一种β-（2,6）果聚糖蔗糖酶突变体的构建及应用

一种
β-(2,6)果聚糖蔗糖酶突变体的构建及应用
技术领域
1.本发明涉及一种β-(2,6)果聚糖蔗糖酶突变体的构建及应用，属于酶的基因工程技术领域。


背景技术：

2.低聚乳果糖(lactosucrose)，可以由蔗糖和乳糖通过转糖基作用来酶法合成，是一种新型三糖，由果糖基、葡萄糖基、半乳糖基组成。因其不能被人体消化利用却可以促进肠道双歧杆菌增殖等作用而可以被作为一种益生元。目前，低聚乳果糖的生产主要通过酶法合成，即以蔗糖和乳糖为底物，在酶的作用下发生转糖基反应。合成低聚乳果糖的转糖基反应包括以下两种：一是通过酶的转果糖基作用，将蔗糖分解产生的果糖基转移至乳糖中葡萄糖部分的c1羟基上，适合的酶类包括多种微生物来源的β-(2,6)果聚糖蔗糖酶和β-呋喃果糖苷酶；二是通过酶的转半乳糖基作用，将乳糖分解产生的半乳糖基转移至蔗糖中葡萄糖部分的c4羟基上，适合的酶主要是β-半乳糖苷酶。尽管β-呋喃果糖苷酶在自然界里广泛存在，但是目前仅发现arthrobacter sp.k-1β-呋喃果糖苷酶有转化蔗糖与乳糖生成低聚乳果糖的能力。而利用β-半乳糖苷酶合成低聚乳果糖的反应会伴随多种副反应的发生。因此，β-(2,6)果聚糖蔗糖酶被认为是合成低聚乳果糖的有利工具酶。
3.β-(2,6)果聚糖蔗糖酶(levansucrase，ec 2.4.1.10)是糖基转移酶家族的一员，在微生物中广泛存在。β-(2,6)果聚糖蔗糖酶因其具有水解、转果糖基、聚合等作用，在果聚糖、低聚糖等功能性食品配料的生物合成方面有重要应用。诸多微生物来源的β-(2,6)果聚糖蔗糖酶被证明具有合成低聚乳果糖的能力，如bacillus natto、bacillus subtilis atcc 6501、paenibacillus polymyxa ifo 3020、sterigmatomyces elviae atcc18894及pseudomonas aurantiaca。其中来自leuconostoc mesenteroides b-512fmc的β-(2,6)果聚糖蔗糖酶显示出最高的低聚乳果糖合成能力，以27％(w/v)的蔗糖和27％(w/v)的乳糖为底物，反应1h后低聚乳果糖的平衡转化率可达41.5％。然而，此种来源ls的产物谱较窄，只能够生成低聚合度的果聚糖和乳果糖，目前有关该酶合成高分子量果聚糖方面的报道较少。相比于低聚乳果糖，高分子量的β-(2,6)果聚糖不能直接被人体所消化，但具有抗氧化、抗肿瘤和抗炎症的作用，已经被广泛应用在食品、医药和材料等领域。
4.目前，β-(2,6)果聚糖蔗糖酶是合成低聚乳果糖的重要工具酶，其合成低聚乳果糖的能力与其转糖基能力有关。低聚乳果糖的含量受不同来源的酶的限制，不能得到稳定的工业化生产工艺。同时，目前尚未发现既能提高低聚乳果糖的转化率，又有较广的产物谱的β-(2,6)果聚糖蔗糖酶。


技术实现要素：

5.为了解决上述存在的技术问题，本发明通过定点突变的办法，对来自微生物p.orientalis的β-(2,6)果聚糖蔗糖酶(psor-ls)进行分子改造，提供一种高效制备低聚乳果糖的突变体，这一发现对于工业化制备低聚乳果糖有重要的现实意义。
orientalis,在ncbi数据库的编号为wp_124433094.1，核苷酸序列如seq id no.1所示，氨基酸序列如seq id no.2所示。
27.酶活测定体系为1ml，含30％(w/v)的蔗糖和10μg的纯酶。酶活测定反应均在ls的最适温度(65℃)及ph(6.5)下进行，反应时间为15min。将反应液放于沸水浴中10min以终止反应。分别采用反应体系中葡萄糖和果糖的生成量来计算总酶活和水解酶活。其中总酶活定义为1min内生成1μmol葡萄糖所需要的酶量，水解酶活定义为单位时间内生成1μmol果糖所需要的酶量。转果苷酶活为总酶活减去水解酶活。(以下实施方式中的酶活指的是总酶活)
28.蛋白质检测方法：通过考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。
29.比酶活计算方法(u/mg)＝酶活力(u)/酶蛋白质量(mg)
30.分子量的检测方法：多糖的分子量通过高效凝胶过滤色谱法(high-performance gel filtration chromatography，hpgfc)测定。使用示差检测器和凝胶柱(7.8
×
300mm)。流动相为0.1n硝酸钠溶液，流速和检测温度分别为0.5ml/min和40℃。分子量的标准参考物为右旋糖酐t-2000(分子量为2
×
106da)、右旋糖酰胺t-300(3.0
×
105da)、葡聚糖t-150(1.4
×
105da)、右旋糖t-10(9.7
×
103da)和右旋糖铵t-5(2.7
×
103da)。
31.实施例1：β-(2,6)果聚糖蔗糖酶的三维结构分析及突变体质粒的构建
32.1、质粒的构建。
33.(1)构建原始质粒pet-22b(+)-psor-ls
34.合成核苷酸序列如seq id no.1所示的β-(2,6)果聚糖蔗糖酶基因(psor-ls)，并插入到载体pet-22b(+)的nde i和xho i两个限制性酶切位点，测序验证，得到原始质粒pet-22b(+)-psor-ls。
35.(2)构建突变质粒pet-22b(+)-r91t
36.设计定点突变的突变引物(表2)，以携带psor-ls基因的原始质粒pet-22b(+)-psor-ls为模板进行单点突变，将β-(2,6)果聚糖蔗糖酶(psor-ls)的第91位的精氨酸替换为苏氨酸，构建得到突变质粒pet-22b(+)-r91t。突变经pcr及模板消化反应两个步骤，模板消化的产物测序验证。突变体酶的核苷酸序列如seq id no.3所示，氨基酸序列如seq id no.4所示。
37.表1pcr反应体系
[0038][0039]
pcr反应条件：95℃预变性3min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸3min 40s，32个循环，4℃保存。
[0040]
表2引物序列表
[0041][0042]
表3模板消化反应体系
[0043][0044]
反应条件：37℃，反应90min。
[0045]
实施例2：工程菌株的构建及突变体酶的表达、纯化
[0046]
(1)工程菌株的构建。
[0047]
将实施例1中得到的突变质粒pet-22b(+)-r91t和原始质粒pet-22b(+)-psor-ls分别转化至大肠杆菌(e.coli)bl21(de3)感受态细胞中，涂布于含有100μg/ml氨苄青霉素的lb固体培养基中，于37℃培养12h后，分别得到长有重组工程菌e.coli bl21/pet-22b(+)-r91t和e.coli bl21/pet-22b(+)-psor-ls的平板。
[0048]
(2)突变体酶的表达。
[0049]
分别挑取步骤(1)中平板上的单菌落到4ml含有50μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基，于37℃培养12h得到种子液，将种子液转接入200ml含有50μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基，于37℃培养2～3h，至od
600
值为0.6～0.8，加入终浓度为1mmol/l的iptg诱导蛋白的表达，于28℃培养6～8h，获得发酵液。分别将发酵液于4℃、8000rpm离心10min，收集菌体。突变体酶的表达水平与原始酶相当，其发酵酶活可达400u/ml。
[0050]
(3)突变体酶的纯化。
[0051]
向步骤(2)中获得的菌体中分别加入20ml破碎缓冲液(50mmol/l磷酸盐缓冲液，200mmol/l nacl，ph 7.0)，充分重悬菌体，然后进行超声破碎，破碎后于4℃、8000rpm离心15min，收集上清液，即粗酶液。
[0052]
使用镍离子亲和层析柱对粗酶液进行纯化。首先，使用平衡缓冲液(50mmol/l磷酸盐缓冲液，500mmol/l nacl，ph 7.0)平衡柱子；然后，分别将得到的粗酶液加入到柱子中；接着，用含有低浓度咪唑的缓冲液(50mmol/l磷酸盐缓冲液，500mmol/l nacl，50mmol/l咪唑，ph 7.0)冲洗杂蛋白；最后，用含有高浓度咪唑的缓冲液(50mmol/l磷酸盐缓冲液，500mmol/l nacl，500mmol/l咪唑，ph 7.0)洗脱，得到突变体酶r91t和亲本酶psor-ls。
[0053]
(4)在最适温度和ph的条件下测定β-(2,6)果聚糖蔗糖酶的酶活。
[0054]
在ph 6.5，65℃的反应条件下，以终浓度为300g/l的蔗糖为底物，添加10μg步骤(3)获得的突变体酶r91t，反应15min。煮沸加热10min灭活。原始酶比酶活为1219u/mg。最终测得突变体酶的比酶活为790u/mg，保留了大部分活性。
[0055]
实施例3：突变体酶r91t生产低聚乳果糖的反应进程
[0056]
低聚乳果糖的转化率通过质量守恒法得到。其中低聚乳果糖的质量＝底物质量-剩余底物质量-生成的葡萄糖和果糖质量，转化率即为低聚乳果糖的质量除以蔗糖和乳糖的总质量。各组分的质量通过高效液相得到。r91t生产低聚乳果糖的转化率可达40％，明显
高于原始酶。生产条件为ph 6.5的磷酸盐缓冲液，65℃，终浓度为200g/l的蔗糖和200g/l的乳糖，10u/ml的加酶量，反应时间为1h，反应体系为50ml。最终突变体r91t将蔗糖和乳糖转化为低聚乳果糖的转化率为40％，显著高于原始酶30％的平衡转化比。同时，突变体r91t在1h内能够达到平衡，时空转化率为16g/(l
·
h)，而原始酶则为6g/(l
·
h)。
[0057]
实施例4：突变体酶r91t生产高分子量果聚糖的反应进程
[0058]
高分子量果聚糖的转化率通过质量守恒法得到。其中高分子量果聚糖的质量＝底物质量-剩余底物质量-生成的葡萄糖和果糖质量，转化率即为高分子量果聚糖的质量除以蔗糖的总质量。各组分的量通过高效液相得到。产物谱比较：以300g/l的蔗糖为底物，向1ml的反应体系里(ph 6.5)分别加入10u/ml的实施例2获得的突变体酶r91t和亲本酶，于65℃反应6h。反应结束后煮沸加热10min。突变体酶r91t积累147g/l高分子量β-(2,6)果聚糖，平均分子量可达1.2
×
106da，转化率为49％；而亲本酶的反应体系中积累87g/l高分子量β-(2,6)果聚糖，平均分子量可达1.3
×
106da，转化率为29％。
[0059]
对比例1：
[0060]
具体实施方式如实施例3，区别在于，固定乳糖的终浓度为200g/l，改变底物蔗糖/乳糖浓度比例，其比例分别为0.5：1和2：1。并检测生产低聚乳果糖的转化率，结果显示：低聚乳果糖的转化率分别为26％和17％。
[0061]
对比例2：
[0062]
具体实施方式如实施例3，区别在于，改变加酶量，分别在5和15u/ml的加酶量下检测生产低聚乳果糖的转化率，结果显示，低聚乳果糖的转化率分别为37％和35％。
[0063]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

技术特征：
1.一种β-(2,6)果聚糖蔗糖酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如seq id no.4所示。2.编码权利要求1所述突变体的基因。3.携带权利要求2所述基因的表达载体，其特征在于，包括但不限于pet系列载体。4.表达权利要求1所述突变体的基因工程菌。5.根据权利要求4所述基因工程菌，其特征在于，包括但不限于大肠杆菌。6.一种制备低聚乳果糖的方法，其特征在于，以权利要求1所述突变体为催化剂，以蔗糖和乳糖为底物进行反应。7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述催化剂的浓度为5-15u/ml，所述底物为蔗糖和乳糖，乳糖与蔗糖的终浓度比值为(0.5～2)：1。8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，在ph 4-7，50-70℃反应0.5-3h。9.一种制备高分子量果聚糖的方法，其特征在于，以权利要求1所述突变体为催化剂，以蔗糖为底物进行反应。10.权利要求1所述的突变体，或权利要求2所述基因，或权利要求3所述表达载体，或权利要求4或5所述的基因工程菌，或权利要求6～9任一所述方法在医药生产和食品加工领域中生产低聚乳果糖或高分子量果聚糖的应用。

技术总结
本发明公开了一种β-(2,6)果聚糖蔗糖酶突变体的构建及应用，属于酶的基因工程技术领域。本发明将微生物Pseudomonas orientalis来源的β-(2,6)果聚糖蔗糖酶作为亲本，构建了单点突变体酶R91T。突变体R91T催化蔗糖的聚合能力明显提高，在1h内将20％的蔗糖和20％的乳糖转化为低聚乳果糖的转化率可达40％，同时该突变体将30％蔗糖转化为高分子量果聚糖的转化率达49％。这一发现对于工业化制备低聚乳果糖，以及β-(2,6)果聚糖蔗糖酶的工业化应用有重要的研究价值。重要的研究价值。重要的研究价值。


技术研发人员：徐炜 张文立 张晓琦 倪大伟 沐万孟
受保护的技术使用者：江南大学
技术研发日：2023.06.08
技术公布日：2023/9/22