重组人源透皮纤连蛋白及其表达菌株的制作方法

1.本发明属于基因工程领域，涉及一种重组人源透皮纤连蛋白及其表达菌株。


背景技术：

2.纤连蛋白是一种存在于细胞外基质和基底膜中的主要非胶原性粘合蛋白，主要由成纤维细胞、内皮细胞、软骨细胞、神经胶质细胞和肌细胞等生成。可溶性的血浆纤连蛋白由两个相似的亚基通过肽链c端形成的二硫键交联结合而成，每个亚基的分子量约250kda，由多个具有特定功能的球形结构域构成，分别是与细胞表面受体整联素，胶原、肝素、纤维蛋白、基质金属蛋白酶，生长因子和硫酸蛋白多糖高亲和性识别结合的部位。其中研究较广的结合域是arg-gly-asp(rgd)序列，能与细胞整联素识别后调控细胞粘附。纤连蛋白的主要功能是介导细胞与细胞外基质的粘着，在许多重要的生理过程中起着关键性作用，如胚胎生成，创伤愈合，止血和血栓形成等。
3.胶原蛋白是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白，是构成组织细胞外基质的主要纤维蛋白，由成纤维细胞、软骨细胞、成骨细胞及某些上皮细胞合成并分泌到细胞外。除了具备抗压强度外，胶原也有刺激上皮细胞增殖及诱导细胞分化的作用。而纤连蛋白可分别通过与细胞外整联素和胶原纤维的结合促进相应的细胞信号传导。因此，纤连蛋白序列中与细胞外受体整联素和细胞外基质中胶原纤维的结合功能域是介导细胞粘附及增殖分化的重要结构单元。
4.传统获取纤连蛋白的方式主要是对动物血浆进行分离纯化，时耗长、步骤复杂且最终得率极低，因而成本较高。同时，动物原料的安全性问题也限制了传统提取方法的应用。随着合成生物学的不断发展，理性设计具有特定生物功能的重组纤连蛋白片段，实现其在真核宿主中的高效表达，对促进纤连蛋白在工业化生产中的应用具有重要意义。


技术实现要素：

5.本发明提供一种重组人源透皮纤连蛋白及其表达菌株。
6.本发明的技术方案如下：
7.本发明所述的重组人源透皮纤连蛋白为将氨基酸序列如seq id no.1所示的透皮肽space用氨基酸序列如seq id no.2所示的连接肽linker分别融合到氨基酸序列如seq id no.4所示的重组人源纤连蛋白f1或氨基酸序列如seq id no.5所示的重组人源纤连蛋白f2的氨基端、羧基端或两端所形成的融合蛋白。
8.具体地，本发明所述的重组人源透皮纤连蛋白包括6种融合蛋白，分别为将氨基酸序列如seq id no.1所示的透皮肽space用氨基酸序列如seq id no.2所示的连接肽linker融合到氨基酸序列如seq id no.4所示的重组人源纤连蛋白f1的氨基端所形成的重组人源透皮纤连蛋白f1.1，其氨基酸序列如seq id no.6所示；将氨基酸序列如seq id no.1所示的透皮肽space用氨基酸序列如seq id no.2所示的连接肽linker融合到氨基酸序列如seq id no.4所示的重组人源纤连蛋白f1的羧基端所形成的重组人源透皮纤连蛋白f1.2，其氨
基酸序列如seq id no.7所示；将氨基酸序列如seq id no.1所示的透皮肽space用氨基酸序列如seq id no.2所示的连接肽linker融合到氨基酸序列如seq id no.4所示的重组人源纤连蛋白f1的氨基端和羧基端所形成的重组人源透皮纤连蛋白f1.3，其氨基酸序列如seq id no.8所示；将氨基酸序列如seq id no.1所示的透皮肽space用氨基酸序列如seq id no.2所示的连接肽linker融合到氨基酸序列如seq id no.5所示的重组人源纤连蛋白f2的氨基端所形成的重组人源透皮纤连蛋白f2.1，其氨基酸序列如seq id no.9所示；将氨基酸序列如seq id no.1所示的透皮肽space用氨基酸序列如seq id no.2所示的连接肽linker融合到氨基酸序列如seq id no.5所示的重组人源纤连蛋白f2的羧基端所形成的重组人源透皮纤连蛋白f2.2，其氨基酸序列如seq id no.10所示；将氨基酸序列如seq id no.1所示的透皮肽space用氨基酸序列如seq id no.2所示的连接肽linker融合到氨基酸序列如seq id no.5所示的重组人源纤连蛋白f2的氨基端和羧基端所形成的重组人源透皮纤连蛋白f2.3，其氨基酸序列如seq id no.11所示。
9.本发明根据毕赤酵母的密码子偏好性，对重组人源透皮纤连蛋白进行密码子优化，得到的重组人源透皮纤连蛋白f1.1的核苷酸序列如seq id no.12所示，重组人源透皮纤连蛋白f1.2的核苷酸序列如seq id no.13所示，重组人源透皮纤连蛋白f1.3的核苷酸序列如seq id no.14所示，重组人源透皮纤连蛋白f2.1的核苷酸序列如seq id no.15所示，重组人源透皮纤连蛋白f2.2的核苷酸序列如seq id no.16所示，重组人源透皮纤连蛋白f2.3的核苷酸序列如seq id no.17所示。
10.进一步地，本发明构建表达重组人源透皮纤连蛋白的菌株，为利用高保真dna聚合酶pcr扩增重组人源透皮纤连蛋白f1.1、f1.2、f1.3、f2.1、f2.2或f2.3的核苷酸序列，snabi和noti酶切后连接到经相同双酶切的ppic9k空载体中，菌落pcr和测序验证正确后富集重组质粒并酶切线性化，电转化到毕赤酵母中，通过g418抗性梯度筛选获得的表达重组人源透皮纤连蛋白f1.1、f1.2、f1.3、f2.1、f2.2或f2.3的毕赤酵母基因工程菌sf1.1、sf1.2、sf1.3、sf2.1、sf2.2或sf2.3。
11.更进一步地，本发明提供上述重组人源透皮纤连蛋白的表达方法，具体为：将表达重组人源纤连蛋白f1.1、f1.2、f1.3、f2.1、f2.2或f2.3的毕赤酵母基因工程菌sf1.1、sf1.2、sf1.3、sf2.1、sf2.2或sf2.3接种在bmmy培养基中，30℃下经甲醇诱导表达72～120小时，收集上清，纯化得到重组人源透皮纤连蛋白f1.1、f1.2、f1.3、f2.1、f2.2或f2.3。
12.本发明选择人源纤连蛋白中与细胞整合素结合的功能域构成重组人源纤连蛋白f1，以及人源纤连蛋白中与胶原蛋白结合的功能域和与细胞整合素结合的功能域构成重组人源纤连蛋白f2，并将透皮肽space用连接肽linker融合到重组人源纤连蛋白f1和f2的氨基端或/和羧基端，构建了重组人源透皮纤连蛋白。本发明通过在重组人源透皮纤连蛋白上融合胶原蛋白结合功能域有助于创伤处胶原蛋白的黏附和聚集，加快了伤口愈合过程中的止血阶段；同时，融合细胞整合素结合功能域不仅能诱导炎症细胞和成纤维细胞等往创面的迁移加速急性炎症阶段，还能激活细胞信号传导反应促进新生组织的增殖和分化；另外，透皮肽的添加更加促进了该重组人源纤连蛋白的皮肤透过性。因而，本发明的重组人源透皮纤连蛋白可极大缓解由于外部感染、自身免疫力低下或凝血功能障碍造成的伤口长期不愈的现象；同时，由于它能激活组织的增殖，一定程度上该重组人源纤连蛋白可用于组织的修复，提升皮肤的抵抗力，在美容护肤、医疗器械等领域具有广泛的应用前景。
附图说明
13.图1为重组人源透皮纤连蛋白的质粒ppic9k-f1.1示意图。
14.图2为重组人源透皮纤连蛋白的质粒ppic9k-f1.2示意图。
15.图3为重组人源透皮纤连蛋白的质粒ppic9k-f1.3示意图。
16.图4为重组人源透皮纤连蛋白的质粒ppic9k-f2.1示意图。
17.图5为重组人源透皮纤连蛋白的质粒ppic9k-f2.2示意图。
18.图6为重组人源透皮纤连蛋白的质粒ppic9k-f2.3示意图。
19.图7为酶切后的重组人源透皮纤连蛋白的质粒f1.1、f1.2、f1.3、f2.1、f2.2、f2.3电泳图，m:1kb dnamarker；line 1:ppic9k酶切后质粒(9276bp)；line 2：ppic9k-f1.1酶切后质粒(9861bp)；line 3：ppic9k-f1.2酶切后质粒(9861bp)；line 4：ppic9k-f1.3酶切后质粒(9909bp)；line 5：ppic9k-f2.1酶切后质粒(10146bp)；line 6：ppic9k-f2.2酶切后质粒(10146bp)；line 7：ppic9k-f2.3酶切后质粒(10194bp)。
20.图8为高拷贝毕赤酵母基因工程菌sf1.1、sf1.2、sf1.3培养基上清(甲醇诱导72小时)的sds-page，泳道1：10-180kda蛋白marker，泳道5：sf1.1，泳道7：sf1.2，泳道9：sf1.3。
21.图9为高拷贝毕赤酵母基因工程菌sf2.1、sf2.2、sf2.3培养基上清(甲醇诱导72小时)的sds-page。
22.图10为重组人源透皮纤连蛋白对成纤维细胞增殖的影响结果图。
23.图11为重组人源透皮纤连蛋白对成纤维细胞迁移的影响结果图。
24.图12为重组透皮纤连蛋白透皮性能—表皮层荧光强度统计结果图。
25.图13为重组透皮纤连蛋白透皮性能—真皮层荧光强度统计结果图。
具体实施方式
26.下面通过具体实施例和附图进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
27.实施例1
28.重组人源透皮纤连蛋白的高拷贝毕赤酵母基因工程菌的构建：
29.(1)从人纤连蛋白中选择i区胶原蛋白结合域(氨基酸序列如seq id no.3所示)和iii区细胞整合素结合域(氨基酸序列如seq id no.4所示)，得到仅含有iii区细胞整合素结合域的重组人源纤连蛋白f1(氨基酸序列如seq id no.4所示)，含有i区胶原蛋白结合域和iii区细胞整合素结合域的重组人源纤连蛋白f2(氨基酸序列如seq idno.5所示)。
30.(2)将透皮肽space(氨基酸序列如seq id no.1所示)与连接肽linker(氨基酸序列如seq id no.2所示)融合到步骤(1)中所得的重组人源纤连蛋白片段的氨基端、羧基端或两端，得到6种重组人源透皮纤连蛋白片段，分别为重组人源透皮纤连蛋白f1.1(space透皮肽位于氨基端，氨基酸序列如seq id no.6所示)，重组人源透皮纤连蛋白f1.2(space透皮肽位于羧基端，氨基酸序列如seq id no.7所示)，重组人源透皮纤连蛋白f1.3(space透皮肽位于氨基端和羧基端，氨基酸序列如seq id no.8所示)，重组人源透皮纤连蛋白f2.1(space透皮肽位于氨基端，氨基酸序列如seq id no.9所示)，重组人源透皮纤连蛋白f2.2(space透皮肽位于羧基端，氨基酸序列如seq id no.10所示)，重组人源透皮纤连蛋白f2.3
(space透皮肽位于氨基端和羧基端，氨基酸序列如seq id no.11所示)。
31.(3)对步骤(2)中所得的6种重组人源透皮纤连蛋白片段的氨基酸进行密码子优化，得到符合毕赤酵母密码子偏好性的6种重组人源透皮纤连蛋白片段序列，重组人源透皮纤连蛋白f1.1、f1.2、f1.3、f2.1、f2.2、f2.3对应的核苷酸序列依次为seq id no.12、seq id no.13、seq id no.14、seq id no.15、seq id no.16、seq id no.17所示。
32.(4)将步骤(3)中的核苷酸序列委托上海擎科生物技术有限公司基因合成后，通过snabi和noti双酶切连接到ppic9k质粒上，经pcr和dna测序验证正确后提取质粒，用sali酶切线性化后电转化到毕赤酵母感受态中，挑取转化子分别影印到含有1、2、3、4、5、6g/l g418的酵母基础固体培养基上，收集能在高浓度g418抗性平板上富集的菌株，并通过在不含g418的酵母基础固体培养基上划取分离单克隆和菌落pcr验证确定阳性高拷贝转化子。图1～6分别为重组人源透皮纤连蛋白的质粒ppic9k-f1.1，ppic9k-f1.2，ppic9k-f1.3，ppic9k-f2.1，ppic9k-f2.2，ppic9k-f2.3的示意图。图7为酶切后的重组人源透皮纤连蛋白的质粒f1.1、f1.2、f1.3、f2.1、f2.2、f2.3电泳图，m:1kb dnamarker；line 1:ppic9k酶切后质粒(9276bp)；line 2：ppic9k-f1.1酶切后质粒(9861bp)；line 3：ppic9k-f1.2酶切后质粒(9861bp)；line 4：ppic9k-f1.3酶切后质粒(9909bp)；line 5：ppic9k-f2.1酶切后质粒(10146bp)；line 6：ppic9k-f2.2酶切后质粒(10146bp)；line 7：ppic9k-f2.3酶切后质粒(10194bp)。
33.实施例2
34.高拷贝毕赤酵母基因工程菌株的发酵和重组人源透皮纤连蛋白的表达：
35.将获得的高拷贝毕赤酵母基因工程菌株接种于30ml bmgy培养基(该培养基由20g/l蛋白胨，10g/l酵母提取物，10
×
ynb 100ml，10
×
磷酸钾缓冲液ph 6.0100ml，10
×
甘油100ml组成，余量为水，所述百分比为质量百分比)，培养16-20小时，然后以初始od
600
为1的接种量接种于30ml bmmy培养基(该培养基由20g/l蛋白胨，10g/l酵母提取物，10
×
ynb 100ml，10
×
磷酸钾缓冲液(ph 6.0)100ml组成，余量为水，所述百分比为质量百分比)进行培养，每隔24小时补充300μl过滤除菌的甲醇，72小时取2ml样品离心收集上清，之后利用sds-page对重组人源纤连蛋白进行定性分析。检测结果如图8和9所示，可以看出，成功获得了表达重组人源透皮纤连蛋白的高拷贝毕赤酵母基因工程菌株。
36.实施例3
37.1.细胞增殖试验
38.采用mtt法，以人成纤维细胞为实验细胞，检测6种重组人源透皮纤连蛋白和bsa促进细胞增殖的能力。结果如图10所示，可以看出，6种重组人源透皮纤连蛋白相较于bsa表现出更为优异的促进细胞增殖能力，且以含有i区胶原蛋白结合域和iii区细胞整合素结合域的重组人源纤连蛋白f2为基础形成的重组人源透皮纤连蛋白f2.1、f2.2、f2.3相较于以仅含有iii区细胞整合素结合域的重组人源纤连蛋白f1为基础形成的重组人源透皮纤连蛋白f1.1、f1.2、f1.3的促进细胞增殖能力更好。
39.2.细胞迁移试验
40.利用细胞划痕法测定细胞迁移运动，以人成纤维细胞为实验细胞，检测重组人源透皮纤连蛋白和bsa促进细胞迁移的能力。结果如图11所示，可以看出，重组人源透皮纤连蛋白相较于bsa表现出更为优异的促进细胞迁移能力，且以含有i区胶原蛋白结合域和iii
区细胞整合素结合域的重组人源纤连蛋白f2为基础形成的重组人源透皮纤连蛋白f2.1、f2.2、f2.3相较于以仅含有iii区细胞整合素结合域的重组人源纤连蛋白f1为基础形成的重组人源透皮纤连蛋白f1.1、f1.2、f1.3的促进细胞迁移能力更好。
41.3.透皮性能测试
42.本测试以ex vivo离体皮肤组织对样品进行渗透性实验，通过荧光显微镜观察不同时间点荧光标记物质在离体皮肤组织中的累积情况，评价样品的皮肤渗透行为。
43.(1)离体皮肤组织处理
44.组织处理：将新鲜获得的皮肤组织浸入75％酒精中，清洗30s，再使用无菌的pbs缓冲液清洗三次；结束后，用一次性无菌皮肤取样器将皮肤组织切成直径为0.8cm的小圆片，表皮面向上，真皮面向下，放入培养模具中，然后将培养模具转入6孔板中，每孔加入3.7ml培养液，在37℃，5％co2孵箱中培养。
45.(2)渗透能力测试
46.离体皮肤组织培养一天后，将装有离体皮肤组织的小室移入新的六孔板中，给每孔中加入0.9mlpbs。
47.给药：按照测试方案，每个样品的每个时间点设置3重复。用移液枪吸取10ul配制好的样品涂抹至离体皮肤组织表面，将样品涂匀，静置。
48.表1测试方案
[0049][0050][0051]
样本采集：分别于0h、4h、8h时间点采集离体皮肤组织样本，浸于4％多聚甲醛溶液中固定(固定时间≥24h)。冷冻切片，待用。
[0052]
(3)分析结果
[0053]
重组人源透皮纤连蛋白f2.1、f2.2、f2.3及市售重组纤连蛋白的表皮层荧光强度如图12所示，真皮层荧光强度如图13所示。从荧光显微观察的结果可以看出，在8h的模拟渗透过程中，重组人源透皮纤连蛋白f2.1、f2.2、f2.3和市售重组纤连蛋白渗透4h后均已渗透到活细胞层，随着时间的延长，渗透8h后，渗透到活细胞层的量显著性增加，相较于市售重组纤连蛋白，重组人源透皮纤连蛋白f2.1、f2.2、f2.3的透皮性能更好。
[0054]
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1. 重组人源透皮纤连蛋白，其特征在于，为将氨基酸序列如seq id no.1所示的透皮肽space用氨基酸序列如seq id no.2所示的连接肽linker融合到氨基酸序列如seq id no.4所示的重组人源纤连蛋白f1的氨基端所形成的重组人源透皮纤连蛋白f1.1，其氨基酸序列如seq id no.6所示；将氨基酸序列如seq id no.1所示的透皮肽space用氨基酸序列如seq id no.2所示的连接肽linker融合到氨基酸序列如seq id no.4所示的重组人源纤连蛋白f1的羧基端所形成的重组人源透皮纤连蛋白f1.2，其氨基酸序列如seq id no.7所示；将氨基酸序列如seq id no.1所示的透皮肽space用氨基酸序列如seq id no.2所示的连接肽linker融合到氨基酸序列如seq id no.4所示的重组人源纤连蛋白f1的氨基端和羧基端所形成的重组人源透皮纤连蛋白f1.3，其氨基酸序列如seq id no.8所示；将氨基酸序列如seq id no.1所示的透皮肽space用氨基酸序列如seq id no.2所示的连接肽linker融合到氨基酸序列如seq id no.5所示的重组人源纤连蛋白f2的氨基端所形成的重组人源透皮纤连蛋白f2.1，其氨基酸序列如seq id no.9所示；将氨基酸序列如seq id no.1所示的透皮肽space用氨基酸序列如seq id no.2所示的连接肽linker融合到氨基酸序列如seq id no.5所示的重组人源纤连蛋白f2的羧基端所形成的重组人源透皮纤连蛋白f2.2，其氨基酸序列如seq id no.10所示；将氨基酸序列如seq id no.1所示的透皮肽space用氨基酸序列如seq id no.2所示的连接肽linker融合到氨基酸序列如seq id no.5所示的重组人源纤连蛋白f2的氨基端和羧基端所形成的重组人源透皮纤连蛋白f2.3，其氨基酸序列如seq id no.11所示。2. 根据权利要求1所述的重组人源透皮纤连蛋白的编码基因，其特征在于，重组人源透皮纤连蛋白f1.1的核苷酸序列如seq id no.12所示，重组人源透皮纤连蛋白f1.2的核苷酸序列如seq id no.13所示，重组人源透皮纤连蛋白f1.3的核苷酸序列如seq id no.14所示，重组人源透皮纤连蛋白f2.1的核苷酸序列如seq id no.15所示，重组人源透皮纤连蛋白f2.2的核苷酸序列如seq id no.16所示，重组人源透皮纤连蛋白f2.3的核苷酸序列如seq id no.17所示。3.表达权利要求1所述的重组人源透皮纤连蛋白的菌株，其特征在于，为利用高保真dna聚合酶pcr扩增重组人源透皮纤连蛋白f1.1、f1.2、f1.3、f2.1、f2.2或f2.3的核苷酸序列，snabi和noti酶切后连接到经相同双酶切的ppic9k空载体中，菌落pcr和测序验证正确后富集重组质粒并酶切线性化，电转化到毕赤酵母中，通过g418抗性梯度筛选获得的表达重组人源透皮纤连蛋白f1.1、f1.2、f1.3、f2.1、f2.2或f2.3的毕赤酵母基因工程菌sf1.1、sf1.2、sf1.3、sf2.1、sf2.2或sf2.3。4.根据权利要求1所述的重组人源透皮纤连蛋白的表达方法，其特征在于，具体为：将权利要求3所述的表达重组人源纤连蛋白f1.1、f1.2、f1.3、f2.1、f2.2或f2.3的毕赤酵母基因工程菌sf1.1、sf1.2、sf1.3、sf2.1、sf2.2或sf2.3接种在bmmy培养基中，30℃下经甲醇诱导表达72~120小时，收集上清，纯化得到重组人源透皮纤连蛋白f1.1、f1.2、f1.3、f2.1、f2.2或f2.3。

技术总结
本发明公开了一种重组人源透皮纤连蛋白及其表达菌株。所述的重组人源透皮纤连蛋白序列是将人源纤连蛋白中与胶原蛋白和细胞整合素结合的功能域通过连接肽Linker与透皮肽SPACE进行组合所得。本发明的重组人源透皮纤连蛋白具有优异的促进成纤维细胞增殖以及迁移的能力，能够加快伤口愈合过程中的止血阶段，诱导炎症细胞和成纤维细胞等往创面的迁移加速急性炎症阶段，还能激活细胞信号传导反应促进新生组织的增殖和分化，同时具有皮肤透过性，在美容护肤、医疗器械等领域具有广泛的应用前景。用前景。用前景。


技术研发人员：张立国 王巍 张旭
受保护的技术使用者：哈尔滨敷尔佳科技股份有限公司
技术研发日：2023.06.08
技术公布日：2023/9/22