对苯二甲酸二甲酯相对于香豆素的rcf。按下式计算对苯二甲酸二甲酯相对于香豆素的rcf：
[0067][0068]
式中：
[0069]
f表示对苯二甲酸二甲酯相对于香豆素的相对摩尔校正因子；
[0070]aa
表示色谱图中对苯二甲酸二甲酯的峰面积；
[0071]ab
表示色谱图中香豆素的峰面积；
[0072]
ca表示对苯二甲酸二甲酯的物质的量浓度；
[0073]
cb表示香豆素的物质的量浓度。
[0074]
测量数据及计算结果详见下表2。
[0075]
表2
[0076][0077]
运用传统的斜率比值法、多点法以及本研究提出的融合技术测定的对苯二甲酸二甲酯相对于香豆素的rcf均为0.52，表明将定量核磁与色谱技术融合用于rcf测定的方案是可行的，测定结果是准确的。
[0078]
实施例2
[0079]
活性维生素d类化合物具有共轭三烯结构，可热异构化为其前体结构，且在避光、无氧、加热80℃条件下，部分维生素d类化合物可定量转化为前体，无其他杂质产生(王珵，施洁明，张立雯，等，hplc法测定维生素d含量结果计算方法的研究[j]。中国药品标准，2020，21(02)：107-113)。由于无法购买到维生素d3前体标准品，因此无法使用传统的方法计算维生素d3前体(pre-vit d3)相对于维生素d3(vit d3)的rcf。故采用融合技术测定了维生素d3前体(pre-vit d3)相对于维生素d3(vit d3)的rcf。
[0080]
样品制备：精密称取vitd3 10mg，置于棕色小瓶中，加入1.0ml dmso-d6，充氮气排除空气，置于80℃电热恒温鼓风干燥箱中，避光加热1h后取出，迅速冷却，所得混合液用于核磁共振定量氢谱测定。同时用甲醇稀释上述混合液100倍后用液相色谱测定vit d3和pre-vit d3的色谱峰面积。平行制备3份样品。
[0081]
步骤一、测定试样的核磁谱图，选择用于定量的原子信号峰，计算目标信号峰面积比。经谱图分析，将氢原子δ6.17、5.95和5.02分别归属为vit d3的h-6、h-7、h-19原子信号峰，将氢原子δ5.89、5.63和5.45分别归属为pre-vit d3的h-6、h-7、h-9质子信号峰(见图5
和图6)。定量核磁分析优先选择耦合裂分较少且与相邻质子峰分离较好的峰作为定量峰，综合考虑选择vit d3的h-19(δ5.02)和pre-vit d3的h-9(δ5.45)作为定量峰。定量核磁共振氢谱测定条件：脉冲角度90
°
，弛豫延迟时间10s，扫描次数64次。数据使用jeol delta 6.0.0软件处理，线宽因子0.2hz，进行手动相位校正和基线校正，积分时，选定积分区域，每个峰积分3～5次，相对标准偏差(rsd)小于1％时取平均值。
[0082]
步骤二、采用设定的色谱条件分离、分析试样，由数据采集处理器采集数据并进行处理，计算化合物的色谱峰面积比(见图7)。色谱条件：ymc carotenoid柱(250mm
×
4.6mm，粒径5μm)；流动相：98vol％甲醇水溶液；流速：1.0ml/min；柱温：40℃；检测波长265nm；进样量：10μl。
[0083]
步骤三、按下式计算维生素d3前体(pre-vit d3)相对于维生素d3(vit d3)的rcf：
[0084][0085]
式中：
[0086]
f表示维生素d3前体相对于维生素d3的相对摩尔校正因子；
[0087]
ia表示核磁谱图中维生素d3前体指定峰的积分面积；
[0088]
ib表示核磁谱图中维生素d3指定峰的积分面积；
[0089]
na表示核磁谱图中维生素d3前体指定峰代表的原子数；
[0090]
nb表示核磁谱图中维生素d3指定峰代表的原子数；
[0091]aa
表示色谱图中维生素d3前体的峰面积；
[0092]ab
表示色谱图中维生素d3的峰面积。
[0093]
测量数据及计算结果详见下表3。
[0094]
表3
[0095][0096]
此外应理解，在阅读了本发明的上述描述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。

技术特征：
1.一种基于qnmr与色谱技术融合的rcf的测定方法，其特征在于，在qnmr同一次测定中，所有激发原子的光谱常数相同且nmr信号强度与原子个数成正比，采用稳定的化合物或体系中其他化合物作为内标，由核磁信号计算内标化合物和待测化合物的物质的量之比，运用色谱技术测定内标化合物和待测化合物的色谱峰面积之比，将两种结果融合，计算出待测化合物的色谱rcf；所述色谱rcf按下式计算：式中：f表示待测化合物相对于内标化合物的相对摩尔校正因子；i
a
表示核磁谱图中待测化合物指定峰的积分面积；i
b
表示核磁谱图中内标化合物指定峰的积分面积；n
a
表示核磁谱图中待测化合物指定峰代表的原子数；n
b
表示核磁谱图中内标化合物指定峰代表的原子数；a
a
表示色谱图中待测化合物的峰面积；a
b
表示色谱图中内标化合物的峰面积。2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述核磁谱图为氢谱、氟谱、磷谱或碳谱。3.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述指定峰为非重叠信号、单峰信号，没有单峰时再选有裂分的信号峰用于计算。4.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，qnmr测定中弛豫延迟时间设定为所述指定峰代表原子的纵向弛豫时间的5倍及以上。5.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，qnmr测定中扫描次数的设定要求为使所述指定峰代表原子信号的信噪比大于250。6.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述色谱技术为气相色谱技术或液相色谱技术。7.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述待测化合物为对苯二甲酸二甲酯；所述内标化合物为香豆素；所述核磁谱图为氢谱；qnmr测定条件：脉冲角度90
°
，弛豫延迟时间40s，扫描次数16次；所述指定峰为对苯二甲酸二甲酯的h-6和h-6’，δ3.89，以及香豆素的h-3，δ6.50；所述色谱技术采用液相色谱仪，色谱条件：岛津inertsustain c18柱，250mm
×
4.6mm，粒径5μm，流动相为80vol％乙腈水溶液，流速1.0ml/min，柱温40℃，检测波长254nm，进样量10μl；
8.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述待测化合物为维生素d3前体；所述内标化合物为维生素d3；所述核磁谱图为氢谱；qnmr测定条件：脉冲角度90
°
，弛豫延迟时间10s，扫描次数64次；所述指定峰为维生素d3的h-19，δ5.02，以及维生素d3前体的h-9，δ5.45；所述色谱技术采用液相色谱仪，色谱条件：ymc carotenoid柱，250mm
×
4.6mm，粒径5μm，流动相为98vol％甲醇水溶液，流速1.0ml/min，柱温40℃，检测波长265nm，进样量10μl；m，流动相为98vol％甲醇水溶液，流速1.0ml/min，柱温40℃，检测波长265nm，进样量10μl；

技术总结
本发明公开了一种基于qNMR与色谱技术融合的RCF的测定方法，在qNMR同一次测定中，所有激发原子的光谱常数相同且NMR信号强度与原子个数成正比，采用稳定的化合物或体系中其他化合物作为内标，由核磁信号计算内标化合物和待测化合物的物质的量之比，运用色谱技术测定内标化合物和待测化合物的色谱峰面积之比，将两种结果融合，计算出待测化合物的色谱RCF，从而达到即使在没有待测物标准品的情况下，也可由易得、稳定、价廉的化合物来测定不稳定、不易获得、昂贵的化合物RCF的目的。昂贵的化合物RCF的目的。昂贵的化合物RCF的目的。


技术研发人员：王娇娇 葛志伟 李士敏 陆诗燕
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：2023.05.26
技术公布日：2023/9/22