一株减少植物磷肥施用的黄杆菌菌株及其应用

1.本发明属于农业微生物技术领域，涉及一株减少植物磷肥施用的黄杆菌菌株及其应用。


背景技术：

2.磷元素参与植物体内重要化合物，如核酸、磷脂、蛋白质和高能磷酸化合物等的合成，植物对其需求量大，是植物三大必需营养元素之一，约占植株干重的0.2％。然而土壤往往不能供给植物足够的有效磷，因此在农业生产上，往往通过将磷矿加工为磷肥施入土壤，以满足作物高产对磷素的需求。一方面，随着全球人口的进一步增加，为了养活更多的人口，磷矿的消耗速度也将进一步提升。磷肥施入土壤以后，磷容易被土壤中的粘土矿物吸附固定，成为无效态。据估计，当季的磷肥利用率只有10-20％，绝大部分被土壤固定，1980-2007年间土壤中积累的磷(p2o5)累计超过8500万吨。土壤中过量的磷会随着雨水的淋溶作用进入地下水，或在雨季随径流直接进入河流、湖泊而造成水体富营化等面源污染。有文献报道磷对农业面源污染的贡献率甚至高达67％。
3.甘蓝型油菜是由白菜与甘蓝在自然界中通过远缘杂交形成的异源四倍体作物，最早起源于欧洲，在上世纪二三十年代引入中国，现已成为我国第一大油料作物，产油量接近占国产油料作物产油量的50％。长江流域是我国油菜的主产区，由于土壤脱硅富铝化的作用，该区域的土壤中的fe和al富集较多，往往将土壤中游离态磷固定成植物无法吸收利用的fe-p和al-p，导致有效磷的缺乏。油菜对磷养分缺乏敏感，油菜轻度缺磷时，影响油菜的抽薹开花，并且分枝和角果减少，籽粒不饱满，秕粒多。而当严重缺磷时，油菜根系生长受到抑制，叶片变小呈暗紫色、皱缩不能平展，部分植株甚至枯萎死亡。总之土壤中有效磷的缺乏成为了油菜生产的主要限制因子。
4.如何减少磷肥的投入同时增加土壤中难溶磷的有效性是目前农业生产急需解决的问题。研究发现土壤中的微生物可定植于根际和植物内部，当应用于种子、植物表面或土壤时，可促进植物生长。它们不仅可以通过向土壤中添加养分或提高养分的有效性来提高土壤肥力和作物生产力，还可以保护植物免受病虫害的侵害。此外生物肥料环保、经济高效、无毒，并且在连续使用生物肥料3-4年后，由于微生物自生繁殖作用，无需继续施用，土壤中就有足量的微生物。因此目前解决上述问题，最具有潜力及前景的方法是寻找土壤中的溶磷微生物或者该微生物具有促进植物对磷高效利用的功能，将其加工成微生物制剂，用于农业生产提高磷的利用效率。
5.虽然目前已经报道了多种该类微生物，但主要开发和应用对象都是瓜果及粮食类作物，少有报道适合于油料作物，特别是针对油菜减磷肥不减效甚至增效的微生物。由于通用型的微生物制剂难以在不同作物上发挥稳定功效，所以面临向农民推广困难等问题。因此，筛选针对油菜生产的微生物，开发出相应的微生物制剂对促进油菜农业绿色发展及保障国家食用油安全具有重大意义。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明的目的在于提供一株减少植物磷肥施用的黄杆菌菌株及其应用，可以发挥稳定促生作用，提高土壤中磷有效性，促进植物生长。
7.为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
8.1、一株减少植物磷肥施用的黄杆菌菌株，该菌株为黄杆菌(flavobacterium sp.)c2，已于2023年3月24日在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏编号为cgmcc no.26904。
9.优选的，所述菌株的16s rdna序列如seq id no.1所示。
10.2、一种组合物，其包含前述黄杆菌菌株。
11.3、一种制剂，其有效成分为前述黄杆菌菌株。
12.4、前述黄杆菌菌株、组合物或制剂在溶解难溶磷、增加有效磷含量中的应用。
13.优选的，所述难溶磷包括但不限于：磷酸钙，磷酸铝，磷酸铁。
14.5、前述黄杆菌菌株、组合物或制剂在促进植物生长中的应用。
15.优选的，促进植物生长包括以下部分或全部：
16.(1)增加植物在不同生长发育时期的地上部或地下部生物量；
17.(2)促进植物在不同生长发育时期的株高；
18.(3)促进植物根系的生长；
19.优选的，所述植物为油菜，促进植物生长还包括：
20.(4)促进油菜在低磷条件下根系的生长，尤其是磷敏感型油菜的根系生长：
21.(5)促进油菜籽粒的含磷量；
22.(6)促进油菜籽粒的含油量。
23.6、利用前述黄杆菌菌株促进植物生长的方法，具体步骤如下：
24.步骤一、碾磨风干土壤，过2mm筛，将土壤与蛭石、珍珠岩混合，灭菌，得到灭菌土；
25.步骤二、分装灭菌土至育苗盆里，将植物种子消毒后点在1/2ms培养基中催芽，移栽至灭菌土里，种子出芽后向种子根部接入前述黄杆菌菌株制成的菌液，培养14天即可。
26.优选的，步骤一中，所述土壤为红壤，来自云南石林。
27.优选的，步骤一中，土壤、蛭石和珍珠岩的体积比为6：3：1。
28.优选的，步骤一中，利用高压蒸汽灭菌锅实现灭菌，设置条件为：121℃，1小时，隔24小时以后再次以相同条件灭菌。
29.优选的，步骤二中，使用的育苗盆孔穴数量为：5
×
10，单孔高度和口径分别是12cm和5cm，每个孔穴种一颗，重复10次；每次接入菌液的量为5ml，od＝0.5。
30.优选的，所述植物种子的消毒方法如下：
31.(一)、在2ml的离心管中加入大约1/4体积的植物种子，加入1ml的体积浓度70％酒精并上下颠倒2min，使得酒精与植物种子充分接触，将酒精用移液枪吸出；
32.(二)、酒精吸出后往离心管中加入1ml无菌水，用移液枪吸打，最后吸出无菌水，重复三次以洗净残留的酒精；
33.(三)、向上述离心管中加入体积浓度10％次氯酸钠水溶液，并上下颠倒5min，使得次氯酸钠水溶液与植物种子充分接触，用移液枪吸出加入的次氯酸钠水溶液；
34.(四)、向离心管中加入1ml无菌水，用移液枪吸打，最后吸出无菌水，重复六次以洗
净残留的次氯酸钠。
35.优选的，步骤二中，所述菌液是通过以下方法制备得到的：将前述黄杆菌菌株在28℃条件下培养，待长出单菌落，挑取单菌落接入tsb液体培养基中，摇床过夜培养，离心取沉淀，将该沉淀用无菌水重悬，再次离心取沉淀，将该沉淀利用无菌水调节至od＝0.5
±
0.02。
36.优选的，步骤二中，所述植物种子为油菜种子，具体品种为zs11或r4474。
37.本发明的有益效果在于：
38.本发明筛选获得了一株新的黄杆菌菌株，即黄杆菌(flavobacterium sp.)c2，该菌株已于2023年3月24日在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏编号为cgmcc no.26904。该菌株是通过高通量分离培养油菜根系的细菌而得，通过测定16s rdna的方法鉴定为黄杆菌(flavobacterium sp.)。c2具有良好的溶解难溶无机磷的能力，并且具有分泌iaa的特性。c2溶解无机磷的同时还有助于促进植物(特别是油菜)对磷的高效利用，从而减少磷肥的投入，同时保证作物的产量，此外应用该微生物可以尤其显著促进磷敏感型油菜侧根的生长，增强油菜对低磷环境的适应能力。本发明增加了我国优质微生物种质资源，同时对减施化肥促进农业绿色发展具有重要意义。
39.对c2在三个磷水平下(100％p；50％p；2％p)进行了平板及土培实验，验证了c2对两个主推油菜品种(zs11，正常品种；r4474，p敏感型品种)的促生效益。实验结果表明在不同磷素水平下，接种c2以后相比于对照组，油菜的地上部或地下部鲜重均显著增加，p敏感型品种r4474显示出的这种差异更为显著，并且平板培养实验与土培实验结果相一致。本发明为我国的第一大油料作物油菜，特别是p敏感型油菜，提供了针对性的且效果稳定的微生物种质资源。该菌特殊功能有利于减少农业上磷肥的投入，降低磷素流失到环境中的风险；并且提高了土壤中磷的有效性，促进植物对磷的吸收。应用微生物制剂到农业生产上，符合低碳、环保的可持续要求，有助于我国农业的绿色发展。本发明扩大了促生菌种质资源，尤其扩大了针对油料作物油菜的促生菌种种质资源，为未来开发高效稳定的专属微生物肥料奠定了菌种基础。
附图说明
40.为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明。
41.图1为c2的菌落形态图。
42.图2为c2溶解pko无机磷培养基中的磷酸钙产生透明圈。
43.图3为c2的系统发育树。
44.图4为c2产iaa的定性分析图。
45.图5为低磷(2％p)水平下，磷敏感型油菜r4474接种c2平板培养至7d的表型，其中，a为mock(无菌处理)，b为c2。
46.图6为将c2接种至油菜r4474及zs11，土培至14d的生物量统计图，其中，a为在三个磷素水平(100％、50％、2％)下，地上部鲜重统计情况，b则为地下部鲜重统计情况。
47.图7为低磷(2％p)条件下，r4474接种c2后土培至14d的根系表型图，其中，a为mock(无菌处理)，b为c2处理。
48.图8为接种c2及另一种黄杆菌l2p42d4(d4)，土培至14d的生物量统计图，其中，a为
在低磷(2％p)条件下，地上部鲜重统计情况，b则为地下部鲜重统计情况。
49.保藏信息
50.分类命名：黄杆菌
51.拉丁文学名：flavobacterium sp.
52.保藏单位名称：中国普通微生物菌种保藏管理中心(cgmcc)
53.保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
54.保藏日期：2023年3月24日
具体实施方式
55.下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
56.实施例1：
57.油菜根系内生菌的分离和纯化
58.主要参考文献为中科院遗传所白洋组发表在nature protocols上的《高通量分离培养鉴定植物根系细菌》一文。
59.1、实验材料
60.(1)生物材料
61.样品来源于甘蓝型油菜根系(brassica napus l.)。
62.(2)试剂
63.胰蛋白胨大豆肉汤(tsb)培养基、磷酸缓冲液(pbs)、无菌水、10mm的氯化镁溶液、体积浓度80％甘油水溶液、琼脂。
64.(3)仪器设备
65.超净工作台、电子天平、恒温摇床、高速离心机、
–
80℃超低温冰箱、
–
20℃冰箱。
66.(4)其他
67.镊子、剪刀、50ml无菌离心管、塑料研磨棒、13
×
13cm无菌方皿、60mm细菌培养皿、96孔细菌培养板、96孔酶标板、2.0ml冻存管、microbank菌保管、通道移液器、单道移液器、移液器枪头、parafilm封口膜。
68.2、实验方法
69.在自然土壤上将油菜连根拔出，采集油菜10cm的根系样品约3g，放入50ml的无菌离心管中。用无菌水将根系上肉眼可见的土壤颗粒洗掉。接着减去5g根系转移至新的50ml离心管，管中加入30ml灭菌的磷酸缓冲液，在室温条件下，放置在平板摇床上用180rpm的转速震荡15min，重复3遍。再加入30ml无菌水清洗4遍，最后一次消毒的无菌水均匀涂布在tsb固体培养基表面，放置在28℃环境里培养3天，检查根系表面是否灭菌合格。
70.将清洗并吸水后的根系组织用无菌剪刀剪成2mm的小段，并混合均匀。称取0.02g的根系组织放入1.5ml的无菌离心管。在生物安全柜中，向离心管中加入200μl灭菌的10mm的氯化镁溶液，用无菌研磨棒研磨根系直至成匀浆状。另保存0.1g混匀的根系组织于
–
20℃冰箱用于后期检测根系微生物组。
71.将根系匀浆液转至含有25ml的10mm氯化镁的50ml管中，混匀，室温下静置15min。
72.准备稀释梯度液。分别将500μl、167μl、56μl和的根系匀浆液加入含有1l质量浓度10％ tsb溶液的3个试剂瓶中，稀释成2000
×
、6000
×
、18000
×
的梯度稀释液。
73.将稀释液分装进96孔细胞培养板。在生物安全柜里，摇匀每瓶稀释液，将50ml稀释液倒入13
×
13cm无菌方皿中，用排枪吸取液体移入96孔细胞培养板的每个孔中，每孔160μl，每瓶稀释液转移3个细胞培养板。
74.用parafilm将每一个细胞培养板封口。将培养板放置在室温下孵育2周。
75.2周后观察96孔细胞培养板中细菌的生长情况，保留约30％的孔呈现肉眼可见的浑浊状态的培养板。
76.在96孔细胞培养板每孔样品中添加140μl的体积浓度80％灭菌甘油水溶液，存储在
–
80℃冰箱。
77.用无菌枪头从冰冻的表面挑取细菌培养物，转移至1/2tsb固体平板上。
78.在室温下培养3-5天，挑取单菌落转移至新的1/2tsb固体平板上。此步重复2次。
79.在平板上纯化3次后，挑取第3次平板上的单菌落，用1/2tsb液体培养基进行摇菌，在28℃条件下转速180rpm，摇培5-7天。
80.室温下，将30ml菌液以5000r/min离心10min，弃去上清液至剩余1ml，重悬菌体，吸取800μl的重悬菌液移入冻存管，加入等体积的体积浓度80％的无菌甘油水溶液，混匀，保存至-80℃。
81.3、实验结果
82.通过该高通量的分菌方法，从油菜根系里分离得到了约300株菌种资源。
83.实施例2：
84.对分离到的内生菌进行鉴定
85.除了测序工作交由公司以外，在本实验室完成对分离到的菌株16s dna的扩增和纯化，以及后续筛选工作。
86.1、实验材料
87.(1)生物材料
88.通过上述方法分离到得到的油菜根系内生细菌及大肠杆菌。
89.(2)试剂
90.naoh碱性裂解液、hcl中和液、如下表展示的pcr反应体系所需各种试剂、无核酸酶水、琼脂糖、tae缓冲液、核酸染液、dnamarker。
91.(3)仪器设备
92.pcr仪、-20℃冰箱、凝胶电泳仪、微波炉、凝胶成像仪。
93.(4)其他
94.96孔pcr板、通道移液器、单道移液器、移液器枪头
95.2、实验方法
96.双侧标签两步pcr扩增法扩增细菌的16s rdna序列
97.向96孔pcr板每孔加入10ul菌液，再加入16μl碱性裂解液。
98.将上述体系用排枪吹打混匀后用封板膜封板。将pcr板放于pcr仪，在碱性环境中高温裂解菌体，程序设置为95℃，30min。
99.冷却降温后，向每孔中加入16μl中和缓冲液，混匀并离心，存储于-20℃冰箱。
100.第一轮pcr体系，引物799f(aacmggattagataccckg)
101./1193r(acgtcatccccaccttcc)。将96孔pcr板a12和b12孔分别加入无核酸酶水和
大肠杆菌e.coli的dna作为每个板上的负对照和正对照。(表1、表2)
102.表1.第一轮pcr反应体系
103.成分体积(μl)10
×
buffer3dntps(2.5mmeach)2.4799f(10mm)0.31193r(10mm)0.3hstaq(5u/μl)0.15gdna3双蒸水20.85总体积30
104.表2第一轮pcr反应程序
105.循环数变性退火延伸194℃,2min2
–
3194℃,30s55℃,30s72℃,1min3272℃,5min
106.将第一轮的pcr扩增产物及两个对照用无核酸酶水稀释40倍作为第二轮pcr扩增的模板。
107.第二轮pcr扩增使用带有标签(barcode)和测序所需接头的799f和1193r引物，实现在目的片段3’和5’端添加标签和illumina测序所需序列。(表3、表4)
108.表3.第二轮pcr反应体系
[0109][0110][0111]
表4第二轮pcr反应程序
[0112]
循环数变性退火延伸194℃,2min2
–
2694℃,30s55℃,30s72℃,1min2772℃,5min
[0113]
第二轮pcr扩增结束后，吸取5μl阴、阳性对照的pcr产物，分别与5μl dna上样缓冲液混合，经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。阳性对照产生约500bp的条带，阴性对照无条带，表明第二轮pcr扩增合格。
[0114]
质检合格后，将产物送公司测序，并通过生物信息学的方法鉴定分离培养的细菌。
[0115]
3、实验结果
[0116]
测序结果表明分得的菌株有假单胞菌属、芽孢杆菌属、克雷伯氏菌属、莱弗氏菌属、类芽孢杆菌属、沙雷氏菌属、寡养单胞菌属、鞘氨醇单胞菌属、普氏菌属、分枝杆菌属、多食菌属、鞘氨醇菌属、黄单孢菌属、黄杆菌属和荧光假单孢菌属等。
[0117]
实施例3：
[0118]
对完成分离纯化及鉴定工作的菌株进行溶磷筛选
[0119]
1、实验材料
[0120]
(1)生物材料
[0121]
上述分离得到的油菜根系细菌
[0122]
(2)试剂
[0123]
tsb培养基、无菌水、pko无机磷培养基
[0124]
(3)仪器设备
[0125]
高压蒸汽灭菌锅、摇床、分光光度计、离心机、超净台。
[0126]
(4)其他
[0127]
细菌培养皿、50ml无菌离心管。
[0128]
2、实验方法
[0129]
配制tsb固体培养基：胰蛋白大豆肉汤培养基15g/l、琼脂15g/l；将培养基在高压蒸汽灭菌锅中121℃灭菌20min，培养基冷却到50℃后，在超净台倒平板，冷却待用。
[0130]
用灭过菌的接种环在菌保管中挑去适量的菌液在上述的tsb固体培养基中划线，在28℃条件下培养细菌。
[0131]
配制tsb液体培养基，除了不加琼脂，配制方法同上。
[0132]
倒20ml上述冷却的tsb液体培养基到灭菌的50ml离心管，之后挑选平板划线分离出的单菌落，接入离心管中液体培养基，将离心管放入28℃，转速为180r/min的摇床上扩大培养。
[0133]
离心管中的培养基浑浊到一定程度以后，取出，在离心机中以6000r/min的速度离心6min，将上清液倒掉，加入无菌水重悬，再离心弃掉上清液，重复两次，重新加入无菌水重悬菌液。
[0134]
将菌液od值调到0.5，吸取5μl涂布到pko无机磷培养基上，培养5d，挑选长出溶磷圈的菌株c2。
[0135]
3、实验结果
[0136]
初步发现15株菌株具有溶磷能力，分属于8个属，包括5株黄杆菌属，3株黄单胞菌属，2株寡养单胞菌属，1株莱弗氏菌属，1株普氏菌属，1株分枝杆菌属，1株多食菌属，1株鞘氨醇菌属。其中一株黄杆菌c2(图1、图3)表现出突出的溶磷能力，因此选定用于后续实验。将c2涂布在pko无机磷培养基上后，培养基长出透明圈如图2。测定了c2的全基因组，并进行了功能注释。基因组信息预测该微生物具有产生iaa的功能，之后用salkowski染色法对此进行了验证，证明了c2不仅可以溶解无机难溶磷，还可以产生iaa。
[0137]
实施例4：
[0138]
iaa的测定
[0139]
1、实验材料
[0140]
(1)生物材料
[0141]
分离到的上述内生菌c2
[0142]
(2)试剂
[0143]
l-色氨酸、salkowski试剂、iaa标液。
[0144]
(3)仪器设备
[0145]
微生物恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅、摇床、离心机、超净台、分光光度计。
[0146]
(4)其他
[0147]
50ml离心管、2ml离心管、移液枪。
[0148]
2、实验方法
[0149]
在超净台中挑选平板划线分离出的单菌落接种到装有液体lb培养基的灭菌后的50ml离心管中，在加入浓度为0.5g/l的l-色氨酸，约2.5mmol/l，培养7d后取培养液1ml以12000r/min的速度离心15min，吸取0.5ml上清液到2ml灭菌后的离心管中，再加入1ml salkowski试剂，室温下在暗处反应30min，接着使用分光光度计在波长为530nm出测定od值。同时做一空白对照，以纯iaa为材料制备梯度浓度的iaa标准液，绘制标准曲线，根据绘制的标准曲线及od值计算出培养7d后c2产生的iaa浓度。
[0150]
3、实验结果
[0151]
在28℃培养7d后，在添加l-色氨酸的lb培养基中由c2产生的iaa浓度为：
[0152]
1.40
±
0.20mg/l。(图4)
[0153]
实施例5：
[0154]
c2的无菌培养皿平板实验
[0155]
1、实验材料
[0156]
(1)生物材料
[0157]
上述分离得到的油菜根系细菌c2、r4474及zs11油菜种子
[0158]
(2)试剂
[0159]
tsb培养基、无菌水、1/2缺磷ms培养基、琼脂、hcl溶液、koh溶液
[0160]
(3)仪器设备
[0161]
高压蒸汽灭菌锅、摇床、分光光度计、离心机、超净台、微生物培养箱、ph计。
[0162]
(4)其他
[0163]
细菌培养皿、50ml离心管、25
×
25无菌培养方皿、接种环、封口膜。
[0164]
2、实验方法
[0165]
c2纯培养：用接种环从菌保管中取出适量菌液，在平板上划线分离，放入28℃的培养箱培养，待长出单菌落以后挑取单菌落与tsb液体培养基中，放入摇床中过夜培养。
[0166]
油菜种子进行消毒：具体为：在2ml的离心管中加入大约1/4体积的油菜种子，加入1ml的70％酒精并上下颠倒2min使酒精与油菜种子充分接触，将酒精用移液枪吸出；酒精吸出后往离心管中加入1ml的无菌水，用移液枪吸打最后吸出无菌水，重复三次以洗净残留的酒精；向上述离心管中加入10％次氯酸钠并上下颠倒5min使次氯酸钠与油菜种子充分接触，用移液枪吸出加入的10％次氯酸钠；吸出上述的次氯酸钠溶液后往离心管中加入1ml的无菌水，用移液枪吸打最后吸出无菌水，重复六次以洗净残留的次氯酸钠。
[0167]
配制三个磷水平的1/2ms培养基：按照药品说明及溶液用量，在锥形瓶中加入适量
的1/2ms缺磷培养基及不同含量磷酸二氢钾(100％、50％、2％p水平磷浓度分别为625μm、312.5μm及12.5μm)，调节ph至5.85，再添加15g/l的琼脂，加入适量无菌水放入高压蒸汽灭菌锅中以121℃灭菌20min。
[0168]
将上述的菌液离心，弃掉上清液，用无菌水重悬，再离心弃掉上清液后用无菌水调节菌液od，od＝0.5
±
0.02时符合要求。取出灭好菌的不同磷含量的培养基，待冷却至50℃左右，往培养基中加入菌液并混匀再倒平板，菌液与培养基的体积比为1：200。将消毒好的油菜种子在同一水平线以一定间隔点在25
×
25cm无菌方皿上，用封口膜密封方皿，水平放置于培养间暗培养1d，使得油菜种子胚根扎入培养基，之后将方皿竖直放置，16h光照，8h暗培养，培养至7d收获。
[0169]
3、实验结果
[0170]
在不同磷素水平下相比于对照组，接种c2均可以促进油菜的生长，尤其值得注意的是c2在低磷条件下明显促进磷敏感型r4474油菜侧根的生长(如图5所示)。自然界中植物侧根的增多可以帮助植物吸收更多的养分以增强植物抵御逆境的能力，因此申请人认为这是一种优势表型。为了能让接种c2侧根增多的油菜在后期体现其生长优势，接下来进行了盆栽土培实验。
[0171]
实施例6：
[0172]
c2的盆栽试验
[0173]
1、实验材料
[0174]
(1)生物材料
[0175]
zs11、r4474油菜种子、c2。
[0176]
(2)试剂
[0177]
70％酒精、10％次氯酸钠、无菌水、tsb培养基、1/2ms培养基、琼脂。
[0178]
(3)仪器设备
[0179]
超净台、离心机、高压蒸汽灭菌锅、分光光度计。
[0180]
(4)其他
[0181]
50ml离心管、20ml离心管、13
×
13cm无菌培养皿、移液枪
[0182]
2、实验方法
[0183]
c2纯培养：用接种环从菌保管中取出适量菌液，在平板上划线分离，放入28℃的培养箱培养。
[0184]
油菜种子进行消毒：往2ml的离心管中加入大约1/4体积的油菜种子，加入1ml的体积浓度70％酒精并摇晃2min，将酒精用移液枪吸出；酒精吸出后往离心管中加入1ml的无菌水，用移液枪吸打最后吸出无菌水，重复三次以洗净残留的酒精；向上述离心管中加入质量浓度10％次氯酸钠水溶液并摇晃5min，用移液枪吸出加入的残余的次氯酸钠水溶液；吸出上述的次氯酸钠水溶液后往离心管中加入1ml的无菌水，用移液枪吸打最后吸出无菌水，重复六次以洗净残留的次氯酸钠。
[0185]
13
×
13cm方板发苗：挑取c2的单菌落，接种至1/2tsb(牛肉膏大豆肉汤)液体培养基上培养，在摇床培养至对数生长后期，离心后倒掉上清液得到菌体，加入无菌水重悬，将微生物菌剂的od值调到0.5；再将该菌剂加入到冷却至50℃的1/2ms培养基中，混匀后倒平板，将消毒后的油菜种子点在平板上，暗培养一天发芽。
[0186]
土培试验：碾磨风干土，收集过0.5mm的筛子土样，将土与蛭石珍珠岩按照6：3：1的体积比混合，将混合好的土装入两层生物安全袋，在高压蒸汽灭菌锅中灭菌条件为121℃，1h，24h以后再灭一次，灭菌后的土待用；分装灭过菌待用的土样至育苗盆里，挑选上述在平板中发芽均匀的油菜种子，移栽至土壤里，当种子从土壤里出芽后，向根部接入1ml od＝0.5
±
0.02的菌液，培养14d以后收获油菜。
[0187]
3、实验结果
[0188]
接种c2在各个磷素水平下均能促进两个油菜品种r4474及zs11生长。在盆栽实验减少磷肥施用50％和施用2％磷肥的情况下(100％p为1kg土加200mg p2o5,则50％p：100mg/kg，2％p:4mg/kg；磷来源为磷酸钙)，接种该菌株比不接种该菌株的对照组相比，油菜株高、地上及地下鲜重、地上及地下干重、叶面积、主根长度和侧根根密度等均显著增加。并且两种油菜接菌后，在施用50％磷肥水平下，其生物量与正常施用磷肥的未接菌的油菜相比甚至具有更高的生物量。尤其值得注意的是在低磷条件下c2对磷敏感型油菜侧根的生长的促进效果比对正常型zs11侧根促进效果更为显著，因此c2可能对磷敏感型油菜适应低磷环境胁迫具有重大的意义。(表5、表6、图6、图7)
[0189]
表5.不同磷素水平下zs11地上地下部鲜重(14d)
[0190][0191]
表6.不同磷素水平下r4474地上地下部鲜重(14d)
[0192][0193][0194]
实验用与c2同属的具有促生效应的黄杆菌l2p42d4(简称d4，该菌株经电商购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，北京。)，进行了油菜接菌实验。实验结果如图8所示，表明相比于黄杆菌d4，c2对油菜的促生效果更为显著，具有更大的应用潜力。
[0195]
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

技术特征：
1.一株减少植物磷肥施用的黄杆菌菌株，其特征在于，该菌株为黄杆菌(flavobacteriumsp.)c2，已于2023年3月24日在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏编号为cgmccno.26904。2.根据权利要求1所述的一株减少植物磷肥施用的黄杆菌菌株，其特征在于，所述菌株的16s rdna序列如seq id no.1所示。3.一种组合物，其特征在于，其包含权利要求1或2所述黄杆菌菌株。4.一种制剂，其特征在于，其有效成分为权利要求1或2所述黄杆菌菌株。5.权利要求1或2所述黄杆菌菌株、组合物或制剂在溶解难溶磷、增加有效磷含量中的应用。6.权利要求1所述黄杆菌菌株、权利要求3所述组合物或权利要求4所述制剂在促进植物生长中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，促进植物生长包括以下部分或全部：(1)增加植物在不同生长发育时期的地上部或地下部生物量；(2)促进植物在不同生长发育时期的株高；(3)促进植物根系的生长。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述植物为油菜，促进植物生长还包括：(4)促进油菜在低磷条件下根系的生长，尤其是磷敏感型油菜的根系生长：(5)促进油菜籽粒的含磷量；(6)促进油菜籽粒的含油量。9.利用权利要求1或2所述黄杆菌菌株促进植物生长的方法，其特征在于，具体步骤如下：步骤一、碾磨风干土壤，过2mm筛，将土壤与蛭石、珍珠岩混合，灭菌，得到灭菌土；步骤二、分装灭菌土至育苗盆里，将植物种子消毒后点在1/2ms培养基中催芽，移栽至灭菌土里，种子出芽后向种子根部接入前述黄杆菌菌株制成的菌液，培养14天即可。

技术总结
本发明公开了一株减少植物磷肥施用的黄杆菌菌株及其应用，即黄杆菌(Flavobacteriumsp.)C2，该菌株已于2023年3月24日在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏编号为CGMCC NO.26904。C2具有良好的溶解难溶无机磷的能力，并且具有分泌IAA的特性。C2溶解无机磷的同时还有助于促进植物(特别是油菜)对磷的高效利用，从而减少磷肥的投入，同时保证作物的产量，此外应用该微生物可以尤其显著促进磷敏感型油菜侧根的生长，增强油菜对低磷环境的适应能力。本发明增加了我国优质微生物种质资源，同时对减施化肥促进农业绿色发展具有重要意义。具有重要意义。具有重要意义。


技术研发人员：李楠楠 罗誉 刘灿 马丽革 刘和鑫
受保护的技术使用者：西南大学
技术研发日：2023.06.16
技术公布日：2023/9/22