病毒富集与保存方法

1.本发明涉及病毒富集技术，具体地说，涉及病毒富集与保存方法。


背景技术：

2.近些年来，由病毒感染引发的生物安全事件或公共安全事件已成为各国关注的热点。特别在环境中，如空气和水体中，病毒浓度极低，远低于临床病料中的感染量，但空气和水等介质又是大多数传染性病毒性疾病的传播媒介，如何高效、准确并客观的对环境中的病毒进行实时监测就显得格外重要。快速、准确、高效、经济和简便的病毒富集与检测方法是预警和防控病毒性疾病暴发的先决条件。
3.即时检测(point-of-care testing)，是现场采样、即刻分析、快速报告的一种新检测方法。poct主要包括免疫层析技术，生物和化学传感器技术，微流控技术，生物芯片技术和干化学技术，目前基于纸上定量检测生物分子的方法主要是电化学方法和光学方法(比色法、荧光法等)，虽然这些方法灵敏度高，重复性好，已经被广泛用于化学分析领域，但是，这些方法需要复杂昂贵的仪器设备，专业的技术人员操作，这些复杂的要求不利于poct的现代化发展。近几年来，poct技术得到了迅速的发展，目前已经被应用于所有的检测领域，而最简单的分析方法是干化学技术，该技术通过将试剂滴在载体上进干燥后，检测样品通过滴加或者浸泡的方式与载体上的分析试剂进行化学反应，呈现不同的颜色，即可通过裸眼检测。
4.目前对已知或未知病毒的分离与鉴定，以及环境病毒学研究中，仍然没有一种单独可行的方法能简便、高效地富集处理各种类型的病毒样本。常用的超速离心法容易对囊膜病毒表面糖蛋白造成破坏，且人为加入有机化合物(蔗糖)；聚乙二醇等方法则引入化学试剂等额外物质。
5.咖啡环效应(coffee-ring effect)，是指当一滴咖啡或者茶滴落桌面时，其液滴在挥发后，液滴中的颗粒物质就会在桌面上留下一个被染色的环状斑块，并且环状斑块的颜色也是不均匀的，其边缘颜色较深，内部颜色较浅的一种现象。其他一些溶液，比如牛奶、红酒中也存在这种咖啡环效应，产生这种现象主要的原因是由于液滴边缘蒸发速率超过中心蒸发速率，使液滴中的粒子由中心向周围边缘扩散，颗粒物沉积在固液接触面的边沿(三相接触线)。当液体完全蒸发后，在基底上形成一个环形的图案。由于咖啡环效应独特的性质，已经被广泛用于纳米组装、样品富集以及喷墨打印等各个方面。
6.常见的病毒富集和纯化的方法包括：1)聚乙二醇(peg)法：简单来说，用0.22μm的微孔滤膜对经初步预处理后得到50ml悬液进行过滤，收集过滤液并加入终浓度分别为10％和0.6％的peg 8000和nacl，于避光条件下4℃孵育6h左右。接着在低温条件下8000g离心20min以沉淀peg和病毒颗粒，弃上清并用适量的特制的sm缓冲液重悬沉淀样物质，随即加入一定浓度的kcl溶液后置冰上孵育20min，以使晶状病毒粒子与peg分子分离。最后于4℃12000g离心10min所得上清液即为高浓度的病毒粒子浓缩液。该方法处理后的浓缩液背景物质较多，可能是因为peg未能完全与病毒粒子分离，在病毒粒子浓缩液中有残留造成的。
2)带负电荷的ha膜法：通过引入盐离子(常用mgcl2)或者将待测的病毒悬液进行酸化处理使病毒粒子带上正电荷，将膜孔径为0.45μm，直径为47mm的ha膜置于真空过滤瓶上，对加有mgcl2样品的病毒悬液进行过滤，促使病毒粒子吸附到ha滤膜表面，再用一定浓度的硫酸溶液对吸附了病毒粒子的ha膜进行润洗除去阳离子后，将此膜放入装有适量氢氧化钠溶液的平皿中，60rpm低速润洗10min，用50μl浓度为50mm的硫酸和100x的tris-edta中和膜ph值，最后4℃1500g离心10min获得终体积约1ml的病毒浓缩液。lee等(lee,c.s.,c.lee,j.marion,q.wang,l.saif,and j.lee.2014.occurrence of human enteric viruses at freshwater beaches during swimming season and its link to water inflow.sci total environ 472:757-766)用ha滤膜法对65份淡水样品进行浓缩富集，检测到了较高的人腺病毒(40％)和肠道病毒(17％)。相较于其他的病毒富集方法，ha滤膜法富集病毒往往更有利于后续的病毒形态特征的直接检测。3)常用病毒浓缩富集处理方法是超速离心法：在离心前先用孔径为0.22μm的滤膜过滤病毒悬液，仅用以分离病毒颗粒，随即制备浓度分别为25％和70％的蔗糖溶液，先在洁净的离心管内加入1ml的70％蔗糖溶液，再加入1ml的25％蔗糖溶液，然后加入过滤液，封闭离心管并于4℃ 4000g离心3h。回收位于25％～75％相位之间的液体，弃上清，用1ml的sm缓冲液重悬沉淀即为病毒浓缩液。超速离心法富集处理后的病毒悬液中，丰富度最高。
7.人体的血液或唾液中包含大量的微米或纳米尺度的分子或生物微粒，可以利用咖啡环效应将它们沉积下来并利用相关的生物检测技术进行分析和定量。这对于偏远地区的即时检测，廉价且易于获取的医疗装置将对相关的医疗检测有很大帮助。在病毒学科的产、学、研诸多方面，具有重要意义。


技术实现要素：

8.本发明的目的是提供一种病毒富集与保存方法。
9.本发明构思如下：发明人基于含有病毒液滴蒸发过程中的咖啡环效应，提出一种快速简便的富集纯化方法，可为多种类病毒的检测提供新方法。咖啡环效应是一种生活中常见的现象，由于蒸发过程中液滴边缘蒸发速率超过中心蒸发速率，使粒子向液滴周围边缘扩散、最终形成环形图案。通过开展纳米级粒子动力学与病毒学交叉研究，以用表达绿色荧光蛋白(vsv-gfp)的重组水泡性口炎病毒(vsv)、单纯疱疹病毒1型(hsv-1-gfp)，以及新城疫病毒(ndv-gfp)为研究对象。首次证明病毒在不同相对湿度的蒸发过程中，绝大多数分布于咖啡环位置，其中低湿度效果最佳，并在此基础上提出了病毒富集纯化的新方法。众所周知，病毒是纳米级的生物分子，符合咖啡环形成的条件，利用咖啡环效应可以很好地将这些散在的病毒粒子在体外进行富集，再对其进行检测(观察颜色反应、咖啡环大小等)，同时也符合检测方法对快捷、便利的要求。
10.为了实现本发明目的，本发明提供病毒富集与保存方法，包括以下步骤：
11.(1)对于环境残迹中的病毒样品，用棉拭子沾少量病毒转运培养基进行反复擦拭，或者，用棉拭子蘸取含病毒的液体样本；然后将棉拭子放入预冷的盛有病毒转运培养基的ep管中，旋转数次使病毒脱落；
12.(2)使用同一支棉拭子继续擦拭或蘸取病毒，再将棉拭子放入上述预冷的盛有病毒转运培养基的ep管中，旋转数次使病毒脱落；
13.(3)重复步骤(2)2～3次，使病毒被悉数回收；最后折断棉拭子，涡旋ep管使病毒从棉拭子脱落到培养基中；
14.(4)将病毒转运培养基中的病毒，吸取5-50μl加于疏水玻片表面，使液滴在室温(18℃～22℃)条件下自然蒸发(必要时可以在生物安全柜中操作)，肉眼观测干燥时(一般几分钟至几十分钟)，立刻用消毒针头或细胞刀分离咖啡环区域(此时很容易剥离)，并用镊子夹取干燥后咖啡环残迹，进行下游试验(如细胞培养增殖或测定病毒滴度)。
15.本发明中，病毒转运培养基母液的制备方法为：将mgcl2·
7h2o 0.004g、cacl2·
h2o 0.013g、nahco
3 0.042g、0.2m kh2po
4 0.77ml、0.2m k2hpo
4 1.23ml、nh4cl 0.011g、kscn 0.019g、(nh2)2co 0.012g、nacl 0.088g、kcl 0.10g、粘蛋白0.3g和dmem液0.1ml混合，用双蒸水定容至100ml，100℃煮沸10分钟，冷却后即为母液。使用时母液用双蒸水按1:9体积比稀释即得病毒转运培养基。
16.优选地，液滴在20-35％湿度(优选20％湿度)条件下蒸发。
17.本发明中，疏水玻片的制作方法包括：在玻片表面均匀喷洒一层rain-x疏水剂，干燥即得。
18.前述的方法，ep管预先置于冰上。
19.本方法适用于多种病毒等纳米级病原体，如水泡性口炎病毒(vsv)；单纯疱疹病毒，如1型(hsv-1)；新城疫病毒(ndv)；人冠状病毒hcov-oc43等球形病毒。不受dna病毒或rna病毒的限制，以及病毒有无囊膜的限制，同时不限于上述病毒。
20.借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
21.(一)采用本方法的病毒初步回收率为34.3％，耗时1小时以内，实验室成本约1.5元/样；超速离心法虽回收率较高为62.5％，但耗时长，至少需要6小时，对仪器要求高。
22.(二)经过反复对比与测试，本发明采用基质材料为疏水性80％的玻片。
23.(三)病毒作为纳米级病原体，本方法可用于较广谱种类的病毒样品的富集纯化，为已知或未知病毒的鉴定、分析与防治措施的进一步确定奠定基础，对于更好地了解感染性疾病、加强食源性疾病的监测及保障公共卫生安全具有重要意义。
24.(四)本发明采用自制培养基，对于维持病毒活性效果明显，常温条件下16小时内病毒不会失活。
25.(五)通过咖啡环效应进行病毒富集，不需要复杂的实验室仪器，且操作简单，快速价廉，用于现场/环境病毒样品收集与检测优势明显。
26.(六)相较其他富集方法，本方法利用最常见的液滴蒸发过程，对病毒粒子作用时间短、破坏力小，对操作人员技术要求不高。
27.(七)本方法可用于分离未知病毒、多种病毒混合感染，用于环境监测很有前途。此外，由于杂质和盐份少量存在于咖啡环区域，因此可以达到病毒纯化的效果。
附图说明
28.图1为本发明较佳实施例中不同疏水载玻片上液滴动力学分析。
29.图2为本发明较佳实施例中不同疏水载玻片的病毒活性(2小时以内)。
30.图3为本发明较佳实施例中不同材料基质、不同湿度条件下的病毒活性。
31.图4为本发明较佳实施例中使用不同溶液、不同湿度条件的病毒失活分析(16小时
以内)。
32.图5为本发明较佳实施例中病毒和荧光标记蛋白(溶菌酶)在液滴中的分布动态。
33.图6为本发明较佳实施例中不同病毒在液滴干燥后的分布定位。
34.图7为本发明较佳实施例中sem电镜确定病毒的分布细节。
35.图8为本发明较佳实施例中液滴干燥残留物咖啡环中分离病毒的效果。***表示不同处理组之间的差异具有统计学意义，p《0.001。ns表示无统计学差异。
36.图9为本发明较佳实施例中人冠状病毒hcov-oc43的富集方法。
37.其中，1为全液滴残迹，2为非咖啡环部分，3为咖啡环回收病毒。
具体实施方式
38.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
39.本发明以表达绿色荧光蛋白(vsv-gfp)的重组水泡性口炎病毒(vsv)、单纯疱疹病毒1型(hsv-1-gfp)以及新城疫病毒(ndv-gfp)为研究对象。使用的vsv病毒毒株为indiana标准株；ndv毒株为lasota；hsv-1为标准毒株f。这三种病毒有不同的传播途径：hsv-1主要通过直接和间接接触传播，新城疫病毒主要通过吸入气溶胶传播或通过结膜黏膜进入人体，vsv可通过任何一种途径传播。
40.一、以下实施例中涉及的常规试验：
41.1、细胞的制备
42.进行hep-2和vero细胞传代时使用含有5％胎牛血清和100u青链霉素的dmem培养液，维持液用含有2％胎牛血清和100u青链霉素的dmem培养液。hsv-1与ndv感染hep-2细胞，vsv感染vero细胞。此外，细胞培养液购自北京迈晨公司，产品目录号为cm15019。
43.2、病毒的增殖
44.按照细胞瓶培养液1/10的量接种病毒原液，待细胞病变(如ndv形成大合胞体)达75％(一般为48小时)采用反复冻融法收获病毒，即将细胞瓶放入-20℃冻存2小时后放置室温至部分融化，此时平摇细胞瓶使贴壁细胞脱壁，再次放入-20℃冻存，如此反复3次，使病毒从细胞中释放出来，分别于-20℃和-70℃冻存。
45.3、病毒效价滴度的测定方法
46.细胞病变(cytopathic effect，cpe)为致细胞病变作用，指病毒对组织培养细胞侵染后产生的细胞变性，利用此种病变效应可进行病毒定量。病毒感染形成细胞病变常见合胞体(即多个细胞聚集一起形成多核的大细胞)与噬斑(细胞脱落形成空斑)两种。病变融合率为病变细胞占所有细胞的比率。
47.荧光实验：病毒(vsv-gfp)或对照蛋白(rbitc-溶菌酶)，使用移液器吸取2-10μl体积的液滴置于三个不同的接触角的玻璃基板表面，并设置三个重复，再置于不用的湿度环境(相对湿度为20％、50％、70％、90％)中。分别于干燥后，放置于荧光显微镜下，观察病毒分布情况。
48.tcid
50
计算方法：制备96孔板单层细胞，将病毒做系列稀释，横向接种单层细胞板，每稀释度重复3孔，每日观察细胞病变，记录高于50和低于50％病变孔的病毒稀释度，计算比距，获得tcid
50
结果。计算公式为：(高于50％的病变率-50％)/(高于50％病变率-小于
50％病变率)＝比距；比距与接近50％病变率的病毒的稀释度的指数相加，即得指数。例如，比色计算或显微镜观察病毒的tcid
50
在10-7
～10-8
之间，那么，指数-8与比距相加，获得新的指数，即为tcid
50
的指数。
49.二、湿度控制系统的设计，基板以及相关参数
50.1、环境湿度的控制：按照相应的条件准备用于控制湿度的饱和盐溶液，方法如下：加入足量的盐至去离子水中，待盐不再溶解，可以多加一些盐保证处于过饱和状态。将licl、mgcl2、mg(no3)2、nacl、kcl和kno3等不同盐类的过饱和水溶液置于封闭玻璃容器中，室温下实现了湿度控制，相对湿度分别为20％、50％、70％和90％。相对湿度共分为20％、50％、70％和90％四组(温度由空调控制，室温降至22℃后，再进行实验)，相对湿度20％由硅胶干燥剂控制，该干燥剂在干燥状态显示蓝色，吸取水分后变成透明，深度吸水状态显示粉色(实验过程中每天都要使用干燥剂，100粒左右，过夜后原本盒子内20％湿度会变成30％，全部倒出来换上新的干燥剂即可)。秋冬季北京室内相对湿度约20-30％，6-7月份室内湿度约50％左右，在普通亚克力材料制成透明盒(30cm长
×
20cm宽
×
30cm高)内，侧面留活动门，根据病原体要求选择是否在生物安全柜内进行。在湿度控制盒内稍加少量湿度再将玻片放置于盒内蒸发湿度在70％。90％湿度由对称摆放装满双蒸水的8个小圆柱体罐子来维持，高度与直径为1cm左右，需要一段时间的放置后湿度才会上升至90％，一旦到达90％后，只要不打开盖子，每日实验前稍微补充小水罐中的水，湿度会一直维持稳定。
51.2、基板的选择：目前使用过的基板包括铜、亚克力、玻片(亲水、疏水、超疏水)、铝、不锈钢、云母、聚四氟乙烯。基板处理：将疏水剂喷洒到基板(玻片)上，使用一次性棉拭子均匀的涂抹开，将其置于生物安全柜中，紫外下照射30min后使用。
52.3、接触角的处理：亲水，选择玻片有磨砂层的一面做为亲水基板表面，不作处理(50个液滴需要3块玻片，每个液滴的直径较宽)；疏水，选择玻片有磨砂层的一面，喷洒rain-x疏水剂(rain-x original glass water repellent trigger)后使用一次性拭子将疏水剂涂抹均匀；超疏水，选择玻片有磨砂层的一面，将超疏水涂层于5cm高度喷洒数次，获得均匀的超疏水界面，竖立放着等待干燥后使用(涂层是由超疏水颗粒，即盛创达类neverwet ultra-ever dry超级干纳米超疏水涂料材料，购自广东佛山盛创达化工有限公司)干燥后形成的致密层，肉眼几乎不可见，但是用拭子回收的时候，会被擦拭掉落，且由于是超疏水性质，比较难回收，玻片竖直时下部的超疏水力很强远远大于重力，无法回收时擦拭次数相对疏水界面要多些次数使得病毒能尽可能的回收)。
53.4、自制的病毒转运培养基：按表1配制病毒转运培养基，用双蒸水定容至100ml，于ep管中，100℃金属浴加热10min(加热灭活粘蛋白)，置于4℃冷却后备用，使用时母液用双蒸水按1:9(v/v)稀释。加热后的原液于4℃冰箱可保存至3个月。
54.表1病毒转运培养基配方
55.mgcl2·
7h2o0.004g0.2m k2hpo41.23mlnacl0.088gcacl2·
h2o0.013gnh4cl0.011gkcl0.10gnahco30.042gkscn0.019g商品化粘蛋白0.3g0.2m kh2po40.77ml(nh2)2co0.012gdmem液0.1ml
56.粘蛋白可以购自上海源叶生物科技有限公司，货号84195-52-8。
57.三、咖啡环法富集纯化vsv病毒及回收率测算
58.1、病毒的扩繁与滴度的测定：病毒原始滴度1.5
×
106tcid
50
/ml。vsv-gfp在培养溶液中稀释为1:10，携带病毒的液滴体积为100μl，至少3个重复共9个样品。液滴沉积在疏水玻璃表面，在环境控制室内培养不同的时间。
59.2、液滴干燥后，将干燥残留物、用针尖分离的咖啡环、及其咖啡环剥离后的剩余部分，这3种不同的组分，分别悬浮于自制的病毒转运培养基中。
60.3、1.5ml ep管中放入500μl培养液，置于冰上。用一次性棉签吸掉盖玻片上的液滴，置于ep管中，多次旋转分离病毒。用同样的棉签擦拭盖玻片上剩余的病毒。这个过程重复了三次，以确保尽可能地收集病毒。将棉签折断置于ep管中，旋转以将培养液中的病毒与棉签分离。采用0.22μm滤芯去除杂质。
61.4、滤过病毒采用细胞感染性试验在vero细胞进行病毒滴度试验，确定病毒载量(tcid
50
/ml)。
62.5、结果发现，整个干燥残留物所测病毒滴度、针尖分离的咖啡环所测病毒滴度、剩余部分所测病毒滴度，分别为10
4.135
、10
3.67
、0。
[0063][0064]
按上式计算得到病毒回收率为34.3％。
[0065]
四、超速离心法纯化vsv病毒及回收率计算
[0066]
1、病毒的扩繁，准备20个t105细胞培养瓶，将vero-e6细胞铺满细胞瓶，按照0.1moi接毒，24h后收集细胞瓶，放置于-80℃冰箱冻存；
[0067]
2、将收取细胞瓶于-80℃冰箱反复冻融3次后，收集病毒液混合物，在4℃3000r/min离心30min，除去细胞碎片，收集上曾培养基，使用透析袋将上清透析，待透析袋中剩余3-5ml培养基时停止透析，将透析袋中的上清收集至细胞瓶中，4℃保存；
[0068]
3、使用pbs将离心后的沉淀重悬，至于冰上进行超声裂解(超声3s，停3s，超声破碎3min)，3000r/min离心1h，保留上清；
[0069]
4、将上述两部分上清混合在一起，用超速离心机(4℃，角速度35000r/min)，离心3h，弃去上清，用少量pbs充分悬浮沉淀，即得粗提病毒18-20ml；
[0070]
5、将高压好的蔗糖按照浓度由低至高依次加入(采用长注射器头深入管底部依次加入20％、35％、55％浓度的蔗糖浴液2ml)，最后加入2-3ml粗提病毒液，4℃，30000r/min离心1.5h；
[0071]
6、取出离心后的离心管，其中有白色絮状的环为病毒液层，用注射器小心吸出所有的病毒液，置于离心管中，加入ste溶液，并将离心管填满，4℃，30000r/min，离心2h去糖；
[0072]
7、再次使用ste溶液将沉淀重悬，加入新的离心管中，并将离心管填满，4℃，30000r/min离心2h去糖；
[0073]
8、使用pbs缓冲液稀释沉淀物，分装于1.5ml离心管中，保存于-80℃冰箱，并测定病毒tcid
50
；
[0074]
9、纯化后病毒的定量与回收效率的计算：
[0075]
纯化前扩繁获得的病毒滴度约为1.6
×
109tcid
50
/ml，共收集得到700ml病毒原液，经超速离心后收集得到病毒液700μl，测得病毒滴度≥10
12
tcid
50
/ml。
[0076][0077]
按上式计算得到病毒回收率为62.5％。
[0078]
实施例1液滴在不同疏水玻璃载玻片、不同湿度下的干燥残留物形态
[0079]
将病毒vsv-gfp加入到10μl水溶液中，稀释度为1:10(v/v)，并充分涡旋混匀。分别吸取2μl液体，滴加在处理过的不同基板上(图1，a为亲水；b为超疏水；c为疏水基板)，置于20％、50％、70％、90％湿度环境。在不同的相对湿度下、不同接触面条件，各阶段的蒸发时间是不同的(高湿度、超疏水蒸发时间最久)。自然干燥后，分别使用光学显微镜(上)以及荧光显微镜(下)进行观察并拍照。从上方拍摄的图像，从下方照明。图1中d为1、3、5、10μl液滴在不同湿度下干燥后的形态。
[0080]
从图1中a，b，c结果可见，1)所有载玻片基质材料均形成咖啡环效应，而病毒荧光聚集于咖啡环；2)随着相对湿度的增加，咖啡环的宽度作为液滴残留总半径的一部分增加；3)相对于亲水与超疏水基质，疏水基质的咖啡环形态最均匀，荧光强度相对强，利于观察。从图1中d可见，液滴大小不影响咖啡环效应。
[0081]
因此本发明采用疏水玻片进行含病毒样品的富集纯化。
[0082]
实施例2玻璃材质不同疏水性处理、不同湿度下的病毒活性
[0083]
将病毒vsv-gfp加入到水溶液中，使得病毒的终稀释度为1:10，并充分涡旋混匀。使用移液器轻轻的从液面以下吸取避免气泡产生，在各种处理过的基板上滴加2μl大小的混匀液滴50滴，总计100μl，并设置3个重复。设置20％、50％、70％、90％湿度环境，将基板置入其中。分别于不同的时间点，以50个液滴中最后一个液滴被滴加在基板上的时间为0min，以此类推)。使用同一支棉拭子擦拭基板上残留的病毒，该步骤重复3次以保证病毒被悉数回收。折断棉拭子，涡旋ep管使得病毒脱落在培养基中并充分混匀，再使用0.22μm滤器过滤以去除杂质，过滤后的病毒进行tcid
50
的测定。
[0084]
结果发现，室内湿度(约50％)条件下，病毒在同样基板上(玻片)，液滴不同接触角导致病毒活性的差异(图2a)。在同样的时间点，亲水基质的病毒的活性最低，超疏水次之，而疏水基质表面的病毒活性维持的最好。即在亲水界面上，病毒下降的趋势最明显。
[0085]
在不同湿度下的实验结果如下：低湿度条件下，因为接触角的变化而导致的病毒滴度的变化不是很明显。但是在不同的接触角下，病毒活性与湿度之间的关系都存在u型关系(图2b)。不同接触角情况下病毒滴度都存在u型关系曲线，同在2h时，亲水界面的u型曲线已经显示的非常明显了，而疏水界面并无变化(图2b)，进一步说明了亲水界面的滴度下降的比疏水和超疏水界面的快，特别是中等湿度情况。
[0086]
因此本发明采用疏水玻片进行含病毒样品的富集纯化。
[0087]
实施例3液滴在不同基质、不同湿度下的病毒活性
[0088]
分别考察了常见的不同材质，进行了病毒收集与活力试验。图3a结果表明，1)高湿度条件所有基质上获取的病毒活力相对最强，低湿度次之，中等湿度的病毒存活能力最弱；2)中等湿度下，相似接触角的不同材料病毒存活情况并不相同(如不锈钢和铝)；3)相对而言，接触角最小的云母(20-30
°
)，病毒活性最弱(50％相对湿度下滴度降低至检测不到水平)。
[0089]
将含病毒的液滴在不同基质、不同湿度下，所收集的残留物进行病毒活性汇总(图
3b)。结果发现，使用疏水玻璃材质(80
°
接触角)进行对含病毒液滴富集的效果最好；在2小时内不同湿度条件对病毒滴度几乎没有影响。
[0090]
因此本发明采用疏水玻片、相对较低湿度，进行含病毒样品的富集纯化。
[0091]
实施例4病毒在不同湿度下的活性分析及最佳存活条件
[0092]
将病毒vsv-gfp加入到水溶液中，终稀释度为1:10，并充分涡旋混匀。使用移液器轻轻的从液面以下吸取避免气泡产生，在疏水处理过的玻片基板上(80
°
接触角，下同)，滴加2μl大小的混匀液滴50滴，总计100μl，并设置3个重复。设置20％、50％、90％湿度环境，将基板置入其中。分别于不同的时间点(0、10、30、45、60、120、240、480、960min，以50个液滴中最后一个液滴被滴加在基板上的时间为0min，以此类推)收集基板表面的病毒进行病毒活性的检测。干燥残迹回收的具体方法为：1.5ml ep管中加入500μl病毒转运培养基，置于冰上。使用一次性棉拭子吸收基板上未干燥的液滴，放入ep管中旋转数次让病毒脱落。再使用同一支棉拭子擦拭基板上残留的病毒，该步骤重复3次以保证病毒被悉数回收。折断棉拭子，涡旋ep管使得病毒脱落在培养基中并充分混匀，再使用0.22μm滤器过滤以去除杂质，病毒活性进行tcid
50
测定。过程示意图见图4d。
[0093]
图4a与4b结果如下：1)图4a与4b为相同数据，采用不同绘图方式，纵坐标相同，右图进行了贝叶斯多元线性统计，更利于观测u形曲线—即中等湿度相较于低湿度与高湿度，对病毒的破坏更明显。2)60分钟内全部液滴接近干燥，60-960分钟为过度干燥时间，可见随着干燥时间延长，湿度对病毒的灭活效果更明显。
[0094]
此外，图4a与4b使用水溶液，图4c中溶液1使用自制的病毒转运培养基，溶液2、溶液3(其中，溶液3的配方与表1相同，区别仅在于未进行100℃金属浴加热；溶液2的配方与表1区别在于粘蛋白的用量为0.03g，其余成分用量相同，且未进行100℃金属浴加热)，未处理组相应于图4b的960分钟干燥样品。结果可见，使用自制的病毒转运培养基，进行病毒干燥残迹的回收，效果最好—即使玻片干燥16小时，任何湿度下，病毒均没有发生明显的失活。
[0095]
因此本发明采用疏水玻片、自制的病毒转运培养基进行含病毒样品的富集纯化。
[0096]
实施例5病毒在液滴干燥过程中的动态分布
[0097]
将携带绿色荧光标签(gfp)的病毒vsv-gfp(图5a)，以及fitc标记的对照蛋白(溶菌酶，图5b)，在设置20％湿度下环境，在疏水的基板(玻片)上滴加50μl大小的液滴，使用尼康正置，观察液滴最终的干燥残留中病毒的动态分布情况。每个图最右侧，液滴刚刚干燥的残迹全景图。
[0098]
研究发现，病毒或蛋白的蒸发动力趋势相近，40分钟均开始呈现咖啡环，70分钟表面形态与荧光强度基本固定。研究结果显示，咖啡环形成主要发生在液滴干燥晚期，完全干燥后一段时间(2小时内)荧光没有淬灭。可见根据咖啡环效应富集病毒，对病毒失活影响小。
[0099]
实施例6不同病毒在液滴干燥残留物中的位置分布
[0100]
将表达绿色荧光蛋白(vsv-gfp)的10
7.0
tcid
50
/ml、表达hsv-1-gfp的10
5.2
tcid
50
/ml和表达ndv-gfp的10
3.5
tcid
50
/ml的重组病毒5μl，滴于载玻片上。这些液滴被放置在一个环境控制的室中，设置20％、50％、70％、90％湿度环境，直到蒸发完成。使用荧光显微镜观察干燥残留中病毒的重新分布情况。
[0101]
图6a为不同显微镜下vsv-gfp颗粒在液滴残基中的分布。左侧为亮视野下，中间为
表达绿色荧光蛋白的重组病毒的荧光图像，右侧为两者的合并图像。图6b和c，液滴残基中hsv-1-gfp(b)和ndv-gfp(c)颗粒的分布。
[0102]
结果可见，与vsv粒子相似，所测试的病毒粒子主要在咖啡环中被发现，咖啡环的宽度随相对湿度增大而增大。
[0103]
因此采用疏水玻片、自制的病毒转运培养基，可进行多种病毒样品的富集纯化。
[0104]
实施例7sem电镜观察病毒在液滴干燥残留物中的分布
[0105]
将表达绿色荧光蛋白(vsv-gfp)的10
7.0
tcid
50
/ml的重组病毒2μl，滴于载玻片上。这些液滴被放置在一个环境控制的室中，设置20％、50％、70％、90％湿度环境，直到蒸发完成(60分钟以内)。液滴蒸发后在4个不同区域进行扫描电子显微镜sem拍摄图像，以进一步确定干燥残留中病毒的分布情况。图7a为干燥残迹人为划分4个区域(其中区域1-3是咖啡环区)的模式图；图7b为纯病毒的sem图像；图7c为不同相对湿度下，残留物4个区域的sem图分析。
[0106]
从图7可以看出，观察到不同的形态。在所有相对湿度下，均可以看到病毒聚集于咖啡环中的区域2。在任何湿度下，盐分倾向于分布在区域4。
[0107]
因此本发明分离区域1-3的部分(即整个咖啡环区)进行病毒富集分析，在试验条件充分时分离区域2效果最好，此方法还可以较容易地分离各种溶液中存在的盐分。
[0108]
实施例8根据咖啡环效应分离富集病毒的效果分析
[0109]
vsv-gfp病毒液滴干燥残留物的分离：在已处理的疏水玻片基板上，滴加10μl的含病毒液滴，置于20％湿度环境，并设置3个重复。干燥后置于4倍光学显微镜下，使用微型针头对液滴干燥残留进行分离，以完全将咖啡环从残留物中剥离出来，并将咖啡环和剩余残留部分分别进行tcid
50
的检测。
[0110]
图8a结果显示，咖啡环1-3区域获取的病毒粒子与整个干燥残留物中的病毒粒子数量没有显著差异，1-3区域之外的剩余区并没有发现病毒粒子。进一步证明，液滴残留物中的绝大多数病毒都包含在咖啡环中。此外，将病毒用pbs稀释不同倍数，发现咖啡环的宽度变化(图8b)，但是没有发现病毒滴度差异。
[0111]
实施例9人冠状病毒hcov-oc43的富集方法
[0112]
1、hcov-oc43病毒105pfu，吸取50μl/滴，共20滴加于疏水玻片表面，在生物安全柜中，室温条件下自然蒸发，肉眼观测干燥时，立刻用消毒针头分离咖啡环区域，并用镊子夹取干燥后咖啡环残迹，进行下游试验。转运培养基中的病毒。
[0113]
2、hcov-oc43感染前24小时，将人结肠癌细胞(hct-8)接种于96孔板细胞，在含10％血清的rpmi 1640培养基中，37℃，5％co2培养。待细胞生长至70％后，移入33℃细胞培养箱，待细胞生长至80％。弃去培养液上清，用pbs洗涤细胞3次。
[0114]
3、样品在无血清培养液中稀释5倍后加入细胞中孵育2h，加入含4％血清的双倍容量培养液终止感染。
[0115]
4、放置48h后，弃去培养液上清，pbs冲洗细胞。多聚甲醛固定细胞15min，0.4％tritonx-100处理30min，然后与小鼠抗冠状病毒单克隆抗体(1:800，santa cruz)4℃孵育过夜。pbs洗3次，小鼠荧光二抗(1:800)孵育1小时，pbs洗3次。
[0116]
5、采用奥德赛红外成像系统(800-nm,li-cor)分析病毒生存能力。
[0117]
图9a结果显示细胞内western blot分析hcov-oc43活性，图9b为定量分析结果，表
明咖啡环收集的病毒滴度(图9中标记3)与全液滴残迹1.3
×
104pfu的hcov-oc43(图9中标记1)，分别为8000与13000，回收率：8000/13000＝61％。
[0118]
本发明试错空间较大，操作技术要求不高，适用于用于现场采样、即刻分析、快速报告。可结合下游的电化学和光学技术，用于病毒等纳米级病原体的现场快速、可视化检测。
[0119]
本发明提供一种病原体富集与纯化的新方法，通过咖啡环效应进行病毒富集，不需要复杂的实验室仪器，且操作简单，快速价廉，用于现场/环境病毒样品收集与检测优势明显。相较其他富集方法，该新方法利用最常见的液滴蒸发过程，对病毒粒子作用时间最短，因此具备破坏力小、操作技术要求不高等显著优点。可对已知或未知病毒的鉴定、分析与防治措施的进一步确定奠定基础，对于更好地了解感染性疾病、加强食源性疾病的监测及保障公共卫生安全具有重要的意义。
[0120]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

技术特征：
1.病毒富集与保存方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)对于环境残迹中的病毒样品，用棉拭子沾少量病毒转运培养基进行反复擦拭，或者，用棉拭子蘸取含病毒的液体样本；然后将棉拭子放入预冷的盛有病毒转运培养基的ep管中，旋转数次使病毒脱落；(2)使用同一支棉拭子继续擦拭或蘸取病毒，再将棉拭子放入上述预冷的盛有病毒转运培养基的ep管中，旋转数次使病毒脱落；(3)重复步骤(2)2～3次，使病毒被悉数回收；最后折断棉拭子，涡旋ep管使病毒从棉拭子脱落到培养基中；(4)将病毒转运培养基中的病毒，吸取5-50μl加于疏水玻片表面，使液滴在室温条件下自然蒸发，肉眼观测干燥时，立刻用消毒针头或细胞刀分离咖啡环区域，并用镊子夹取干燥后咖啡环残迹，进行下游试验；其中，病毒转运培养基母液的制备方法为：将mgcl2·
7h2o 0.004g、cacl2·
h2o 0.013g、nahco
3 0.042g、0.2m kh2po
4 0.77ml、0.2m k2hpo
4 1.23ml、nh4cl 0.011g、kscn 0.019g、(nh2)2co 0.012g、nacl 0.088g、kcl 0.10g、粘蛋白0.3g和dmem液0.1ml混合，用双蒸水定容至100ml，100℃煮沸10分钟，冷却后即为母液；使用时母液用双蒸水按1:9体积比稀释即得病毒转运培养基。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，液滴在20-35％湿度条件下蒸发。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，疏水玻片的制作方法包括：在玻片表面均匀喷洒一层rain-x疏水剂，干燥区域即得。4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，ep管预先置于冰上。5.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述方法适用于水泡性口炎病毒、单纯疱疹病毒1型、新城疫病毒、人冠状病毒hcov-oc43或其它球形病毒。

技术总结
本发明公开了病毒富集与保存方法。基于咖啡环效应进行病毒富集，不需要复杂的实验室仪器，且操作简单，快速价廉，可视化，用于现场/环境病毒样品收集与检测优势明显。相较其他富集方法，本方法利用最常见的液滴蒸发过程，对病毒粒子作用时间短，因此具备破坏力小、操作技术要求不高等显著优点。可对已知或未知病毒的鉴定、分析与防治措施的进一步确定奠定基础，对于更好地了解感染性疾病、加强食源性疾病的监测及保障公共卫生安全具有重要意义。监测及保障公共卫生安全具有重要意义。


技术研发人员：王晓佳 李复煌 王九峰 吴文学
受保护的技术使用者：中国农业大学
技术研发日：2022.03.16
技术公布日：2023/9/22