小分子化合物S89在恢复线粒体功能异常中的应用

小分子化合物s89在恢复线粒体功能异常中的应用
技术领域
1.本发明属于医药领域，具体涉及小分子化合物s89在恢复线粒体功能异常中的应用。


背景技术：

2.线粒体是真核细胞内一个有双层膜包裹的细胞器，具有十分重要的功能，其通过氧化磷酸化产生atp为细胞的生命活动提供了能量。线粒体同时还参与了多种细胞中能量代谢，如在心肌细胞中，线粒体的状态对于维持心肌细胞的能量代谢以及收缩功能的正常维持具有重要的作用。线粒体还参与了众多的免疫调节，线粒体dna的释放可以作为免疫反应的信号从而激活一系列的炎症反应。不仅如此，线粒体与肿瘤的关系也密不可分，肿瘤线粒体中代谢关键酶活性的改变会抑制线粒体氧化磷酸化的水平。线粒体还参与细胞的增殖，细胞凋亡与衰老，钙信号传导等多种生理活动。线粒体又是一个高度动态的细胞器，其无时无刻不在进行着融合分裂以及运动，在不同的细胞和不同的生命活动中，线粒体动态的情况也都不一样，细胞通过调控线粒体动态来满足对于各个生命活动阶段的能量需求，代谢需求等多种生理需求。
3.线粒体融合分为两步，包括外膜的融合和内膜的融合，这两个过程由不同的蛋白介导但都同属于发动蛋白超家族，它们都拥有较大的gtp水解酶结构域，线粒体外膜的融合主要由位于线粒体外膜的mitofusion1(mfn1)与mitofusion2(mfn2)共同介导，这两种蛋白在序列以及结构上具有很大的相似性，二者在介导线粒体融合的功能上也具有一定的互补性，参与线粒体内膜融合的蛋白主要是位于线粒体内膜上的opa1，往往会形成多聚体从而促进内膜的融合。
4.腓骨肌萎缩症(charcot-marie-tooth，cmt)是人类最常见的一种遗传性运动与感觉神经疾病，具有明显的遗传异质性，患者多患有四肢远端进行性的肌无力和萎缩伴感觉障碍，严重危害人的健康。cmt主要分为脱髓鞘型(包括cmt1，cmt3，cmt4和cmtx1)和轴索型(cmt2)。cmt2a是其中的一个亚型，其中的2型主要由线粒体外膜蛋白mfn2基因突变导致的，绝大部分属于显性遗传突变，对cmt2a疾病的人的神经活检以及cmt2a疾病模型的老鼠的神经元轴突实验研究发现存在大量的线粒体动力学异常以及功能障碍，并认为这是该类疾病的主要的一种发病原因。靶向线粒体从而恢复线粒体活性继而纠正线粒体动力学异常以及功能障碍，有望为像cmt2a疾病一类神经退行性疾病的治疗提供新的方案。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明提供了小分子化合物s89在制备治疗线粒体功能异常相关疾病药物中的应用。
6.优选的，所述线粒体为drg神经元、运动神经元或肿瘤细胞内的线粒体。
7.优选的，所述小分子化合物s89增强线粒体mfn1蛋白的酶活力。
8.优选的，所述小分子化合物s89调节线粒体形态，促进线粒体融合。
9.优选的，所述小分子化合物s89促进线粒体长度、线粒体面积和线粒体密度的增加。
10.优选的，所述小分子化合物s89提高线粒体的运动比例，改善膜电位的异常变化，提高atp的合成量。
11.优选的，所述小分子化合物s89改善运动神经元的轴突变性。
12.优选的，所述小分子化合物s89抑制肿瘤细胞增殖。
13.本发明还提供了一种治疗线粒体功能异常相关疾病的药物，所述药物包括活性成分s89及药学上可接受的载体，所述s89的有效作用浓度为0.4～20μm。
14.优选的，所述疾病包括cmt2a型腓骨肌萎缩症、肺癌和心脏缺血再灌注损伤综合征。
15.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
16.本发明首次证明了小分子化合物s89的新用途：所述小分子化合物s89可以增强线粒体外膜mfn1蛋白的酶活能力，可用于促进小鼠或人的正常细胞或非正常细胞中线粒体的融合，调节线粒体参数，恢复线粒体的正常形态和功能，可用于制备治疗由线粒体功能异常引起的疾病(cmt2a型腓骨肌萎缩症、肺癌)的药物。
附图说明
17.图1为小分子化合物s89在野生型mef细胞中对线粒体形态的影响，a为免疫荧光法检测线粒体形态，b为线粒体不同形态比例统计图。
18.图2为小分子化合物s89在mfn2 ko的mef细胞中对线粒体形态的影响，a为免疫荧光法检测线粒体形态，b为线粒体不同形态比例统计图。
19.图3为小分子化合物s89在野生型的hela细胞中对线粒体形态的影响，a为免疫荧光法检测线粒体形态，b为线粒体不同形态比例统计图。
20.图4为细胞atp浓度值，a表示野生型的mef细胞，b表示mfn2 ko的mef细胞。
21.图5为小分子化合物s89的浓度与细胞中线粒体融合程度的关系。
22.图6为小分子化合物s89的浓度、处理时间和毒性的关系，a表示不同浓度与毒性的关系，b表示不同浓度处理不同时长与毒性的关系。
23.图7为小分子化合物s89洗脱后细胞中线粒体的形态变化。
24.图8为小分子化合物s89线粒体活性恢复情况，a为免疫荧光法检测线粒体形态，b为线粒体不同形态比例统计图，c为细胞atp生成水平。
25.图9为小分子化合物s89与mfn1蛋白的酶活关系。
26.图10为重编程质粒图谱。
27.图11为小分子化合物s89对cmt2a病人运动神经元的轴突变性影响，a为神经元生长状况，b为轴突面积/胞体聚集体面积的统计图。
28.图12为小分子化合物s89对cmt2a病人运动神经元中线粒体的影响，a为线粒体长度统计，b为线粒体面积统计，c为线粒体密度统计，d为线粒体运动比例统计。
29.图13为小分子化合物s89对cmt2a病人运动神经元中线粒体膜电位的影响，a为荧光显微镜图，b为线粒体去极化比例统计图。
30.图14为小分子化合物s89对drg神经元轴突中线粒体融合的影响。
31.图15为小分子化合物s89对a549肺癌细胞增殖的抑制作用。
具体实施方式
32.本发明所述小分子化合物s89的结构式如下：
[0033][0034]
其中，r1、r2均选自氢原子。
[0035]
本发明所述化合物s89由美国发明专利“15-oxospiramilactone derivatives,preparation methods and uses thereof”(授权号：us 10,112,918b2)中公开的方法合成。
[0036]
本发明发现，小分子化合物s89可以增强线粒体外膜上mfn1蛋白的酶活能力。由于mfn1蛋白与mfn2蛋白可以共同介导线粒体外膜的融合，小分子化合物s89通过增强mfn1蛋白的酶活能力，可以有效促进线粒体外膜的融合，进而促进线粒体的融合。
[0037]
本发明发现，小分子化合物s89促进线粒体融合后，可以调节线粒体参数，增加线粒体的长度和线粒体面积，增加线粒体密度，并且能够提高线粒体的运动比例，改善膜电位的异常变化，提高atp的合成量，达到有效恢复线粒体形态与功能的作用。
[0038]
本发明发现，小分子化合物s89可以促进小鼠drg神经元轴突中线粒体融合。drg为躯体内脏初级感觉中枢，富含周围神经系统感觉神经元。小分子化合物s89通过促进drg神经元轴突中线粒体的融合，可以有效恢复神经元形态和功能。
[0039]
本发明发现，小分子化合物s89可以恢复cmt2a病人运动神经元中线粒体的正常形态和功能，改善cmt2a病人运动神经元细胞中线粒体膜电位的降低，改善cmt2a病人运动神经元的轴突变性，从而促进cmt2a病人运动神经元形态与功能的恢复。表明小分子化合物s89可作为活性成分制备治疗cmt2a疾病的药物。
[0040]
肿瘤细胞线粒体中代谢关键酶活性的改变会抑制线粒体氧化磷酸化的水平，肿瘤细胞中线粒体的异常与肿瘤细胞的增殖密不可分。本发明发现，小分子化合物s89通过恢复a549肺癌细胞中线粒体的正常功能，可以有效抑制a549肺癌细胞的克隆形成，降低a549肺癌细胞的增殖能力，可作为活性成分制备抑制a549肺癌细胞生长的药物。
[0041]
本发明利用小分子化合物s89对线粒体功能的恢复作用，可用于制备治疗线粒体功能异常相关疾病的药物，所述线粒体功能异常也包括线粒体dna突变引发的异常。所述药物以小分子化合物s89为活性成分，加以药学上可接受的载体；所述s89的有效作用浓度为0.4～20μm，优选为1～10μm，更进一步优选为2～5μm。
[0042]
本发明所述由线粒体功能异常引发的相关疾病包括：cmt2a型腓骨肌萎缩症、肺癌和心脏缺血再灌注损伤综合征。
[0043]
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0044]
在本发明具体实施例中：
[0045]
所用药液s89均用dmso配制得到。
[0046]
所采用的细胞系为：野生型小鼠细胞呈现为mef，mfn1基因敲除，mfn2基因敲除的mef细胞来自于美国加州理工学院david c chan实验室，野生型的hela细胞来自于atcc。
[0047]
tom20的多克隆抗体来自于invitrogen。mitotracker orange cmtmros，mitotracker red染料来自于invitrogen。enzchek phophateassakit来自于invitrogen。atp检测试剂盒来自于碧云天。gtp来自thermofisher公司。
[0048]
fbs，dmem培养液均来自于gibco。hipsc/hesc培养基-nctarget，nclaminin511包被蛋白，hipsc/hesc高效冻存液，rock通道抑制剂，edta细胞传代工作液，solase单细胞消化液，0.25％胰蛋白酶消化液，hpsc-运动神经元分化试剂盒均来自中盛溯源公司。
[0049]
质粒pep4eo2sen2k，pep4eo2set2k，pcep4-m2l来自于addgene，bac to bac杆状病毒表达系统试剂盒来自于thermofisher公司。
[0050]
实施例中细胞的培养方法为：
[0051]
1)细胞传代：wt，mfn1 ko，mfn2 ko的mef细胞以及wt，mfn2均为ko的hela细胞均为贴壁生长，都是在37℃，含5％co2的恒温细胞培养箱中培养，所用培养基均为90％dmem+10％血清。当培养皿中的细胞长到百分之90左右时，移除培养基，用预热好的edta清洗3次，然后加入预热好的胰酶放在培养箱消化3～5min，待到显微镜下看到细胞呈现晶莹圆珠状，加入预热好的dmem终止消化，用移液枪吹打后将细胞移到15ml离心管中，4℃1000rpm离心5分钟，吸走上清液，用新鲜的dmen垂悬细胞，按所需比例种在新的培养皿上，水平十字摇匀后放入培养箱。
[0052]
2)细胞复苏：将细胞冻存管从液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴锅解冻，手持轻轻摇晃，肉眼观察到细胞悬液内冰晶完全消失时取出，然后4℃1000rpm离心5分钟，吸走冻存液，加入1ml新鲜的dmem垂悬细胞，加入到新的培养皿中，放入培养箱中即可。
[0053]
3)细胞冻存：从培养箱中取出细胞，加入预热好的edta洗三遍，然后加入预热好的胰酶放入培养箱中消化3～5min，加入预热的dmem终止消化，用移液枪吹打后将细胞移到15ml离心管中，然后4℃1000rpm离心5分钟，吸走上清液，加入配制好的冻存液(90％fbs+5％dmso+5％dmem)垂悬细胞，然后分装到冻存管中，做好标记后放入冻存盒中-80℃过夜，第二天将细胞转入液氮罐中。
[0054]
实施例中所有的统计图均由graphpad prism 6绘制。
[0055]
实施例1
[0056]
本实施例探究了小分子化合物s89对小鼠细胞线粒体形态的影响。
[0057]
1)将野生型，mfn2基因敲除的mef细胞传代到提前铺了玻璃片的6孔板中，等到细胞完全铺展后，分为实验组和对照组分别处理细胞，实验组为2μm s89(终浓度，用dmso配制)处理24h，对照组用相同浓度dmso处理24h。
[0058]
2)细胞处理结束后，吸走培养液，用1
×
pbs洗一下细胞，重复两次。
[0059]
3)用配制好的3.7％的多聚甲醛37℃培养箱中固定细胞20min，然后吸走多聚甲醛，用1
×
pbs洗两次细胞，然后加入0.2％triton x1004℃打孔15分钟。
[0060]
4)打孔结束后，吸走tritonx100，用1
×
pbs洗三次，用1
×
pbs稀释一抗(tom20)到合适浓度(1:200)，滴加到玻璃片上有细胞的一面，4℃过夜孵育。
[0061]
5)吸走一抗，用1
×
pbs洗三次，用1
×
pbs稀释所需要的fitc标记的山羊抗兔的二抗到合适浓度(1:200)，滴加到玻璃片上，室温一小时。
[0062]
6)吸走玻璃片上的二抗，并用1
×
pbs洗三次，然后用封片剂封片，指甲油将玻璃片四周封好，封好后，可以直接拿到荧光显微镜下拍照或者-20℃保存，荧光显微镜拍摄结果见图1～2。
[0063]
由图1可知，小分子化合物s89处理细胞24h后，线粒体破碎的细胞数量略有下降，具有正常线粒体形态的细胞数量明显增加，表明小分子化合物s89能够在野生型的mef细胞中促进线粒体融合，促进线粒体正常形态的恢复。
[0064]
由图2可知，小分子化合物s89处理细胞24h后，线粒体破碎的细胞数量显著下降，具有正常线粒体形态的细胞数量明显增加，表明小分子化合物s89能够在mfn2 ko的mef细胞中促进线粒体融合，促进线粒体正常形态的恢复。
[0065]
实施例2
[0066]
本实施例探究了小分子化合物s89对人细胞线粒体形态的影响。
[0067]
1)将野生型的hela细胞传代到提前铺了玻璃片的6孔板中，等到细胞完全铺展后，分为实验组和对照组分别处理细胞，实验组为2μm s89处理24h，对照组用相同浓度dmso处理24h。
[0068]
2)细胞处理结束后，吸走培养液，用1
×
pbs洗一下细胞，重复两次。
[0069]
3)用配制好的3.7％的多聚甲醛37℃培养箱中固定细胞20min，然后吸走多聚甲醛，用1
×
pbs洗两次细胞，然后加入0.2％tritonx1004℃打孔15分钟。
[0070]
4)打孔结束后，吸走tritonx100，用1
×
pbs洗三次，用1
×
pbs稀释一抗(tom20)到合适浓度(1:200)，滴加到玻璃片上有细胞的一面，4℃过夜孵育。
[0071]
5)吸走一抗，用1
×
pbs洗三次，用1
×
pbs稀释所需要的fitc标记的山羊抗兔的二抗到合适浓度(1:200)，滴加到玻璃片上，室温一小时。
[0072]
6)吸走玻璃片上的二抗，并用1
×
pbs洗三次，然后用封片剂封片，指甲油将玻璃片四周封好，封好后，可以直接拿到荧光显微镜下拍照或者-20℃保存。荧光显微镜拍摄结果见图3。
[0073]
由图3可知，小分子化合物s89处理细胞24h后，线粒体破碎的细胞数量略有下降，具有中间形态和正常线粒体形态的细胞数量明显增加，表明小分子化合物s89能够促进人细胞中线粒体的融合，促进人细胞中线粒体正常形态的恢复。
[0074]
实施例3
[0075]
本实施例探究了小分子化合物s89对细胞atp的生成的影响。
[0076]
1)将野生型与mfn2基因敲除的mef细胞铺在6孔板上，分为实验组和对照组分别处理细胞，实验组为2μm s89处理24h，对照组用相同浓度dmso处理24h。
[0077]
2)吸去细胞培养液，用pbs洗一遍，每个孔加入200μl的细胞裂解液，冰上裂解细胞30min。
[0078]
3)裂解后4℃ 13000rpm离心15min，将上清吸取一个新的1.5ml离心管中，调齐浓度后用于后续atp浓度测定。
[0079]
4)冰上溶解待用的atp检测试剂，用atp检测裂解液将atp标准浓度溶液稀释成0.1μm、1μm、10μm、50μm、100μm这几个浓度，测定atp浓度的标准曲线。
[0080]
5)准备一个孔与孔之间不透光的96孔板，根据需要的孔数每个孔加入100μl的atp检测工作液，室温放置5min，使本底性的atp消耗掉。
[0081]
6)在每个检测孔内加上10μl样品，用枪混匀，间隔3秒后，立即用液闪仪测定rlu值(用luminometer或液闪仪测定rlu值或cpm均可)。根据标准样品曲线计算出样品中atp的浓度的绝对值，结果见图4。
[0082]
由图4可知，野生型的mef细胞和mfn2 ko的mef细胞在2μm s89处理细胞24小时后，atp浓度均明显上升，表明小分子化合物s89能够促进细胞atp的生成。
[0083]
实施例4
[0084]
本实施例探究了小分子化合物s89的有效作用浓度。
[0085]
1)将mfn2基因敲除的mef细胞传代到提前铺了玻璃片的6孔板中，等到细胞完全铺展后，用不同浓度的s89的处理细胞24h。
[0086]
2)细胞处理结束后，吸走培养液，用1
×
pbs洗一下细胞，重复两次。
[0087]
3)用配制好的3.7％的多聚甲醛37℃培养箱中固定细胞20min，然后吸走多聚甲醛，用1
×
pbs洗两次细胞，然后加入0.2％triton x1004℃打孔15分钟。
[0088]
4)打孔结束后，吸走tritonx100，用1
×
pbs洗三次，用1
×
pbs稀释一抗(tom20)到合适浓度(1:200)，滴加到玻璃片上有细胞的一面，4℃过夜孵育。
[0089]
5)吸走一抗，用1
×
pbs洗三次，用1
×
pbs稀释所需要的fitc标记的山羊抗兔的二抗到合适浓度(1:200)，滴加到玻璃片上，室温一小时。
[0090]
6)吸走玻璃片上的二抗，并用1
×
pbs洗三次，然后用封片剂封片，指甲油将玻璃片四周封好，封好后，可以直接拿到荧光显微镜下拍照或者-20℃保存，计算线粒体长宽比，并用线粒体长宽比反应线粒体的融合程度，实验结果见图5。
[0091]
由图5可知，小分子化合物s89的ec
50
值对应的浓度为436
±
85nm，表明小分子化合物s89能够促进线粒体融合的有效作用浓度在0.4μm左右。
[0092]
实施例5
[0093]
本实施例探究了小分子化合物s89的毒性。
[0094]
1)将mfn2基因敲除的mef细胞传代到提前铺了玻璃片的6孔板或者96孔板中，等到细胞完全铺展后，用不同浓度的s89的处理不同的时间。
[0095]
2)通过mtt法以及pi染色的方法来表明药物的毒性作用，结果见图6。
[0096]
由图6可知，采用不同浓度s89处理mfn2 ko的mef细胞24小时后，检测s89的ic
50
值为9.48
±
0.76μm；采用10μm浓度处理mfn2 ko的mef细胞6小时，细胞死亡率为接近于0，若增加处理时间，随着时间的增加，细胞死亡率增加，在10μm处理24h就会有很明显的毒性作用；采用20μm浓度处理mfn2 ko的mef细胞6小时即出现毒性作用。
[0097]
实施例6
[0098]
本实施例探究了小分子化合物s89洗脱后对细胞线粒体融合的作用。
[0099]
1)将mfn2基因敲除的mef细胞传代到提前铺了玻璃片的6孔板中，等到细胞完全铺展后，用2μm s89处理24h。
[0100]
2)细胞处理结束后，加入mitotracker red染色半小时，染色完后换上新鲜的培养基将s89洗脱去，然后直接拿到荧光显微镜下拍照，结果见图7。
[0101]
由图7可知，小分子化合物s89洗脱后，线粒体融合的效果在15min以内就会逐渐消失。
[0102]
实施例7
[0103]
本实施例探究了小分子化合物s89恢复线粒体活性的作用与mfn1蛋白的关系。
[0104]
将mfn1基因敲除的mef细胞传代到提前铺了玻璃片的6孔板中，等到细胞完全铺展后，分为实验组和对照组分别处理细胞，实验组为2μm s89处理24h，对照组用相同浓度dmso处理24h，然后按照实施例1中的免疫荧光的方法去检测线粒体融合情况，以及按照实施例3中的方法检测atp的生成量，结果见图8。
[0105]
由图8可知，敲除mfn1基因的细胞经过小分子化合物s89的处理并不能恢复正常形态，且atp浓度较未处理组略低，表明小分子化合物s89恢复线粒体活性的作用需要mfn1蛋白。
[0106]
实施例8
[0107]
本实施例探究了小分子化合物s89与mfn1蛋白的酶活关系。
[0108]
1.昆虫系统表达和纯化mfn1蛋白
[0109]
将全长mfn1蛋白的cdna片段克隆到载体pfastbac上，经过转化，蓝白斑筛选，跑胶鉴定得到重组好的质粒bacmid。向sf9细胞中转染重组质粒，收取到p3代高滴度病毒用于后续感染。
[0110]
1)sf9细胞悬浮培养在1l的锥形瓶中，密度为1
×
106/ml，等到细胞长到对数期，密度为2
×
106/ml时，加入p3代病毒，感染48～72h后收集细胞。
[0111]
2)收集的细胞倒入离心杯中，4000rpm离心10min后，去上清，而后在用pbs洗一遍，同样是4000rpm离心10min后，去上清。加入蛋白buffer(25mm hepes，2.5mmβ-me，150mm kcl)垂悬细胞，加入蛋白酶抑制剂，然后转入到dounce管中用于破碎，在显微镜下检测破碎效率达到95％即可。
[0112]
3)加入triton-100至其终浓度为2.5％，混匀后4℃溶膜2h，然后4℃ 32000g离心1h，收集上清，上清中按比例(1：30)加入1～2ml strep beads，4℃孵育1h。
[0113]
4)将孵育好的strep beads逐次通过蛋白纯化柱子，然后用50倍柱体积的25mm hepes，150mm kcl，0.1％triton-100，2.5mmβ-me清洗缓冲液洗脱杂蛋白。
[0114]
5)用20ml 25mm hepes(ph7.4)、150mm kcl、0.1％triton-100、5mm d-desthiobiotin洗脱缓冲液与柱子strep beads 4℃孵育20min，然后洗脱目的蛋白到15ml的浓缩管中，4℃4000rpm离心1h，将收集的蛋白转移到离心管中，通过sds-page并使用考马斯亮蓝染色检测蛋白的纯度和浓度，也可直接浸入液氮后-80℃保存。
[0115]
2.mfn1蛋白酶活能力的检测
[0116]
蛋白gtp的酶活能力使用的是invitrogen公司的enzchek phosphate assay kit检测，100μl的反应体系中加入20
×
的reaction buffer(1m tris-hcl，20mm mgcl
2 ph7.5，和2mm sodium azide)，0.1upurine nucleoside phosphorylase，200mm 2-amino-6-mercapto-7-methylpurine riboside和1μm的mfn1蛋白，剩下的体积由纯化蛋白buffer(25mm hepes(ph7.4)、150mm kcl补齐)，将体系与10μm小分子化合物s89室温孵育30min后加入到底部透明的96孔板中，放入多功能酶标仪中，设置温度37℃并在360nm波长处检测其光吸收值，待读数和温度稳定后使用排枪加入0.5mm gtp，并每隔30s读取一次360nm波长的光吸收值，让其反应1h，加入gtp时的时间读数设为0，磷酸的释放效率通过比对标准曲线计算获得。检测mfn1水解gtp的能力，即为mfn1的酶活能力，结果见图9。
[0117]
由图9可知，小分子化合物s89能够增强mfn1蛋白的酶活能力。
[0118]
实施例9
[0119]
本实施例探究了小分子化合物s89与cmt2a病人的运动神经元的轴突变性关系。
[0120]
分别采集两种不同mfn2基因突变(r94w，t105m)的cmt2a病人以及他们的家族正常对照来进行实验。
[0121]
1.人类外周血cd34+的重编程
[0122]
重编程质粒包含三个质粒，共包含人类oct4，sox2，nanog，lin28，c-myc，klf4及sv40lt这7个基因(见图10)。每次转染使用3.0μg pep4eo2sen2k，3.2μg pep4eo2set2k和2.4μg pcep4-m2l dna。
[0123]
准备好1
×
106个cd34+的细胞，紧接着进行重编程质粒的转染，随后接种在包含cd34+细胞扩增培养基的fibronectin/matrigel包被6孔板中。fibronectin和matrigel一起使用来促进细胞电转后的恢复。用于培养细胞的dmem/f12培养基添加n-2，b-27，bfgf，pd0325901，chir99021，a-83-01，hlif，ha-100等因子，这些因子用于电转后2～11天支持细胞重编程培养，随后使用nuwacell hpsc medium进行ipsc扩增，总ipsc克隆数量在电转后第17天进行统计。
[0124]
2.诱导多能干细胞(ipsc)的培养
[0125]
1)细胞传代：ipsc使用matrigel作为铺底基质，在nuwacell hpsc medium上无饲养层培养。使用edta进行传代，当ipsc汇合度达到85％左右时，使用dpbs(不含钙镁)洗涤一次，随后加入0.5mm edta在37℃孵育8分钟(6孔板用量2ml/孔)，随后吸弃edta溶液并逐渐加入2ml的nuwacell hpsc medium以分散细胞团块。轻柔摇晃几次后大部分细胞脱离基质。消化好的细胞团块迅速分装至预先加入新鲜nuwacell hpsc medium的matrigel包被培养板中。为了促进细胞的贴壁和存货，在传代的第一天加入rock inhibitor blebbistatin(2.5μm)。使用此方法，细胞按照1:8～1:10的比例进行传代，3～4天传代一次。
[0126]
2)细胞复苏：先将水浴锅预热至37℃，将matrigel包被的6孔板，提前放置到培养箱中约1小时恢复至室温，取4ml nova完全培养基，按照1:4000比例加入1μl的nuwacell tm blebbistatin(10mm)，恢复至室温。取出1支冷冻的细胞置于37℃水浴锅手持轻轻摇晃，1min内解冻，肉眼观察细胞悬液内冰晶即将完全消失时取出，将细胞悬液移到事先准备好的15ml离心管中，移液管吸取10ml dmem/f12，逐滴加入冻存细胞悬液，160
×
g离心5min，吸弃上清，加入预温的4ml的blebbistatin+nova培养基混匀细胞，尽量避免吹打，吸弃6孔板中的matrigel包被液，将混匀的细胞按照2ml/孔接种到2孔中，置于培养箱中培养。
[0127]
3)细胞冻存：当细胞汇合度达85％左右可以收获冻存，取出4℃冰箱中的nuwacell tm hpsc冻存液，置于室温预温，使用前注意摇匀，吸弃hipsc培养上清，加入2ml/孔的dpbs(不含钙镁)，轻轻摇晃数次，再吸弃，加入2ml/孔的hpsc传代工作液，将细胞置于37℃培养箱中，消化结束，轻轻取出培养板，吸弃edta。摇匀预温的nuwacell tm hpsc冻存液，每孔加入1ml冻存液，轻柔吹打摇匀，随后吸取细胞悬液加入1.5/2ml冻存管中，标记细胞名称、代次(p#)、日期、操作人id。将细胞置于梯度程序降温盒中，并置-80℃冰箱中过夜，次日转入液氮罐中长期保存。
[0128]
3.诱导多能干细胞(ipsc)分化为运动神经元
[0129]
使用中盛溯源的运动神经元分化试剂盒，其中包括分化完全培养基a，b，c，d以及运动神经元前体细胞冻存液。
[0130]
1)当天(day0)，当hpsc在培养皿中的汇合度达到80～90％的时候，将培养基吸除，加入2ml/孔的dpbs(不含钙镁)，轻轻摇晃并吸弃。
[0131]
2)1ml/孔加入预温的solase消化液使溶液完全覆盖孔底，置于细胞培养箱中孵育5～7min，轻轻晃动孔板使细胞完全脱离基质。
[0132]
3)细胞悬液转入1.5ml离心管中，掌上离心机离心10～15s。
[0133]
4)吸弃上清液，加入1ml人运动神经元分化完全培养基a重悬细胞，轻柔吹打使细胞尽量分散成单细胞，并进行计数。
[0134]
5)3～5
×
105cells/孔接种到matrigel包被好的6孔板中，每孔加入2ml人运动神经元分化完全培养基a(含10μm/ml的blebbistatin)。
[0135]
6)置于细胞培养箱中培养，22～24h之后，吸弃细胞培养基，每孔加入2ml人运动神经元分化完全培养基a，置于培养箱中继续培养，每天换液。
[0136]
7)第四天(day4)，吸弃培养基，每孔加入2ml人运动神经元分化完全培养基b，置于培养箱中继续培养，每天换液(day4～9)。
[0137]
8)day 9，吸弃培养基，2ml/孔加入dpbs(不含钙镁)，轻轻摇晃并吸弃。加入1ml/孔预温的solase消化液使溶液完全覆盖孔底，置于培养箱中孵育8～12min，轻轻晃动孔板使细胞完全脱离。
[0138]
9)将细胞悬液转入1.5ml离心管中，掌上离心机离心10～15s。
[0139]
10)吸弃上清，加入1ml分化完全培养基c重悬细胞，轻柔吹打1～2次使细胞尽量分散成单细胞，并进行细胞计数。此处获得的运动神经元前体细胞可以冻存，加入1ml的运动神经元前体细胞冻存液冻存细胞，冻存细胞数2
×
106cells/管。
[0140]
11)按照1～3
×
105cells/孔的密度接种到matrigel包被的12孔板中，加入1ml/孔的分化完全培养基c(含10μm/ml的blebbistatin)，置于培养箱中。培养22～24h之后，吸弃细胞培养基，加入1ml/孔分化完全培养基c，置于培养箱中培养，每天换液(day9～12)。
[0141]
12)day 12吸弃细胞培养基，加入1ml/孔基分化完全培养基d，实验组和对照组分别处理细胞，实验组为0.5μm s89细胞，对照组用相同浓度dmso处理，置于培养箱中，隔天换液。培养到day 30～35时可获得成熟的运动神经元，然后在显微镜明场下观察运动神经元生长状况，见图11。
[0142]
由图11可知，加入小分子化合物s89处理后，神经元轴突状态得到恢复，轴突面积/胞体聚集体面积的比值明显提高，表明加入小分子化合物s89可以改善cmt2a病人的运动神经元的轴突变性。
[0143]
实施例10
[0144]
本实施例探究了小分子化合物s89对cmt2a病人的运动神经元中的线粒体异常的影响。
[0145]
1.mitodendra病毒的包装
[0146]
1)提前传好293t细胞到10cm培养皿中，等到细胞长到70％左右时，用lipo3000进行转染，mitodendra质粒10μg/包装质粒1(pspax)7.5μg/包装质粒2(pmd2.g)2.5μg，6小时后换液。
[0147]
2)24小时后，收取第一次上清到50ml离心管中，包上锡箔纸置于4℃，60h后收取第二次上清，与第一次收集的上清混合到一起。
[0148]
3)收集的病毒液4℃ 2000rpm离心5分钟，将上清液通过0.22μm的滤器滤到一个新的50ml离心管中。将过滤完的病毒液用超高速离心机4℃ 34000rpm离心3h，上清液倒掉，用60μl含有0.1％bsa的pbs垂悬沉淀，然后分装到pcr小管中-80℃储存。
[0149]
2.实验步骤
[0150]
诱导多能干细胞(ipsc)分化出来的运动神经元按照实施例9的方法经过小分子化合物s89处理后，按照实施例1中的免疫荧光的方法来观测线粒体的形态，大小，密度(线粒体的长度，面积，密度均通过imagej软件进行统计)。运动神经元在分化的第25天用mitodendra的病毒感染来标记线粒体，活细胞实时拍摄线粒体的运动。线粒体各项参数和运动状况见图12。
[0151]
由图12可知，小分子化合物s89可以增加线粒体的长度和线粒体面积，并且能够增加线粒体密度，提高线粒体的运动比例。表明，小分子化合物s89可以改善cmt2a病人的运动神经元中的线粒体异常。
[0152]
实施例11
[0153]
本实施例探究了小分子化合物s89对cmt2a病人的运动神经元中的线粒体膜电位的影响。
[0154]
诱导多能干细胞(ipsc)分化出来的运动神经元按照实施例9的方法经过小分子化合物s89处理后，用mitotracker orange cmtmros染色30min，洗去后，按照实施例1中免疫荧光的方法，用tom20抗体标记线粒体，然后在荧光显微镜下观察，并统计线粒体去极化比例，结果见图13。
[0155]
由图13可知，小分子化合物s89处理后的线粒体去极化比例明显降低，表明小分子化合物s89可以改善cmt2a病人的运动神经元中的线粒体膜电位的降低。
[0156]
实施例12
[0157]
本实施例探究了小分子化合物s89对drg神经元中线粒体的融合作用。
[0158]
1.drg神经元分离步骤：
[0159]
1)准备无菌玻片：玻片强酸浸泡过夜，用大量去离子水洗涤后，放入75％的乙醇中保存。分离drg神经元前，用25μg/ml的poly-l-ornithine(pbs稀释)处理玻片，放在培养箱中过夜；
[0160]
2)用不含ca
2+
/mg
2+
的pbs清洗玻片，每次1h共3次，用ddh2o洗涤1次，最后用5μg/ml的laminin包被1h后待用；
[0161]
3)小鼠腹腔注射三溴乙醇(20mg/ml)进行麻醉(180mg/kg)，用75％酒精对小鼠进行消毒，沿脊柱中线剪开背部皮肤并暴露整个脊柱区域，剪断椎管两侧的骨头直到可以取出整个脊柱，必要时修剪掉多余的骨头。(为了避免小鼠毛发污染，可以手术前进行脱毛处理)将整个脊柱剪下来，清除多余的肌肉及其他组织。用无ca
2+
/mg
2+
的hbss进行简单清洗、浸泡。尽量冰上操作；
[0162]
4)将脊柱沿中线剪开，去除脊髓暴露drg神经元，用无菌的眼科镊子小心的将drg球从基部拔出，尽量避免机械损伤到球体，将drg球转移到无ca
2+
/mg
2+
的hbss溶液中，从背部到腹部直到将全部drg神经节取出；
[0163]
5)用显微剪刀剪掉多余的轴突束以及血管，将drg球转移到提前分装好的胶原酶/分散酶中，37℃消化30min，然后放到旋转仪上室温消化30min；
[0164]
6)消化结束后，以1000g的转速于4℃离心2min，去掉上清，将细胞沉淀用1ml提前配好的培养基进行重悬10～15次(缓慢轻柔，尽量保持匀速)，然后用70μm的细胞筛进行单细胞过滤，同时将没有充分消化的组织去除。将过滤后的细胞悬液以200g于4℃离心3min；
[0165]
7)去除上清，将细胞沉淀重悬并计数后种到培养皿中，待数小时细胞贴壁后换液。培养3天左右时胶质细胞开始增殖，这时加入阿糖胞苷来抑制胶质细胞增殖。
[0166]
2.实验步骤
[0167]
体外分离培养小鼠(8周，雄性)的drg神经元，加入0.5μm s89处理24h。按照实施例1中免疫荧光的方法，用tom20抗体标记drg神经元轴突中的线粒体，做好片子后在荧光显微镜下观察，结果见图14。
[0168]
由图14可知，小分子化合物s89能够促进drg神经元中线粒体的融合。
[0169]
实施例13
[0170]
本实施例探究了小分子化合物s89对a549肺癌细胞生长的抑制作用。
[0171]
1.实验步骤
[0172]
(1)细胞计数
[0173]
1)贴壁细胞在edta和胰蛋白酶的作用下，消化成非贴壁状态，用细胞培养基悬浮；
[0174]
2)取出部分细胞悬浮液，按一定比例稀释；
[0175]
3)取10μl稀释的细胞悬浮液，滴加到血球计数板小室中，在显微镜下计数四个小室中的细胞个数；按照公式计算出原液中细胞密度，单位为个每毫升：
[0176]
c＝n/4
×a×
104[0177]
n为4个小室中细胞数目，a为稀释倍数；
[0178]
4)按照浓度将细胞原液进行稀释，终浓度为1个每微升，取100微升接种到六孔板一个孔中(三个复孔)。
[0179]
(2)隔天，将含不同浓度s89的培养基替换原培养基。
[0180]
(3)加s89培养9天后，洗掉培养基，每孔中添加1毫升r250染色液，室温放置10min，移去r250染色液，滴加无水乙醇浸泡数秒洗去浮色，将六孔板放置到清水中，终止染色。晾干，拍照，统计克隆形成情况，结果见图15。
[0181]
由图15可知，添加小分子化合物s89组的a549细胞数量明显变少，表明小分子化合物s89能够抑制a549肺癌细胞的增殖。
[0182]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.小分子化合物s89在制备治疗线粒体功能异常相关疾病药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述线粒体为drg神经元、运动神经元或肿瘤细胞内的线粒体。3.根据权利要求1中的应用，其特征在于，所述小分子化合物s89增强线粒体mfn1蛋白的酶活力。4.根据权利要求1中的应用，其特征在于，所述小分子化合物s89调节线粒体形态，促进线粒体融合。5.根据权利要求1或4所述的应用，其特征在于，所述小分子化合物s89促进线粒体长度、线粒体面积和线粒体密度的增加。6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述小分子化合物s89提高线粒体的运动比例，改善膜电位的异常变化，提高atp的合成量。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述小分子化合物s89改善运动神经元的轴突变性。8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述小分子化合物s89抑制肿瘤细胞增殖。9.一种治疗线粒体功能异常相关疾病的药物，其特征在于，所述药物包括活性成分s89及药学上可接受的载体，所述s89的有效作用浓度为0.4～20μm。10.根据权利要求9所述的药物，其特征在于，所述疾病包括cmt2a型腓骨肌萎缩症、肺癌和心脏缺血再灌注损伤综合征。

技术总结
本发明提供了小分子化合物S89在制备治疗线粒体异常相关疾病药物中的应用，属于医药领域。本发明提供的小分子化合物S89可以增强线粒体MFN1蛋白的酶活能力，具有促进细胞线粒体融合、恢复线粒体形态和功能的作用，同时能改善CMT2A病人运动神经元的轴突变性，可用于制备治疗CMT2A型腓骨肌萎缩症、心脏缺血再灌注损伤综合征的药物，还可用于制备抑制肺癌细胞增殖的药物。增殖的药物。增殖的药物。


技术研发人员：郝小江 陈佺 郭英杰 胡俊杰 晏晨 李艳君 刘垒 于凡 沈璧蓉 张倩萍 张欢
受保护的技术使用者：南开大学 中国科学院动物研究所
技术研发日：2022.03.15
技术公布日：2023/9/22