食叶草基生物膜促进剂及其制备方法与流程

1.本发明涉及生物膜促进剂技术领域，尤其涉及一种食叶草基生物膜促进剂，以及该食叶草基生物膜促进剂的制备。


背景技术：

2.生物膜是指细菌生物被膜(bacterial biofilm,bf)，是由附着于惰性或者活性实体表面的细菌细胞和包裹着细菌的由细菌自身所分泌的含水聚合性基质所组成的结构性细菌群落，包括细菌细胞、胞外聚合物和其他颗粒物的水合混合物。细菌生物膜的细胞之间可以通过群体感应进行化学物质交流，从而调节营养物质的获取和转运、细胞之间的杂交以及细胞的运动和代谢产物的生成。
3.随着微生物工业的日益发展，人们开始关注细菌生物膜的形成情况，一般生物膜形成数量越多，菌体代谢产物的表达和稳定性越好。目前通常采用营造物理或化学逆境环境(即通过驯化)的方式达到微生物生物膜大量表达的目的，但逆境环境形成因素往往在增殖初期对菌体自身产生不良影响。因此进行生物膜形成与表达的促进研究，对于微生物发酵工业的发展具有积极作用。目前大量研究表明二价铁离子和三价铁离子对于微生物的增殖、抑制都有作用，由此铁离子在微生物增殖与代谢产物表达方面确实存在影响，而如何影响不仅与铁离子化合价间存在直接关联，还跟铁离子体系、剂量等其它因素均相关，针对不同化合价铁离子组合能否协同调节、促进细菌生物膜形成的研究尚未见报道。


技术实现要素：

4.通过对现有生物膜促进的研究与分析，本发明创新性地将食叶草用于生物膜促进剂的制备，提供了一种食叶草基生物膜促进剂，有效利用食叶草中丰富铁元素，确保微生物维持良好生理状态的前提下，能够持续快速高表达生物膜，富集代谢产生的生物活性成分，优化发酵结果。
5.本发明的食叶草基生物膜促进剂，主要由食叶草粉与山梨醇酐单月桂酸酯(司盘20)溶液、碘化钾溶液混合后，经挤压膨化粉碎再加水搅拌后水浴处理得到。
6.食叶草，于2021年纳入新食品原料，其铁元素含量丰富，但是由于受植物铁化合价单一和游离困难等问题限制，相关食叶草铁产品的开发目前属于空白。本发明以食叶草为主要原料，通过向食叶草粉中加入司盘20并进行挤压膨化粉碎处理，促使铁离子溶出，同时利用挤压膨化提高微生物对糖类物质的利用率，在此基础上再加入碘化钾调节二价、三价铁离子维持在适宜的比例，由此获得的食叶草基生物膜促进剂，以微生物基础营养铁元素的调节作为突破点，促进细菌生物膜的生成，确保微生物维持良好生理状态，并在持续快速高表达生物膜的同时调节菌体代谢，提高有益物的产出，富集代谢产生的生物活性成分，实现绿色高效生物膜促进剂的开发与应用，提高食叶草精深加工产品的附加值。
7.作为对上述技术方案的限定，所述生物膜促进剂包括组分a和组分b，所述组分a为水浴处理后抽滤得到的沉淀，干燥后用于制作发酵底物；组分b为水浴处理后抽滤得到的滤
液，加入到接种后的发酵底物中，用于发酵。
8.食叶草处理后的沉淀和滤液具有不同用途，沉淀作为发酵底物，可以利用食叶草中丰富的蛋白质等营养素；滤液中主要包含高浓度且不同化合价的铁离子，利用不同价铁离子组合对发酵发挥调节作用。上清和沉淀同时使用，体现了食叶草资源充分利用的目的。
9.作为对上述技术方案的限定，所述山梨醇酐单月桂酸酯溶液的质量浓度为2
±
1％，加入量与食叶草粉的配比为100～200ml:2000g。
10.作为对上述技术方案的限定，所述碘化钾溶液的质量浓度为10
±
2％，加入量与食叶草粉的配比为250～350ml:2000g。
11.作为对上述技术方案的限定，加水搅拌转速为60
±
10rpm/min，时间为15
±
5min。
12.作为对上述技术方案的限定，水浴处理温度为60
±
5℃，时间为30
±
10min。
13.作为对上述技术方案的限定，挤压膨化粉碎处理的条件为，膨化压力4～7mpa、温度150～200℃；粉碎转速6000～12000rpm/min、细度《400μm。
14.进一步限定司盘20、碘化钾溶液的浓度与用量，加水搅拌、水浴处理及挤压膨化粉碎等处理条件，以获得更具应用价值的食叶草基生物膜促进剂。
15.同时，本发明还提供了如上所述食叶草基生物膜促进剂的制备方法，即向2000g食叶草粉中，喷洒2
±
1％山梨醇酐单月桂酸酯溶液100～200ml、加入10
±
2％碘化钾溶液250～350ml混合均匀，挤压膨化粉碎后加入蒸馏水45～55l，60
±
10rpm/min搅拌15
±
5min，60
±
5℃水浴30
±
10min，抽滤后分别收集沉淀与滤液，得到食叶草基生物膜促进剂的组分a和b。
16.作为对上述技术方案的限定，将组分a在70
±
10℃干燥3h，与豆粕按质量比1:1混合均匀、灭菌制成发酵底物，在发酵底物中接种菌液，然后将灭菌后的组分b加入已接种的发酵底物中，混合搅拌均匀，于35
±
2℃厌氧发酵。
17.作为对上述技术方案的限定，发酵底物中接种的菌液包括酿酒酵母菌液、戊糖片球菌菌液和枯草芽孢杆菌菌液，各菌液的菌浓度均为1
×
108～1
×
109cfu/ml，各菌液接种量均为1
±
0.1ml:10g。
18.确定食叶草基生物膜促进剂的具体制备条件，用于混合菌生物膜的表达体系。混合菌液选择饲料发酵工业常用的复合菌种，一般包括酿酒酵母、戊糖片球菌和枯草芽孢杆菌这三类菌，能够使饲料原料转化为集微生物菌体蛋白、生物活性小肽类氨基酸、微生物活性益生菌、复合酶制剂为一体的生物发酵饲料，通过本发明的生物膜促进剂提高发酵菌液的稳定性和活性，进而提高生物发酵饲料天然产物富集的优势。
19.本发明获得的食叶草基生物膜促进剂，利用从食叶草溶出的经过特定调配的二价、三价铁离子体系和其它营养，用于菌种发酵，可以调节微生物的基础营养铁元素环境和菌体代谢，促进发酵过程细菌生物膜的持续高量表达，确保微生物维持良好生理状态，富集代谢产生的生物活性成分，实现绿色高效生物膜促进剂的开发与应用。
附图说明
20.图1、为本发明不同样品的游离总铁离子含量测定结果对照图；
21.图2、为本发明不同样品的游离亚铁离子含量与比例测定结果对照图；
22.图3、为本发明不同样品的生物膜成膜率与胞外多糖含量测定结果对照图；
23.图4、为本发明不同样品的生物膜电镜照片；
24.图5、为本发明不同样品的发酵产物总黄酮含量测定结果对照图。
具体实施方式
25.下面将结合实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
26.下述实施例与对比例涉及的原料均为市场购买的典型产品，涉及的培养基、发酵菌液、实验材料具体如下。
27.(一)、培养基配制
28.1、lb液体培养基：称取胰蛋白胨10.0g，酵母浸粉5.0g，氯化钠10.0g，溶解于1000ml去离子水中，用1mol/l naoh和1mol/l hcl调节ph至7.0
±
0.1，121℃高压灭菌15min，备用。
29.2、ypd液体培养基：称取蛋白胨20.0g，葡萄糖20.0g，酵母浸粉10.0g，溶解于1000ml去离子水中，用1mol/l hcl调节ph至6.5
±
0.2，121℃高压灭菌15min，备用。
30.3、mrs液体培养基：蛋白胨10.0g，牛肉浸粉8.0g，酵母浸粉4.0g，葡萄糖20.0g，磷酸氢二钾2.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，乙酸钠5.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.04g，吐温80 1.0g，溶解于1000ml去离子水中，用1mol/l hcl调节ph至5.7
±
0.2，121℃高压灭菌15min，备用。
31.(二)、发酵菌液制备
32.1、枯草芽孢杆菌菌液：接种于lb固体培养基(lb固体培养基是在1l的lb液体培养基中加入20g琼脂灭菌制得)，37℃恒温培养24h，挑取单菌落接种于lb液体培养基中，37℃、200r/min培养24h，用无菌生理盐水将其浓度调节至1
×
108cfu/ml备用；
33.2、酿酒酵母菌液：接种于ypd固体培养基(ypd固体培养基是在1l的lb液体培养基中加入20g琼脂灭菌制得)，30℃恒温培养2d，挑取单菌落接种于液体ypd培养基中，30℃、150r/min培养24h，用无菌生理盐水将其浓度调节至1
×
108cfu/ml备用；
34.3、戊糖片球菌菌液：接种于mrs固体培养基(mrs固体培养基是在1l的lb液体培养基中加入20g琼脂灭菌制得)，37℃恒温培养2d，挑取单菌落接种于mrs液体培养基中，37℃、200r/min培养24h。用无菌生理盐水将其浓度调节至1
×
108cfu/ml备用。
35.实验材料
36.食叶草粉过80目筛；
37.用蒸馏水配制质量浓度2％的山梨醇酐单月桂酸酯溶液，并用0.5mmol/l氢氧化钠溶液调节ph至7.2；用蒸馏水配制质量浓度10％的碘化钾溶液。
38.实施例
39.本实施例涉及食叶草基生物膜促进剂的制备及应用。
40.向2000g食叶草粉中喷洒2％山梨醇酐单月桂酸酯(司盘20)溶液100ml、10％碘化钾溶液300ml混合均匀，设定膨化压力5mpa、温度180℃进行挤压膨化，然后设定转速9000rpm/min、细度《400μm进行粉碎，最后加入蒸馏水50l，60rpm/min搅拌15min，60℃水浴30min，抽滤后，分别收集滤液(即为本发明食叶草基生物膜促进剂组分b)与沉淀(即为食叶
草基生物膜促进剂组分a)备用。
41.沉淀70℃干燥3h，与豆粕质量比1：1混合混匀灭菌制成发酵底物，发酵底物分别接种酿酒酵母菌液、戊糖片球菌菌液和枯草芽孢杆菌菌液，接种量(ml：g)均为1：10。灭菌后的滤液和接种的发酵底物混合搅拌均匀，37℃，厌氧发酵48h。
42.上述食叶草基生物膜促进剂的制备条件中，司盘20溶液、碘化钾溶液的质量浓度、加入量，加水搅拌的加水量、搅拌转速、时间，水浴温度、时间，挤压膨化压力、温度，粉碎转速、细度等条件均可在适当范围调整。
43.食叶草基生物膜促进剂的应用条件中，组分a的干燥温度、时间，组分a与豆粕的质量配比，发酵接种量，厌氧发酵温度等条件也均可在适当范围调整。
44.对比例1
45.本对比例与实施例的不同之处在于食叶草粉中没有加入司盘20，具体操作如下：
46.向2000g食叶草粉中喷洒蒸馏水100ml和10％碘化钾溶液300ml混合均匀，挤压膨化粉碎(条件同实施例)后加入蒸馏水50l，60rpm/min搅拌15min，60℃水浴30min，抽滤后，分别收集滤液与沉淀备用。
47.沉淀70℃干燥3h，与豆粕质量比1：1混合混匀灭菌制成发酵底物，发酵底物分别接种酿酒酵母菌液、戊糖片球菌菌液和枯草芽孢杆菌菌液，接种量(ml：g)均为1：10。灭菌后的滤液和接种的发酵底物混合搅拌均匀，37℃，厌氧发酵48h。
48.对比例2
49.本对比例与实施例的不同之处在于食叶草粉仅加入司盘20，没有加入碘化钾也不进行挤压膨化粉碎处理，具体操作如下：
50.向2000g食叶草粉中喷洒2％司盘20溶液100ml，混合均匀，加入蒸馏水50l，60rpm/min搅拌15min，60℃水浴30min，抽滤后，分别收集滤液与沉淀备用。
51.沉淀70℃干燥3h，与豆粕质量比1：1混合混匀灭菌制成发酵底物，发酵底物分别接种酿酒酵母菌液、戊糖片球菌菌液和枯草芽孢杆菌菌液，接种量(ml：g)均为1：10。灭菌后的滤液和接种的发酵底物混合搅拌均匀，37℃，厌氧发酵48h。
52.对比例3
53.本对比例与实施例的不同之处在于食叶草粉中没有加入司盘20，而是加入表面活性剂sds溶液，具体操作如下：
54.向2000g食叶草粉中喷洒2％十二烷基硫酸钠(sds)溶液100ml、10％碘化钾溶液300ml混合均匀，挤压膨化粉碎(条件同实施例)后加入蒸馏水50l，60rpm/min搅拌15min，60℃水浴30min，抽滤后，分别收集滤液与沉淀备用。
55.沉淀70℃干燥3h，与豆粕质量比1：1混合混匀灭菌制成发酵底物，发酵底物分别接种酿酒酵母菌液、戊糖片球菌菌液和枯草芽孢杆菌菌液，接种量(ml：g)均为1：10。灭菌后的滤液和接种的发酵底物混合搅拌均匀，37℃，厌氧发酵48h。
56.对比例4
57.本对比例与实施例的不同之处在于食叶草粉中没有加入司盘20，而是加入吐温60，具体操作如下：
58.向2000g食叶草粉中喷洒2％聚氧乙烯失水山梨醇单硬脂酸酯(吐温60)溶液100ml、10％碘化钾溶液300ml混合均匀，挤压膨化粉碎(条件同实施例)后加入蒸馏水50l，
60rpm/min搅拌15min，60℃水浴30min，抽滤后，分别收集滤液与沉淀备用。沉淀70℃干燥3h，与豆粕质量比1：1混合混匀灭菌制成发酵底物，发酵底物分别接种酿酒酵母菌液、戊糖片球菌菌液和枯草芽孢杆菌菌液，接种量(ml：g)均为1：10。灭菌后的滤液和接种的发酵底物混合搅拌均匀，37℃，厌氧发酵48h。
59.对比例5
60.本对比例为空白对照，食叶草粉中不加入其它溶液，只进行水浴提取，具体操作如下：
61.向2000g食叶草粉中加入蒸馏水50.4l，60rpm/min搅拌15min，60℃水浴30min，抽滤后分别收集滤液与沉淀备用。
62.沉淀70℃干燥3h，与豆粕质量比1：1混合混匀灭菌，分别接种酿酒酵母菌液、戊糖片球菌菌液和枯草芽孢杆菌菌液，接种量(ml：g)均为1：10，37℃，厌氧发酵48h。
63.为了验证本发明生物膜促进剂的有益效果，对实施例及对比例1～5进行如下检测。
64.(一)、铁离子浓度与比例分析检测
65.采用比色法测试盒测定滤液中的总铁离子含量，总铁离子比色法测试盒选用elabscience e-bc-k772-m，实施例与对比例1～4的发酵液中游离总铁离子含量的测定结果见附图1。
66.食叶草的铁元素含量丰富，是重要的微生物必需矿物质元素，但是铁离子游离及化合价等理化性质，限制了微生物对铁离子的利用率，且对微生物代谢产物的表达有较大的影响。由图1可知，实施例的游离总铁离子含量可达到5.01mmol/l，该体系能够很好的促进铁元素以离子形式溶出；而对比例1～4，与实施例相比，总铁离子含量显著下降，说明本发明中司盘20的加入与挤压膨化处理，对于铁离子的有效溶出效果具有很好的作用，而使用其它表面活性剂会影响铁离子的溶出效果。
67.采用比色法测试盒测定滤液中的游离亚铁离子含量并计算其在总铁离子中的占比，亚铁离子比色法测试盒选用elabscience e-bc-k773-m，实施例与对比例1～4的发酵液中游离亚铁离子含量的测定结果见附图2a，游离亚铁离子比例的计算结果见附图2b。
68.由图2可知，实施例的操作能够控制从食叶草原料中溶出的游离亚铁离子(即二价铁离子含量2.52mmol/l)含量，其占比维持在总铁离子的二分之一，保证二价铁离子与三价铁离子维持等量环境。而对比例1～4，并不能将食叶草中的三价铁离子进行有效置换，尤其对比例2，铁离子几乎以三价形式存在，二价铁离子含量很少，仅为0.1mmol/l。
69.(二)、生物膜生成量与胞外多糖检测
70.在无菌条件下，准确称取发酵样品两份(ⅰ、ⅱ)各1.0g，ⅰ组加无菌水10ml混匀备用，ⅱ组加无菌水10ml、涡旋30s、超声处理10s、并再次涡旋30s以将生物膜细胞分散到悬浮液中。分别取ⅰ组、ⅱ组稀释液涂布于营养琼脂平板，37℃培养48h，计算菌落数。成膜率＝(ⅱ组总菌落数
‑ⅰ
组游离菌落数)/ⅱ组总菌落数*100％。
71.准确称取发酵样品1.0g，加入无菌水10ml混匀后，涡旋30s、超声处理30s，少量多次快速过滤，取滤液，采用细菌多糖提取试剂盒检测粗多糖含量，即为胞外多糖含量，细菌多糖提取试剂盒选用索莱宝solarbio ex1750。
72.生物膜生成量和胞外多糖含量的测定结果见附图3。
73.胞外多糖是微生物生长过程中分泌出的代谢产物，是生物膜的主要成分，胞外多糖分泌越多，预示着其产生物膜的能力越强。由图3可知，实施例生物膜生成量和胞外多糖含量显著高于对比例。说明本发明的食叶草基生物膜促进剂确实能够促进生物膜的形成，对微生物的代谢活动起到良好的调节作用，而对比例的调节能力弱，尤其对比例3，该条件甚至对生物膜的形成有一定的抑制作用，导致其生物膜生成量最低。
74.生物膜形成效果
75.分别将实施例、对比例3、对比例5的样品干燥，用棉签蘸取少量微胶囊粉末粘在带有导电胶的载物台上，接着在离子溅射仪中喷金。用扫描电子显微镜调整不同倍数观察样品。扫描电子显微镜型号为(sem)tm-1000，日本电子(jeol)公司。
76.结果如附图4所示，实施例生成的生物膜丰富密集，而对比例3、对比例5生物膜形成量明显减少，且并未对附着物料表面形成很好的包裹效果。
77.(三)、黄酮含量检测
78.分别吸取0、1、2、3、4、5和6ml的0.4mg/ml芦丁标准溶液于25ml比色管中，用无水乙醇补至6ml，加5％nano2溶液1ml后摇匀，静置6min；加10％al(no3)3溶液1ml，摇匀，静置6min；加入4％naoh溶液10ml，摇匀后加无水乙醇至刻度线，摇匀，静置15min，510nm波长处测定吸光度值，以芦丁质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制曲线，并计算标准曲线。
79.样品黄酮类含量测定：吸取样液1ml于25ml的比色管中，同上述操作，由标准曲线和回归方程计算样品总黄酮类化合物的含量，结果见附图5。
80.由图5可知，对比例2、对比例5未经过挤压膨化，黄酮未受到损失，经过发酵后黄酮含量高，而实施例的食叶草虽然经过膨化处理，但是由于铁离子促进微生物增殖，同时刺激了黄酮的表达，黄酮含量呈现最高。
81.大量研究虽然表明二价铁离子和三价铁离子均对微生物的增殖、抑制都有显著作用，但是针对不同化合价铁离子组合的协同效果并未见报道，可见铁离子在促进微生物增殖与调节代谢产物表达的过程中，对铁离子化合价有着严格的要求。本发明没有单纯对铁离子不同化合价态对微生物的影响以及不同化合价态复配产生协同开展研究，而是以富含铁元素的植物原料食叶草作为促进剂的主要原料，通过加入司盘20和碘化钾，并进行挤压膨化处理，调配获得能够提供利于微生物细胞增殖和代谢的二价、三价铁离子体系，来促使细胞生物膜的生成，得到更具应用价值且更适合工业利用的发酵菌液。
82.综上所述，本发明的食叶草基生物膜促进剂，在充分利用食叶草原料丰富铁元素营养的基础上，能够促进发酵过程细菌生物膜的持续高量表达，确保微生物维持良好的生理状态，调节细胞代谢，提高有益物质的产出，利于微生物的工业生产。将本发明的食叶草基生物膜促进剂用于发酵饲料工业常用复合菌种的发酵，能够富集黄酮、胞外多糖等生物活性成分，提高了发酵饲料的质量与品质。

技术特征：
1.一种食叶草基生物膜促进剂，其特征在于：所述生物膜促进剂主要由食叶草粉与山梨醇酐单月桂酸酯溶液、碘化钾溶液混合后，经挤压膨化粉碎再加水搅拌后水浴处理得到。2.根据权利要求1所述的食叶草基生物膜促进剂，其特征在于：所述生物膜促进剂包括组分a和组分b，所述组分a为水浴处理后抽滤得到的沉淀，干燥后用于制作发酵底物；组分b为水浴处理后抽滤得到的滤液，加入到接种后的发酵底物中，用于发酵。3.根据权利要求1所述的食叶草基生物膜促进剂，其特征在于：所述山梨醇酐单月桂酸酯溶液的质量浓度为2
±
1％，加入量与食叶草粉的配比为100～200ml:2000g。4.根据权利要求1所述的食叶草基生物膜促进剂，其特征在于：所述碘化钾溶液的质量浓度为10
±
2％，加入量与食叶草粉的配比为250～350ml:2000g。5.根据权利要求1所述的食叶草基生物膜促进剂，其特征在于：加水搅拌转速为60
±
10rpm/min，时间为15
±
5min。6.根据权利要求1所述的食叶草基生物膜促进剂，其特征在于：水浴处理温度为60
±
5℃，时间为30
±
10min。7.根据权利要求1所述的食叶草基生物膜促进剂，其特征在于：挤压膨化粉碎处理的条件为，膨化压力4～7mpa、温度150～200℃；粉碎转速6000～12000rpm/min、细度<400μm。8.一种如权利要求1～7中任一项所述食叶草基生物膜促进剂的制备方法，其特征在于：向2000g食叶草粉中，喷洒2
±
1％山梨醇酐单月桂酸酯溶液100～200ml、加入10
±
2％碘化钾溶液250～350ml混合均匀，挤压膨化粉碎后加入蒸馏水45～55l，60
±
10rpm/min搅拌15
±
5min，60
±
5℃水浴30
±
10min，抽滤后分别收集沉淀与滤液，得到食叶草基生物膜促进剂的组分a和b。9.根据权利要求8所述食叶草基生物膜促进剂的制备方法，其特征在于：将组分a在70
±
2℃干燥3h，与豆粕按质量比1:1混合均匀、灭菌制成发酵底物，在发酵底物中接种菌液，然后将灭菌后的组分b加入到已接种的发酵底物中，混合搅拌均匀，于35
±
2℃厌氧发酵。10.根据权利要求8所述食叶草基生物膜促进剂的制备方法，其特征在于：发酵底物中接种的菌液包括酿酒酵母菌液、戊糖片球菌菌液和枯草芽孢杆菌菌液，各菌液的菌浓度均为1
×
108～1
×
109cfu/ml，各菌液接种量均为1
±
0.1ml:10g。

技术总结
本发明公开了一种食叶草基生物膜促进剂，主要由食叶草粉与山梨醇酐单月桂酸酯溶液(司盘20)、碘化钾溶液混合后，经挤压膨化粉碎再加水搅拌后水浴处理得到。该生物膜促进剂利用从食叶草溶出的经过特定调配的二价、三价铁离子体系和其它营养，用于菌种发酵，可以调节微生物的基础营养铁元素和细胞代谢，促进发酵过程细菌生物膜的持续高量表达，确保微生物维持良好生理状态，富集代谢产生的生物活性成分，实现绿色高效生物膜促进剂的开发与应用。现绿色高效生物膜促进剂的开发与应用。现绿色高效生物膜促进剂的开发与应用。


技术研发人员：韩雪 史可 李研东 赵云英 张苗 叶超
受保护的技术使用者：河北地邦动物保健科技有限公司
技术研发日：2023.05.29
技术公布日：2023/9/22