伊文思蓝在制备抗新型冠状病毒药物中的应用

1.本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及伊文思蓝在制备抗新型冠状病毒药物中的应用。


背景技术：

2.sars-cov-2与sars-cov病毒均属于冠状病毒科(coronaviridae)，冠状病毒β属。sars-cov-2是一种正链单股rna冠状病毒。其rna序列长度约30kb。covid-19病毒粒子外膜由4种结构蛋白组成，包括n蛋白(nucleocapsid,核衣壳蛋白)、s蛋白(spikeprotein)、e蛋白(envelope protein)和m蛋白(membrane protein)。其中的s蛋白决定了病毒的宿主范围和特异性。要完全战胜新冠病毒，相应的抗新冠病毒药物的研发也是至关重要的。
3.因此，有必要开发一种治疗或者预防新型冠状病毒感染的药物。


技术实现要素：

4.本发明目的是提供伊文思蓝在制备抗新型冠状病毒药物中的应用，本技术发现伊文思蓝对新型冠状病毒有较强抑制作用，为新型冠状病毒感染性疾病的治疗和预防提供了方向。
5.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
6.本发明提供了伊文思蓝在制备抗新型冠状病毒药物中的应用。
7.进一步地，所述抗新型冠状病毒药物还包括药学上可接受的辅料和载体。
8.进一步地，所述辅料包括填充剂、崩解剂、粘合剂、赋形剂、稀释剂、润滑剂、甜味剂或着色剂中的至少一种。
9.进一步地，所述抗新型冠状病毒药物的剂型包括颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂或分散剂中的至少一种。
10.进一步地，所述抗新型冠状病毒药物的抗病毒的方式包括：抑制新型冠状病毒在细胞内核酸复制、病毒蛋白的表达和感染。
11.进一步地，所述抗新型冠状病毒药物的cc
50
为88.52μm，ic
50
为1.03μm。
12.本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
13.本发明提供的伊文思蓝在制备抗新型冠状病毒药物中的应用，伊文思蓝在实验中表现抗新型冠状病毒的活性，可抑制新型冠状病毒sars-cov-2增殖及感染宿主细胞，其cc50为88.52μm，能够剂量依赖的抑制新型冠状病毒sars-cov-2复制，其ic50(半数抑制浓度)为1.03μm。选择指数(si)约为86。说明伊文思蓝是低毒高效的抗新型冠状病毒药物。
附图说明
14.为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的
附图。
15.图1为一种伊文思蓝细胞毒性检测示意图。
16.图2为一种伊文思蓝处理新型冠状病毒sars-cov-2感染细胞中病毒复制效率图。
17.图3为一种伊文思蓝处理新型冠状病毒sars-cov-2感染细胞培养液上清中(细胞外)病毒复制效率图。
18.图4为一种伊文思蓝处理新型冠状病毒sars-cov-2感染细胞培养病毒复制效率图(空班减少实验)。
具体实施方式
19.下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
20.在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
21.除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。
22.本技术实施例的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：
23.伊文思蓝，英文名：evans blue，cas：314-13-6，其结构式如下式(i)所示，
[0024][0025]
伊文思蓝属于一种常用的偶氮染料制剂,在血液中与血浆白蛋白有很高的亲和力,因此在神经科学研究中常被用于示踪剂观察血脑屏障(bbb)的完整性，也用于测定血容量。但未见其抗新冠病毒的报道。
[0026]
本技术的发明人发现伊文思蓝对新型冠状病毒有较强抑制作用，具体地：
[0027]
本技术中伊文思蓝对caco-2细胞的cc50为88.52微摩尔/升。在小于12.5μm范围内对caco-2细胞完全没有细胞毒性，说明伊文思蓝有比较安全的适用范围，即伊文思蓝的给药剂量按照细胞实验用量为0.5～8.0μm处于安全无毒性范围内。
[0028]
本技术将伊文思蓝抗新型冠状病毒的评价：图2结果显示在caco-2细胞中，伊文思
蓝能剂量依赖地抑制sars-cov-2的复制水平,其对sars-cov-2复制的ic50(半数抑制浓度)为1.12微摩尔/升。图3结果显示在caco-2细胞培养液上清中，伊文思蓝能剂量依赖地抑制sars-cov-2的复制水平,其对sars-cov-2复制的ic50(半数抑制浓度)为1.27微摩尔/升。
[0029]
本技术在空斑减少中和实验中，图4结果显示在caco-2细胞中，伊文思蓝能剂量依赖地抑制sars-cov-2的复制水平，其对sars-cov-2复制的ic50(半数抑制浓度)为1.03微摩尔/升。
[0030]
综上可知，本发明结果表明化合物伊文思蓝对新型冠状病毒具有抑制作用，有潜力用于制备治疗或预防新型冠状病毒感染药物，具有较好的临床应用前景。
[0031]
利用伊文思蓝制备的治疗或预防新型冠状病毒感染的药物，所述药物的剂型包括但不限于目前药学上可接受任何剂型，包括片剂、注射剂、粉剂、酏剂、胶囊、混悬液、糖浆、药丸或薄片。
[0032]
本发明的伊文思蓝及其药学上可接受的盐或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔粘膜、眼、肺和呼吸道、皮肤、阴道、直肠等。
[0033]
给药剂型可以是液体剂型、固体剂型或半固体剂型。液体剂型可以是溶液剂(包括真溶液和胶体溶液)、乳剂(包括o/w型、w/o型和复乳)、混悬剂、注射剂(包括水针剂、粉针剂和输液)、滴眼剂、滴鼻剂、洗剂和搽剂等；固体剂型可以是片剂(包括普通片、肠溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡腾片、口腔崩解片)、胶囊剂(包括硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊)、颗粒剂、散剂、微丸、滴丸、栓剂、膜剂、贴片、气(粉)雾剂、喷雾剂等；半固体剂型可以是软膏剂、凝胶剂、糊剂等。
[0034]
本发明化合物及其药学上可接受的盐可以制成普通制剂、也制成是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。
[0035]
为了将本发明化合物及其药学上可接受的盐制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种赋形剂，包括稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂。稀释剂可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙等；湿润剂可以是水、乙醇、异丙醇等；粘合剂可以是淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纤维素、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解剂可以是干淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、碳酸氢钠与枸橼酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠等；润滑剂和助流剂可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸盐、酒石酸、液体石蜡、聚乙二醇等。
[0036]
还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。
[0037]
为了将给药单元制成胶囊剂，可以将有效成分本发明化合物及其药学上可接受的盐与稀释剂、助流剂混合，将混合物直接置于硬胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明化合物及其药学上可接受的盐先与稀释剂、黏合剂、崩解剂制成颗粒或微丸，再置于硬胶囊或软胶囊中。用于制备本发明化合物及其药学上可接受的盐片剂的各稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、助流剂品种也可用于制备本发明化合物及其药学上可接受的盐的胶囊剂。
[0038]
为将本发明化合物及其药学上可接受的盐制成注射剂，可以用水、乙醇、异丙醇、
丙二醇或它们的混合物作溶剂并加入适量本领域常用的增溶剂、助溶剂、ph调剂剂、渗透压调节剂。增溶剂或助溶剂可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羟丙基-β-环糊精等；ph调剂剂可以是磷酸盐、醋酸盐、盐酸、氢氧化钠等；渗透压调节剂可以是氯化钠、甘露醇、葡萄糖、磷酸盐、醋酸盐等。如制备冻干粉针剂，还可加入甘露醇、葡萄糖等作为支撑剂。
[0039]
此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂或其它添加剂。为达到用药目的，增强治疗效果，本发明的药物或药物组合物可用任何公知的给药方法给药。
[0040]
下面将结合实施例及实验数据对本技术的伊文思蓝在制备抗新型冠状病毒药物中的应用进行详细说明。
[0041]
实施例1：细胞毒性检测
[0042]
1.实验材料
[0043]
1.1细胞、病毒和药物
[0044]
caco-2细胞购自atcc(货号：htb-037)。
[0045]
sars-cov-2活病毒(编号ivcas 6.7512)，由中国科学院武汉病毒研究所国家病毒保藏中心提供。
[0046]
伊文思蓝(cas:1032008-74-4)购于sigma公司。
[0047]
1.2试剂
[0048]
dmem培养基和fbs购自gibco公司；cck8细胞活性检测试剂盒购自thermofisher公司；sybr混合液(itaq
tm universalgreen supermix)购自bio-rad公司。
[0049]
1.3实验仪器
[0050]
定量rcp仪(bio-rad cfx96 touch
tm real-time pcr detection system)购自bio-rad公司。多标记微孔板读取仪购自perkinelmer公司。1.0r型冷冻离心机和细胞培养箱购自thermofisher公司。
[0051]
2.实验方法与结果
[0052]
2.1细胞培养
[0053]
37℃，5％ co2加湿培养箱中培养。使用含有10％fbs、100u/ml的青霉素和链霉素的dmem培养基。细胞至90％汇合度后传代，传代比例1/3
–
1/4。
[0054]
2.2病毒培养
[0055]
200μl/管分装并置-70℃冻存备用。
[0056]
2.3伊文思蓝的细胞毒性检测
[0057]
caco-2细胞按8
×
103细胞/孔(100μl)接种于96孔细胞培养板中，细胞贴壁后备用；用细胞维持液(dmem+2％血清)将药物以100.0μm为最高浓度按照2倍梯度稀释共计6个梯度(100μm,50μm,25μm,12.5μm,6.25μm,3.125μm，1.562μm,)进行处理，每梯度3个复孔。培养48h后弃掉培养上清，于每孔中加入10μl含有cck8试剂，置细胞培养箱中继续培养1h，1h后用酶标仪测定在450μm处的吸光度，计算细胞存活率。
[0058]
结果显示(图1)伊文思蓝对caco-2细胞的cc
50
为88.52微摩尔/升。在小于12.5μm范围内对caco-2细胞完全没有细胞毒性，说明伊文思蓝有比较安全的适用范围，即伊文思蓝的给药剂量按照细胞实验用量为0.5～8.0μm。
[0059]
实施例2、基于荧光定量pcr检测伊文思蓝抑制sars-cov-2复制的效率
[0060]
以下实验均在bsl-3实验室中进行：
[0061]
1、将caco-2细胞按1.0
×
104细胞/孔接种于48孔细胞培养板中，37℃细胞培养箱中培养14～18h后，待细胞长成单层后备用。将孔板中培养基弃去，pbs清洗两遍后，加入0.5moi病毒液和各浓度梯度药物共500μl于37℃细胞培养箱中培养。药物以8.0μm为起始浓度，连续2倍梯度稀释5个梯度，每梯度设置3个复孔。培养48h后取各实验孔上清和细胞提取rna，逆转录为cdna,然后进行荧光定量pcr检测。实验设置空白对照组、阳性对照组(瑞德西韦)、阴性对照组(病毒感染后无药物处理)和实验药物组。
[0062]
2、48h后收样，分别用trizol ls收取细胞上清与细胞，病毒灭活后带出生物安全三级(bsl-3)实验室。用于rna提取。
[0063]
3、按天漠科技公司tr205-50试剂盒说明提取上清和细胞中的rna。
[0064]
4、得到的rna按庄盟zr102反转录试剂盒说明逆转录为cdna。
[0065]
5、通过基因组定量pcr方法(qpcr)检测基因组复制水平。定量rcr引物针对sars-cov-2的s2基因序列，定量rcr引物如下：
[0066]
5'-gctggtgctgcagcttatta-3'；
[0067]
5'-agggtcaagtgcacagtcta-3'。
[0068]
选择管家基因gadph作为校正的内参对照基因，针对gadph的定量rcr引物如下：
[0069]
5'-gctccctctttctttgcagcaat-3'；
[0070]
5'-taccatgagtccttccacgatac-3'。
[0071]
6、定量的ct值通过内参基因(gapdh)进行校对，各组数据以组作为标准组进行归一计算，计算公式：病毒复制抑制率＝1-药物组/阴性对照组
×
100％。结果通过graphpad prism8软件计算出平均值、标准差及ic50。
[0072]
7、利用步骤(2.4.6)中的计算结果绘制伊文思蓝抑制sars-cov-2的复制的结果图。结果如图2和图3所示。
[0073]
图2结果显示：在caco-2细胞中，伊文思蓝能剂量依赖地抑制sars-cov-2的复制水平,其对sars-cov-2复制的ic
50
(半数抑制浓度)为1.12微摩尔/升。
[0074]
图3结果显示：在caco-2细胞培养液上清中，伊文思蓝能剂量依赖地抑制sars-cov-2的复制水平,其对sars-cov-2复制的ic
50
(半数抑制浓度)为1.27微摩尔/升。
[0075]
实施例3、空斑减少中和实验
[0076]
1、细胞准备：准备24孔板，以2
×
105细胞/孔的细胞量接种vero e6细胞，细胞贴壁长到密度大约80％-90％备用。
[0077]
2、稀释血清：准备ep管，第1管加1ml dmem，2-6管每管加500μl dmem，在第1管内加10μl 1mm伊文思蓝，混匀后从第1管内吸500μl到第2管内并混匀，以此类推，一直稀释到第5管，伊文思蓝浓度依次为8.0μm、4.0μm、2.0μm、1.0μm、0.5μm，第5管混匀后弃去500μl液体。
[0078]
3、以下实验步骤均在bsl-3实验室中进行，在稀释好的血清中每管加入500μl3000pfu/ml的病毒液，吹打3-5次混匀，37℃孵育1h。
[0079]
4、吸弃24孔板内的培养基，取每管对应的病毒液200μl于细胞孔内，设置两个重复孔，37℃孵育1h。
[0080]
5、逐孔吸弃含病毒的培养基，24孔板加入0.5ml 1％甲基纤维素培养基，37℃孵育72h。空斑生长至肉眼可见时，停止培养，每孔加入1ml 4％甲醛-1％结晶紫固定染色液。盖
上盖子，在超净台或通风橱中静置24小时以上，杀灭病毒。
[0081]
6、吸弃24孔板中液体，打开盖子，干燥并紫外照射消毒后拍照，空斑计数。
[0082]
计算公式：病毒复制抑制率＝1-药物组空班数/阴性对照组空班数
×
100％。结果通过graphpad prism 8软件计算出平均值、标准差及ic50。
[0083]
利用步骤6中的计算结果绘制伊文思蓝抑制sars-cov-2的复制的结果图。结果如图4所示。
[0084]
图4结果显示：在caco-2细胞中，伊文思蓝能剂量依赖地抑制sars-cov-2的复制水平,其对sars-cov-2复制的ic
50
(半数抑制浓度)为1.03微摩尔/升。
[0085]
综上所述，伊文思蓝具有良好的抗新型冠状病毒的活性，有潜力进一步开发制备临床上有效对抗新型冠状病毒感染的药物。
[0086]
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
[0087]
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
[0088]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

技术特征：
1.伊文思蓝在制备抗新型冠状病毒药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗新型冠状病毒药物还包括药学上可接受的辅料和载体。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述辅料包括填充剂、崩解剂、粘合剂、赋形剂、稀释剂、润滑剂、甜味剂和着色剂中的至少一种。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗新型冠状病毒药物的剂型包括颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂或分散剂中的至少一种。5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗新型冠状病毒药物的抗病毒的方式包括：抑制新型冠状病毒在细胞内核酸复制、病毒蛋白的表达和感染。6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗新型冠状病毒药物的cc
50
为88.52μm，ic
50
为1.03μm。

技术总结
本发明提供了伊文思蓝在制备抗新型冠状病毒药物中的应用，本发明证实伊文思蓝可抑制新型冠状病毒SARS-CoV-2增殖及感染宿主细胞，其CC50为88.52μM，能够剂量依赖的抑制新型冠状病毒SARS-CoV-2复制，其IC50(半数抑制浓度)为1.03μM。选择指数(SI)约为86。说明伊文思蓝是低毒高效的抗新型冠状病毒药物。是低毒高效的抗新型冠状病毒药物。是低毒高效的抗新型冠状病毒药物。


技术研发人员：郭铭 王欣 向文洁 张艳 朱莹 邬开朗 刘芳
受保护的技术使用者：武汉大学
技术研发日：2023.06.06
技术公布日：2023/9/22