雄性不育动物模型的构建方法和应用与流程

1.本技术涉及动物模型技术领域，特别是涉及一种雄性不育动物模型的构建方法和应用。


背景技术：

2.不孕不育不仅是一个全球性的医学问题，也是目前人口与健康领域面临的严峻挑战。在不孕不育中，男性因素约占50％，通常表现为精液质量异常，如无精子症、少精子症、弱精子症、畸形精子症。临床上，导致男性不育的病因非常复杂，主要包括：遗传因素、环境因素、感染因素及免疫因素等，其中，包括基因突变在内的遗传因素是导致男性不育的重要原因。
3.近些年来，高通量测序方法的飞速发展，使许多与男性不育的相关候选新基因得到了鉴定。但是这些基因是否会导致男性不育？这些基因如何导致男性不育？相关问题有待进一步研究解释。


技术实现要素：

4.基于此，本技术提供了一种模拟人kif6 c.1325_1326del突变的雄性不育动物模型的构建方法和应用。采用该方法构建的雄性不育动物模型表现出精子形态和运动力明显异常，能够用于研究kif6缺陷导致精子发生障碍的分子机制、并为携带该基因缺陷的患者提供临床治疗思路和策略。
5.具体技术方案如下：
6.根据本技术的一个方面，提供了一种雄性不育动物模型的构建方法，所述构建方法通过crispr/cas9系统构建模拟人kif6 c.1325_1326del突变的动物模型。
7.在其中一个实施例中，用于制备所述雄性不育动物模型的动物为小鼠；所述构建方法通过crispr/cas9系统敲除小鼠kif6基因的第13号外显子和第14号外显子而构建雄性不育动物模型。
8.在其中一个实施例中，所述构建方法包括如下步骤：
9.针对小鼠的kif6第13号外显子的上游和第14号外显子的下游分别设计第一sgrna识别片段和第二sgrna识别片段；
10.将所述第一sgrna、所述第二sgrna和cas9 mrna转入小鼠受精卵内；
11.将所述受精卵移植到代孕雌鼠体内，产出f0代；及
12.将所述f0代与野生型进行交配，获得f1代杂合子，将f1代杂合子进行自交，获得f2代纯合子突变小鼠。
13.在其中一个实施例中，所述第一sgrna识别片段的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述第二sgrna识别片段的核苷酸序列如seq id no.2所示。
14.在其中一个实施例中，所述构建方法还包括如下步骤：
15.合成含有所述第一sgrna识别片段的第一双链dna和含有所述第二sgrna识别片段
的第二双链dna；
16.构建含有所述第一双链dna的第一表达载体和含有所述第二双链dna的第二表达载体；
17.提取所述第一表达载体和所述第二表达载体的dna；及
18.以所述第一表达载体和所述第二表达载体的dna作为转录模板，获得所述第一sgrna的mrna和所述第二sgrna的mrna。
19.在其中一个实施例中，合成所述第一双链dna和所述第二双链dna的步骤包括：
20.在所述第一sgrna识别片段的5’端加上粘性末端序列，形成核苷酸序列如seq id no.3所示的片段；在所述第一sgrna识别片段的互补序列的两端加上黏性末端序列，形成核苷酸序列如seq id no.4所示的片段；对带有粘性末端的第一sgrna及其带有粘性末端的互补序列进行退火处理，形成第一双链dna；
21.在所述第二sgrna识别片段的5’端加上粘性末端序列，形成核苷酸序列如seq id no.5所示的片段；在所述第二sgrna识别片段的互补序列的两端加上黏性末端序列，形成核苷酸序列如seq id no.6所示的片段；对带有粘性末端的第二sgrna及其带有粘性末端的互补序列进行退火处理，形成第二双链dna。
22.在其中一个实施例中，通过如下步骤合成所述cas9 mrna：
23.提供线性化的cas9表达载体作为转录模板；
24.使用核苷酸序列如seq id no.7～8所示的引物对进行体外转录，合成cas9mrna。
25.在其中一个实施例中，所述构建方法还包括如下步骤：
26.使用核苷酸序列如seq id no.9～10所示的引物对鉴定f1代杂合子的基因型。
27.在其中一个实施例中，所述构建方法还包括如下步骤：
28.使用核苷酸序列如seq id no.9～12所示的引物对鉴定f2代纯合子的基因型。
29.根据本技术的另一个方面，提供了一种采用上述的雄性不育动物模型的构建方法构建的雄性不育动物模型在筛选治疗男性不育相关疾病的药物中的应用。
30.与传统技术相比，本技术具有如下有益效果：
31.申请人通过研究发现少弱畸形精子症的男性不育患者携带有kif6(nm_145027)：c.1325_1326del(p.t442sfs*3)的双等位基因突变，该突变导致kif6蛋白在第442个氨基酸位点引入终止密码子，编码蛋白发生截短；基于此，构建一种蛋白变异与该kif6突变相似的小鼠突变模型，能够用于研究kif6基因在精子发生过程中所起的作用。
附图说明
32.为了更清楚地说明本技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
33.图1为利用crispr/cas9技术构建模拟男性不育患者携带的kif6c.1325_1326del(p.t442s fs*3)突变的小鼠模型的示意图；
34.图2为验证kif6 c.1325_1326del(p.t442s fs*3)突变患者和突变小鼠携带的突变均可产生截断蛋白的蛋白免疫印迹图；
35.图3为px330的质粒图谱；
36.图4为kif6突变小鼠模型f1代的琼脂糖凝胶电泳检测图；
37.图5为kif6突变小鼠模型f1代的测序峰图；
38.图6为鉴定引物在kif6基因上的定位示意图；
39.图7为kif6突变小鼠模型f2代的基因型鉴定结果图；
40.图8为kif6突变小鼠的生育力鉴定结果图；
41.图9为rt-pcr检测不同小鼠中kif6基因的表达；a为rt-pcr扩增产物的凝胶电泳检测图，b为kif6
mut/mut
小鼠与kif6
wt/mut
小鼠的kif6表达量分析结果图；
42.图10为kif6
wt/wt
小鼠、kif6
wt/mut
小鼠与kif6
mut/mut
小鼠的体型比较图；
43.图11为不同小鼠的睾丸组织大小和统计分析图；
44.图12为kif6
mut/mut
小鼠与kif6
wt/mut
小鼠的附睾精子的数目、形态和活动力比较图；a为精子数目的统计分析图，b为前向运动的精子比例的统计分析图，c为精子曲线运动速度的统计分析图，d为精子直线运动速度的统计分析图，e为精子平均运动速度的统计分析图，f为精子平均摆动振幅的统计分析图，g为平均线性运动的精子比例的统计分析图，h为静止的精子比例的统计分析图。
具体实施方式
45.为使本技术的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，对本技术的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本技术。但是本技术能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本技术内涵的情况下做类似改进，因此本技术不受下面公开的具体实施例的限制。
46.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本技术的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本技术。除非另有特别说明，本技术中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
47.crispr是细菌和古生菌抵抗噬菌体感染的一种适应性免疫系统。在这个系统中，单链引导rna(single guide rna,sgrna)引导核酸内切酶到特定的基因组序列，并在pam序列(protospacer adjacent motif)附近剪切dna形成dna双链断裂(double-strand dna break,dsb)，随后可以利用同源重组修复机制将外源模板中的突变信息引入基因组dna中。
48.wes(whole exome sequencing,全外显子组测序)：指利用序列捕获技术将全基因组的外显子区域dna捕获富集后进行高通量测序,能够直接发现与蛋白质功能变异相关的遗传变异snp(单核苷酸多态性)。
49.rt-pcr(reverse transcription-polymerase chain reaction，反转录聚合酶链反应：将rna的反转录(reverse transcription)和cdna的聚合酶链式扩增(pcr)相结合的技术。首先提取组织或细胞中的总rna，以其中的mrna作为模板，采用oligo(dt)或随机引物利用反转录酶反转录成cdna。再以cdna为模板进行pcr扩增，而获得目的基因或检测基因表达。
50.申请人通过全外显子组测序(whole exome sequencing,wes)在1例少弱畸形精子症不育患者中发现驱动蛋白家族成员kif6(kinesin family member 6，驱动蛋白家族成员
id no.2所示的核苷酸序列为：5
’‑
accctatcaattgtacctgg-3’。
65.采用上述的特定序列的两条sgrna识别片段，能够快速准确地对小鼠kif6基因的第13和14号外显子的特定序列进行特异性敲除和敲入，模拟男性不育患者携带的kif6(nm_145027)：c.1325_1326del(p.t442s fs*3)双等位基因突变。
66.在其中一些具体示例中，上述构建方法还包括如下步骤：
67.合成含有第一sgrna识别片段的第一双链dna和含有第二sgrna识别片段的第二双链dna；
68.构建含有第一双链dna的第一表达载体和含有第二双链dna的第二表达载体；
69.提取第一表达载体和第二表达载体的dna；及
70.以第一表达载体和第二表达载体的dna作为转录模板，获得第一sgrna的mrna和第二sgrna的mrna。
71.在其中一些具体示例中，合成上述第一双链dna和上述第二双链dna的步骤包括：
72.在第一sgrna识别片段的5’端加上粘性末端序列，形成核苷酸序列如seq id no.3所示的片段；在第一sgrna识别片段的互补序列的两端加上黏性末端序列，形成核苷酸序列如seq id no.4所示的片段；对带有粘性末端的第一sgrna及其带有粘性末端的互补序列进行退火处理，形成第一双链dna；
73.在第二sgrna识别片段的5’端加上粘性末端序列，形成核苷酸序列如seq id no.5所示的片段；在第二sgrna识别片段的互补序列的两端加上黏性末端序列，形成核苷酸序列如seq id no.6所示的片段；对带有粘性末端的第二sgrna及其带有粘性末端的互补序列进行退火处理，形成第二双链dna。
74.具体地，seq id no.3所示的核苷酸序列为：
[0075]5’‑
cacctaatacgactcactataggggacccgtcattaagttgaca-3’；
[0076]
seq id no.4所示的核苷酸序列为：
[0077]5’‑
aaacttgtcaacttaatgacgggtcccctatagtgagtcgtatta-3’；
[0078]
seq id no.5所示的核苷酸序列为：
[0079]5’‑
cacctaatacgactcactatagggaccctatcaattgtacctgg-3’；
[0080]
seq id no.6所示的核苷酸序列为：
[0081]5’‑
aaactccaggtacaattgatagggtccctatagtgagtcgtatta-3’。
[0082]
通过构建含有sgrna识别片段的表达载体，并在体外转录，以此获得sgrna的mrna。
[0083]
在其中一些具体示例中，通过如下步骤合成上述cas9 mrna：
[0084]
提供线性化的cas9表达载体作为转录模板；
[0085]
使用核苷酸序列如seq id no.7～8所示的引物对进行体外转录，合成cas9mrna。
[0086]
具体地，seq id no.7所示的核苷酸序列为：
[0087]5’‑
ttaatacgactcactatagggatggactataaggaccacgac-3’；
[0088]
具体地，seq id no.8所示的核苷酸序列为：
[0089]5’‑
gcgagctctaggaattcttac-3’。
[0090]
在其中一些具体示例中，上述构建方法还包括如下步骤：使用核苷酸序列如seq id no.9～10所示的引物对鉴定f1代小鼠的基因型。
[0091]
具体地，seq id no.9所示的核苷酸序列为：
[0092]5’‑
tgttctgagtagtagccatctct-3’；
[0093]
seq id no.10所示的核苷酸序列为：
[0094]5’‑
tgtgcaagcatctaatccatcac-3’。
[0095]
在其中一些具体示例中，上述构建方法还包括如下步骤：使用核苷酸序列如seq id no.9～12所示的引物对鉴定f2代小鼠的基因型。
[0096]
具体地，seq id no.11所示的核苷酸序列为：
[0097]5’‑
ctaaggcatttagcctgggagaa-3’；
[0098]
具体地，seq id no.12所示的核苷酸序列为：
[0099]5’‑
ggtaccctcgcttgcttactc-3’。
[0100]
在其中一些具体示例中，上述鉴定的方法为pcr扩增或sanger测序。
[0101]
上述雄性不育动物模型的构建方法至少具备如下优点：
[0102]
通过靶向小鼠kif6蛋白2个coiled-coil结构域之间的sgrna，以获得仅包含n端驱动蛋白马达结构域和靠近n端的1个coiled-coil结构域的截短蛋白，从而构建kif6基因突变的雄性不育动物模型，能够模拟男性不育患者kif6的双等位基因突变(c.1325_1326del[p.t442s fs*3])。
[0103]
与野生型相比，采用上述方法构建的雄性不育动物模型中精子的前向运动、曲线运动、直线运动、平均运动速度、平均摆动振幅和平均线性运动的精子比例均降低，而静止的精子比例明显增加。表面上述的雄性不育动物模型能够用于研究与分析精子发生障碍的分子机制，为男性不育患者的诊断和治疗提供新的思路。
[0104]
本技术的一些实施方式还提供了一种采用上述方法构建的雄性不育动物模型在筛选治疗男性不育相关疾病的药物中的应用。
[0105]
下面将结合具体实施例和对比例对本技术作进一步说明，但不应将其理解为对本技术保护范围的限制。
[0106]
实施例1：构建kif6突变小鼠模型
[0107]
(1)sgrna的初步定位
[0108]
人类kif6蛋白由814个氨基酸构成，包括1个驱动蛋白马达结构域(kinesin motor domain)和3个coiled-coil结构域，患者kif6(nm_145027)：c.1325_1326del(p.t442s fs*3)突变导致截短蛋白(仅包含n端驱动蛋白马达结构域和靠近n端的1个coiled-coil结构域)产生。小鼠kif6蛋白由802个氨基酸构成，包括1个驱动蛋白马达结构域(kinesin motor domain)和2个coiled-coil结构域。
[0109]
进一步地，申请人利用crispr/cas9技术，模拟通过wes测序在1例少弱畸形精子症男性不育患者中发现kif6(nm_145027)：c.1325_1326del(p.t442s fs*3)的双等位基因突变构建kif6基因突变小鼠(kif6
mut/mut
)，分别靶向kif6基因的exon 13上游和exon 14下游设计2条sgrna，以破坏小鼠kif6蛋白中靠近c端的1个coiled-coil结构域，以获得仅包含n端驱动蛋白马达结构域和靠近n端的1个coiled-coil结构域的截短蛋白。
[0110]
生物信息学预测显示突变小鼠kif6基因缺失第13、14号外显子后导致编码的kif6蛋白在第486个氨基酸位点引入终止密码子，导致翻译的kif6蛋白发生截短；而kif6 c.1325_1326del突变编码的kif6蛋白是在第442个氨基酸位点引入终止密码子，导致翻译的kif6蛋白发生截短(如图1所示)；二者均为功能缺失性的突变。
[0111]
体外过表达质粒转染hek293细胞实验也揭示患者携带的kif6(nm_145027)：c.1325_1326del(p.t442s fs*3)突变和小鼠携带的突变序列均导致截短蛋白产生(如图2所示)。表明上述突变小鼠可以用来模拟男性患者的kif6 c.1325_1326del突变，并用于研究kif6在精子发生过程中所起的作用。
[0112]
(2)靶向kif6突变位点sgrna的设计
[0113]
在张锋建立的http://crispor.tefor.net/网站上检索靶向kif6(genbank：nm_177052.3；ensembl：ensmust00000162854.2)，针对kif6的exon13上游设计合成第一的sgrna(pam为ngg)，针对kif6的exon14下游设计合成第二sgrna(pam为ngg)；在cctop网站预测切割效率较好以及脱靶可能性较低的2条sgrna。其中，第一sgrna的核苷酸序列如seq id no.1所示，切割效率为0.57；第二sgrna的核苷酸序列如seq id no.2所示，切割效率为0.68。
[0114]
由于sgrna模板的转录需要t7启动子，因此在第一sgrna和第二sgrna的5’端分别加上t7启动子序列，合成核苷酸序列如seq id no.3所示和seq id no.5所示的序列，分别命名为kif6-sgrna-1-f和kif6-sgrna-2-f；在第一sgrna和第二sgrna的互补序列的两端分别加上粘性末端，合成核苷酸序列如seq id no.4所示和seq id no.6所示的序列，分别命名为kif6-sgrna-1-r和kif6-sgrna-2-r；用于sgrna的转录。序列信息如表1所示。
[0115]
表1
[0116][0117]
(3)构建表达载体
[0118]
sgrna退火形成双链dna：将第一sgrna的转录模板序列(kif6-sgrna-1-f和kif6-sgrna-1-r)和第二sgrna的转录模板序列(kif6-sgrna-2-f和kif6-sgrna-2-r)分别稀释成100umol/l的终浓度，正(f)、反(r)链各取10ul加入pcr管中，用封口膜封口，放入500ml～600ml烧开的开水中，自然退火至室温形成第一双链dna(dsdna)和第二双链dna。
[0119]
px330载体bbsi酶切线性化：利用bbsi酶切线性化px330克隆载体(图3为px330的质粒图谱)，酶切反应体系如表2所示，将配置好的反应试剂混合后离心，放入37℃水浴锅中孵育0.5h，每隔一段时间振荡一次并离心，以防液滴蒸发至管盖上。
[0120]
表2
[0121]
名称用量px3303μgbbsi-hf1.5μl10
×
nebuffer5μlddh2o补足至50μl
[0122]
按表3所示的反应体系进行连接，16℃反应3h，环化构建表达载体：以第一双链dna为模板构建第一表达载体，以第二双链dna为模板构建第二表达载体。
[0123]
表3
[0124][0125]
(4)体外转录扩增sgrna
[0126]
选取sgrna模板序列下游的酶切位点，用kpni核酸内切酶对第一表达载体和第二表达载体进行线性化，因为未线性化的环状质粒作为模板可能会获得不同长度的rna转录本，酶切线性化后可以确保获得确定长度及序列的sgrna mrna转录本；反应体系如表4所示，将配置好的反应试剂混合后离心，放入37℃水浴锅中孵育0.5h，每隔一段时间振荡一次并离心。分别提取线性化第一表达载体和第二表达载体的dna，作为sgrna体外转录的模板。
[0127]
表4
[0128]
成分用量第一表达载体或第二表达载体3μgkpni1.5μl10
×
nebuffer5μlddh2o补足至50μl
[0129]
根据megashortscript t7 kit试剂盒的步骤要求，在pcr管中按表5的反应体系进行体外转录反应：37℃孵化过夜以获得最大产量。孵育结束后，在体系中加入1μl的turbo dnase，于37℃下孵育15分钟，以去除dna模板。随后，使用酚-氯仿提取/nh4oac沉淀法纯化得到第一sgrna或第二sgrna，用10μl～20μl无rna酶水溶解。通过体外转录，从而获取sgrna mrna。
[0130]
表5
dnase，37℃孵育30分钟。
[0141]
表8
[0142]
试剂体积t72
×
ntp/arca10μl10
×
t7reactionbuffer2μlt7-cas9产物1μgt7enzymemix2μlnuclease-freeh2o补足至20μl
[0143]
在上述反应的产物中加入poly(a)尾，按表9所示的顺序依次加入加尾试剂。混匀后，移除2.5μl混合液，再加入4μl e-pap；混匀，37℃孵化45分钟。随后，使用酚-氯仿提取/nh4oac沉淀法纯化cas9 mrna；用10μl～20μl无rna酶水溶解沉淀。
[0144]
表9
[0145][0146][0147]
(6)显微注射及f0代鼠的鉴定：分别将上述步骤(4)中扩增获得的第一sgrna mrna、第二sgrna mrna和步骤(5)中合成的cas9 mrna进行稀释，得到25ng/μl的第一sgrna mrna和第二sgrna mrna、以及100ng/μl的cas9 mrna，各取10μl，得到共计30μl的显微注射混合液。从交配后0.5天的供体母鼠子宫内获取受精卵，挑选形态良好、发育状态适中的受精卵，转移至注射皿的培养基内，将显微注射混合液注射到受精卵；随后，将显微注射后的受精卵送回到代孕小鼠输卵管中；小鼠出生后进行pcr和测序鉴定，获得阳性f0代小鼠。
[0148]
(7)f1代小鼠的繁殖和鉴定：将步骤(6)中性成熟的阳性f0小鼠分别与野生型鼠配繁一代，对f1代小鼠进行pcr和测序验证。f1代小鼠将用于进一步繁殖获得kif6纯合突变鼠(kif6
mut/mut
)。
[0149]
用表10所示的特异性引物对小鼠kif6基因座的靶向区域进行pcr扩增。通过对pcr产物进行测序以确认靶向的准确性。用kif6-f1和kif6-r1引物扩增f1代小鼠的脚趾dna(打靶成功的条带大小约为500bp，野生型条带大小为75740bp)，图4为扩增产物的1％琼脂糖凝胶电泳图；图5为k1样本的测序峰图，其中k1、k2、k3、k4测序结果表明这些f1代小鼠构建成功。
[0150]
表10
[0151]
序号名称序列(5
’‑3’
)seqidno.9kif6-f1tgttctgagtagtagccatctctseqidno.10kif6-r1tgtgcaagcatctaatccatcac
[0152]
(8)f2代小鼠的鉴定
[0153]
f1代杂合雄鼠(kif6
wt/mut
)与杂合雌鼠合笼后，分别采用表10和表11所示的引物对出生的f2代小鼠进行基因型鉴定(各引物在kif6基因上的定位如图6所示)。检测结果如图7所示(
♂
为雄鼠，
♀
为雌鼠，-/-指kif6
mut/mut
小鼠，+/-指kif6
wt/mut
小鼠)；杂合小鼠(kif6
wt/mut
)能够扩增出大小为500bp和349bp的两条目的条带；纯合小鼠(kif6
mut/mut
)仅能扩增出大小为500bp的目的条带。
[0154]
表11
[0155]
序号名称序列(5
’‑3’
)seqidno.11kif6-f2ctaaggcatttagcctgggagaaseqidno.12kif6-r2ggtaccctcgcttgcttactc
[0156]
实施例2：kif6突变小鼠的检测与鉴定
[0157]
(1)生育力检测：抽提小鼠脚趾dna，通过琼脂糖凝胶电泳结合sanger测序进行基因型鉴定。将kif6
mut/mut
雄鼠与野生型雌鼠合笼3个月，评估kif6
mut/mut
雄鼠是否可育。结果如图8所示，与kif6
wt/wt
雄鼠和kif6
wt/mut
雄鼠相比，kif6
mut/mut
雄鼠完全不育。
[0158]
(2)kif6
mut/mut
雄鼠表型鉴定：取3只8～10周大的野生型雄鼠(kif6
wt/wt
)、杂合雄鼠(kif6
wt/mut
)和纯合突变雄鼠(kif6
mut/mut
)，进行拍照和称重，观察突变鼠的发育情况；接着分别取kif6wt/mut雄鼠和kif6
mut/mut
雄鼠的睾丸和附睾组织，拍照和称量，进行统计学分析；同时对睾丸组织进行rna抽提，用于rt-pcr验证kif6的表达水平。结果如图9所示，kif6
mut/mut
雄鼠中未能检测到kif6基因的表达；如图10所示，与kif6
wt/wt
雄鼠和kif6
wt/mut
雄鼠相比，大部分突变鼠的生长发育(体征和体重)未见明显异常，仅有20％(2/10)的突变鼠表现出脑积水表型。如图11所示，kif6
mut/mut
雄鼠睾丸和附睾大小未见明显异常。
[0159]
(3)精子活动力分析：应用casa(computer-aided sperm analysis，计算机辅助精子分析)摄像系统，分别取8～10周大的小鼠附睾内精子，比较kif6
mut/mut
雄鼠和kif6
wt/mut
雄鼠附睾精子的运动能力，统计分析kif6
mut/mut
鼠附睾精子的数量、活动力及运动轨迹是否异常。
[0160]
结果如图12所示，与kif6
wt/mut
雄鼠相比，kif6
mut/mut
雄鼠附睾精子数目明显减少(a)；且kif6
mut/mut
雄鼠附睾中前向运动的精子比例(b)、曲线运动速度(c)、直线运动速度(d)、平均运动速度(e)、平均摆动振幅(f)、平均线性运动的精子比例(g)较kif6
wt/mut
雄鼠明显降低，而静止的精子数量(h)较kif6
wt/mut
雄鼠明显增加。
[0161]
上述结果表明kif6参与了精子运动的调节；本技术构建的kif6突变小鼠，能够用于进一步探究kif6缺陷导致精子发生障碍的分子机制及携带该基因缺陷患者的治疗策略。
[0162]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0163]
以上所述实施例仅表达了本技术的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来
说，在不脱离本技术构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本技术的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

技术特征：
1.一种雄性不育动物模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法通过crispr/cas9系统构建模拟人kif6 c.1325_1326del突变的动物模型。2.根据权利要求1所述的雄性不育动物模型的构建方法，其特征在于，用于制备所述雄性不育动物模型的动物为小鼠；所述构建方法通过敲除小鼠kif6基因的第13号外显子和第14号外显子构建所述雄性不育动物模型。3.根据权利要求2所述的雄性不育动物模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：针对小鼠kif6基因的第13号外显子上游和第14号外显子下游分别设计第一sgrna识别片段和第二sgrna识别片段；将所述第一sgrna、所述第二sgrna和cas9 mrna转入小鼠受精卵内；将所述受精卵移植到代孕雌鼠体内，产出f0代；及将所述f0代与野生型进行交配，获得f1代杂合子，将f1代杂合子进行自交，获得f2代纯合子突变小鼠。4.根据权利要求3所述的雄性不育动物模型的构建方法，其特征在于，所述第一sgrna识别片段的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述第二sgrna识别片段的核苷酸序列如seq id no.2所示。5.根据权利要求3所述的雄性不育动物模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法还包括如下步骤：合成含有所述第一sgrna识别片段的第一双链dna和含有所述第二sgrna识别片段的第二双链dna；构建含有所述第一双链dna的第一表达载体和含有所述第二双链dna的第二表达载体；提取所述第一表达载体和所述第二表达载体的dna；及以所述第一表达载体和所述第二表达载体的dna作为转录模板，获得所述第一sgrna的mrna和所述第二sgrna的mrna。6.根据权利要求5所述的雄性不育动物模型的构建方法，其特征在于，合成所述第一双链dna和所述第二双链dna的步骤包括：在所述第一sgrna识别片段的5’端加上粘性末端序列，形成核苷酸序列如seq id no.3所示的片段；在所述第一sgrna识别片段的互补序列的两端加上黏性末端序列，形成核苷酸序列如seq id no.4所示的片段；对带有粘性末端的第一sgrna及其带有粘性末端的互补序列进行退火处理，形成第一双链dna；在所述第二sgrna识别片段的5’端加上粘性末端序列，形成核苷酸序列如seq id no.5所示的片段；在所述第二sgrna识别片段的互补序列的两端加上黏性末端序列，形成核苷酸序列如seq id no.6所示的片段；对带有粘性末端的第二sgrna及其带有粘性末端的互补序列进行退火处理，形成第二双链dna。7.根据权利要求3～6任一项所述的雄性不育动物模型的构建方法，其特征在于，通过如下步骤合成所述cas9 mrna：提供线性化的cas9表达载体作为转录模板；使用核苷酸序列如seq id no.7～8所示的引物对进行体外转录，合成cas9mrna。8.根据权利要求3～6任一项所述的雄性不育动物模型的构建方法，其特征在于，所述
构建方法还包括如下步骤：使用核苷酸序列如seq id no.9～10所示的引物对鉴定f1代杂合子的基因型。9.根据权利要求3～6任一项所述的雄性不育动物模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法还包括如下步骤：使用核苷酸序列如seq id no.9～12所示的引物对鉴定f2代纯合子的基因型。10.采用权利要求1～9任一项所述的雄性不育动物模型的构建方法构建的雄性不育动物模型在筛选治疗男性不育相关疾病的药物中的应用。

技术总结
本申请提供了一种雄性不育动物模型的构建方法和应用。所述构建方法通过CRISPR/Cas9系统构建模拟人KIF6c.1325_1326del突变的动物模型。采用该方法构建的雄性不育动物模型表现出精子形态和运动力明显异常，能够用于研究KIF6缺陷导致精子发生障碍的分子机制、并为携带该基因缺陷的患者提供临床治疗思路和策略。带该基因缺陷的患者提供临床治疗思路和策略。带该基因缺陷的患者提供临床治疗思路和策略。


技术研发人员：谢春波 谭跃球 涂超峰 何文斌 易思兵 蒙岚岚 谭琛 程德华
受保护的技术使用者：湖南光琇高新生命科技有限公司
技术研发日：2023.06.19
技术公布日：2023/9/22