山茶花发酵物、含此的皮肤外用组成物及其应用的制作方法

1.本发明有关一种植物发酵液及其应用，特别是有关于一种具抗皮脂及淡化皱纹功效的山茶花发酵物及其制备方法及应用。


背景技术：

2.山茶(camellia japonica)花是一种观赏用的花卉，在传统医学中，也可内服煎汤，具有清肺平肝之效。然而，山茶花目前应用在护肤产品仍不多、且基本只局限于山茶花油、蜡等润泽肌肤表面或于肌肤表面形成封闭性薄膜。现有技术揭露可由山茶花萃取出超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，sod)及左旋茶胺酸(l-theanine)，但现有工艺须使用特殊设备及大量有机溶剂进行萃取，萃取后的产物又须经冷冻干燥结晶，不仅工艺步骤繁杂、活性成分较单一、萃取产物容易残留对人体有害的物质(例如有机溶剂)、产量较低等问题。
3.另外，通过细胞培养可以获得sod及左旋茶胺，然而培养干细胞的困难极大，难以量产制造时就等同于商品中的用量必然极低，使得最终产品的功效远不如预期。
4.有鉴于此，亟需改善山茶花的工艺，以扩展山茶花的应用范围。


技术实现要素：

5.因此，本发明的一态样是提供一种山茶花发酵物，其将初始体系经发酵步骤、灭菌步骤及固液分离步骤而制得，所得的无细胞上清液为山茶花发酵物，其具有抗皮脂及淡化皱纹的功效。
6.其次，本发明的另一态样是提供一种具抗皮脂功效的皮肤外用组成物，其中此皮肤外用组成物为以上述山茶花发酵物做为有效成分。
7.再者，本发明的再一态样是提供一种具淡化皱纹功效的皮肤外用组成物，其中此皮肤外用组成物为以上述山茶花发酵物做为有效成分。
8.又，本发明的又一态样是提供一种山茶花发酵物用于制备具抗皮脂功效的皮肤外用组成物的用途，其以上述山茶花发酵物做为有效成分。
9.根据本发明的上述态样，提出一种山茶花发酵物。在一实施例中，此山茶花发酵物是由初始体系经发酵步骤、灭菌步骤及固液分离步骤而制得。在此实施例中，前述初始体系可由例如山茶花、水与酵母所组成，山茶花为干燥花朵，发酵步骤可利用酵母于20℃至50℃的温度进行10小时至50小时，此酵母可例如为酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)c-lye-6，其于2021年03月16日保藏于中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (china general microbiological culture collection center，cgmcc，地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮政编码：100101)，保藏编号为cgmccno.22020，而此菌株也保藏于美国典型培养物保藏中心(american type culturecollection，atcc，地址：美国弗吉尼亚州马纳萨斯大学大道10801号，邮政编码：20110-2209)，且其保藏编号为atcc no.2367，且所得的山茶花发酵物包含0.5μg/ml至1.0μg/ml的
芦丁以及0.3mg/ml至1.0mg/ml的儿茶素类化合物。
10.在上述实施例中，前述山茶花发酵物还可选择性包含4.0mg/ml至15.0 mg/ml的粗多糖。
11.在上述实施例中，前述儿茶素类化合物可包含表没食子儿茶素、儿茶素、咖啡因、表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯以及茶黄素。
12.在上述实施例中，前述山茶花与水的重量体积比(g:ml)可例如为2～10： 100～300。
13.在上述实施例中，前述酵母的菌体浓度可例如为105菌落形成单位(colonyforming unit，cfu)/ml至108cfu/ml。
14.在上述实施例中，前述山茶花与酵母的重量体积比(g:ml)可例如为2～20： 5～10。
15.根据本发明的另一态样，提出一种具抗皮脂功效的皮肤外用组成物，其包含以上述山茶花发酵物做为有效成分。
16.根据本发明的又一态样，提供一种具淡化皱纹功效的皮肤外用组成物，其包含以上述山茶花发酵物做为有效成分。
17.根据本发明的再一态样，提供一种山茶花发酵物用于制备具抗皮脂功效的皮肤外用组成物的用途，其中此皮肤外用组成物包含以上述山茶花发酵物做为有效成分。
18.在上述实施例中，前述山茶花发酵物具淡化皱纹功效。
19.应用本发明的山茶花发酵物及其制备方法，其将由山茶花、水与特定菌株的酵母所组成的初始体系，经发酵步骤、灭菌步骤及固液分离步骤后，所得的无细胞上清液为山茶花发酵物，其具有抗皮脂及淡化皱纹的功效，可做为有效成分并用于制备各种皮肤外用组成物。
20.可以理解的是，前述的概括说明及下述的详细说明仅为例示，旨在对要求保护的发明提供进一步的解释。
附图说明
21.为让本发明的上述和其他目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，所附附图的详细说明如下：
22.图1显示芦丁(rutin)标准品的高效液相层析(hplc)图谱。
23.图2显示未发酵的山茶花水煮液的芦丁hplc图谱。
24.图3显示根据本发明一实施例的发酵后的山茶花发酵物的芦丁hplc图谱。
25.图4显示混合数种儿茶素类化合物标准品的hplc图谱。
26.图5显示未发酵的山茶花水煮液的儿茶素类化合物hplc图谱。
27.图6显示根据本发明一实施例的发酵后的山茶花发酵物的儿茶素类化合物 hplc图谱。
28.图7显示根据本发明一实施例的受试者皮肤涂抹发酵后的山茶花发酵物或未发酵的山茶花水煮液经14天后的皮肤油脂含量的直方图。
29.图8a至图8j分别显示根据本发明一实施例的受试者的皮肤在山茶花发酵物涂抹前(图8a、图8c、图8e、图8g、图8i)或连续涂抹14天后(图8b、图 8d、图8f、图8h、图8j)的纹理
collection，atcc，地址：美国弗吉尼亚州马纳萨斯大学大道10801号，邮政编码：20110-2209)，且其保藏编号为atcc no.2367。
40.在一些实施例中，进行发酵步骤前，上述酵母可选择性进行前处理，借此活化酵母，其中前处理可例如利用液态培养基进行第一液态培养步骤，以获得第一培养物。接着，将第一培养物涂抹于固态培养基上进行固态培养步骤，以获得单一菌落并纯化菌株。然后，将单一菌落接种至液态培养基以进行第二液态培养步骤，以扩增培养并获得酵母菌液，其中此酵母菌液在600nm下的光学密度(optical density，od)可例如为0.5至1.0，其细胞浓度相当于105菌落形成单位(colony forming unit，cfu)/ml至108cfu/ml。经过前处理后，酵母可处于对数期且具较佳的活性。上述液态培养基及固态培养基可使用市售产品，在一些例子中，液态培养基可例如为马铃薯葡萄糖培养液(potato dextrose broth， pdb)，而固态培养基可例如为马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar，pda)。在上述实施例中，上述第一液态培养步骤、固态培养步骤及第二液态培养步骤的温度并无特别限制，可例如20℃至50℃、或25℃至45℃抑或30℃至40℃。
41.然后，将发酵步骤后的发酵产物进行现有的灭菌步骤，可例如于121℃进行高压蒸气灭菌处理达15分钟，使酵母失活。之后，将灭菌步骤后的发酵产物进行现有的固液分离步骤，例如以4500转/分钟(rpm)的转速进行离心10分钟至 30分钟，由此所得的无细胞上清液即为山茶花发酵物。
42.在上述实施例中，所得的山茶花发酵物的外观可例如为水状液、呈半透明浅褐色，其酸碱值为ph 4.5至ph 6.8，粘度为10厘泊(cp)至15cp，可溶性固形物的含量为0.9％至2.0％，菌落总数小于50cfu/ml，且无检出致病菌。前述可溶性固形物是指山茶花发酵物中所有溶解于水的化合物的总称。补充说明的是，山茶花发酵物的剂型并无特别限制，端视实际需求而定，例如，上述水状液的山茶花发酵物经过现有脱水(dehydration)处理后，可获得固体或粉末状的山茶花发酵物；反之，固体或粉末状的山茶花发酵物经过现有复水(rehydration) 处理后，可获得水状液的山茶花发酵物。
43.在一实施例中，山茶花发酵物以0.04g(ml)/次至0.06g(ml)/次的有效剂量涂抹于前臂屈侧皮肤(面积3cm
×
3cm)经一段时间后，不引起皮肤的发炎及/或过敏等症状(例如红斑、水肿、丘疹及疱疹等)，具有低致敏性。
44.在一些例子中，山茶花发酵物具有多种活性物质，具抗皮脂及/或淡化皱纹功效，且不含有机溶剂，将含有山茶花发酵物的皮肤外用组成物经皮投予皮肤表面(例如：涂抹、贴敷等)达一段时间后，不会有一般药物常出现的过敏现象，故可做为有效成分，进而应用于制备各种皮肤外用组成物，例如医药组成物或化妆品组成物。在其他例子中，含有山茶花发酵物的皮肤外用组成物也可使用经皮以外的途径，或可选择性结合其他的有效成分。
45.此处所称的“抗皮脂功效”也称为控油功效，指将含有山茶花发酵物的皮肤外用组成物经皮投予皮肤表面(例如：涂抹、贴敷等)一段时间后，可有效控制甚至降低油脂含量。
46.此处所称的“淡化皱纹功效”指将含有山茶花发酵物的皮肤外用组成物经皮投予皮肤表面(例如：涂抹、斑贴等)一段时间后，可改善皮肤的粗糙程度，使皮肤皱纹变得较短及/或较浅，进而降低仪器测得的纹理平均值(单位：任意单位)。此处所称的“皱纹”包含皮肤细纹、动态皱纹及静态皱纹等皮肤纹理，其中皮肤细纹指较浅、较细的皮肤纹路，静态皱纹是动态表情出现时产生的明显皮肤纹路，且静态皱纹是静态皱纹不断累积而产生的固定
性皮肤纹路。皱纹的产生会增加皮肤粗糙程度，其中皮肤粗糙的程度可由纹理平均值予以量化。纹理平均值是以皮肤皱纹的数量、深浅及/或长度等数值定义，且上述数值是利用不同波长的光照射皮肤的受试区域所得的反射光谱，建构受试区域的皮肤表面形貌(surface topography)的立体模型后获得。纹理平均值越大，表示受试区域的皮肤纹理越多、越长及/或越深，即皮肤越粗糙。
47.此处所称的“活性物质”指具抗皮脂及淡化皱纹功效者，可包含但不限于芦丁(rutin，也称芸香苷)、儿茶素类化合物以及粗多糖。在一些例子中，山茶花发酵物可包含0.5μg/ml至1.0μg/ml的芦丁以及0.3mg/ml至1.0mg/ml的儿茶素类化合物，选择性还包含4.0mg/ml至15.0mg/ml的粗多糖。前述的儿茶素类化合物可包含表没食子儿茶素、儿茶素、咖啡因、表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯以及茶黄素，各成分的比例并无特别限制，然而在一些例子中，儿茶素类化合物以咖啡因的含量为较多。
48.在此说明的是，本发明需由山茶花、水与酵母所组成的初始体系，利用特定菌株的酵母进行发酵步骤、灭菌步骤及固液分离步骤后，所得的无细胞上清液为山茶花发酵物，才能发挥抗皮脂及淡化皱纹的功效。倘若选用其他品种的花朵，或以不同溶剂、不同发酵菌株、或未进行灭菌步骤及/或固液分离步骤、或改用萃取工艺，所得的山茶花产物将无法包含有效剂量的活性物质，也难以发挥上述抗皮脂及淡化皱纹功效。
49.可以理解的是，下述特定的山茶花发酵物、特定配方的初始体系、特定的发酵菌株、特定的工艺、特定的使用剂量、特定的检测方式、观点、例示及实施例仅供举例说明，并非做为本发明的限制条件。在不脱离本发明的精神和范围内，本发明的主要特征可用于各种实施例。因此本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可轻易确定本案的必要技术特征，对本发明作各种更动及润饰，以适用不同的用途及条件。
50.实施例1
51.1.1萃取原料
52.此实施例所使用的萃取原料为山茶的花朵，学名为camellia japonica l.。
53.1.2制备山茶花发酵物
54.取山茶花新鲜花朵(2.8kg)于70℃至80℃烘干1小时至6小时，以获得山茶花干燥花朵。将6g的山茶花干燥花朵于室温下加入300ml的水并混合均匀后，直接加入酿酒酵母进行发酵步骤，排除萃取步骤。
55.上述酿酒酵母为保藏于cgmcc、保藏编号cgmcc no.22020的菌株，其菌落为点状，表面边缘光滑，颜色呈乳白色而不透明，且以细胞形式单独存在。上述酿酒酵母于37℃在pdb中进行小量液态培养步骤，以获得第一菌液。接着，将第一菌液涂抹于pda上进行固态培养步骤，以获得单一菌落。然后，将单一菌落接种于pdb中，并于37℃进行大量液态培养步骤，直到其菌液于600 nm波长的光学密度为0.5至1.0，其细胞密度相当于105至108cfu/ml，以获得第二菌液。
56.将上述山茶花干燥花朵及水混合均匀后，加入10ml的含有酿酒酵母的第二菌液，得到初始体系，再于30℃下进行发酵步骤48小时，以获得山茶花发酵物。接下来，以121℃、1.1kg/cm2的水蒸气对山茶花发酵物进行灭菌步骤达 15分钟，再以4500rpm的转速、9cm的离心半径进行离心步骤20分钟，由此所得的无细胞上清液即为山茶花发酵物。另外，以山茶花水煮液做为对照组，其中山茶花水煮液未进行发酵步骤，但有进行灭菌步骤以及离心步
骤。
57.1.3分析山茶花发酵物
58.第1.2节所得的山茶花发酵物的外观为水状液、呈半透明浅褐色，其酸碱值为ph 4.5至ph 6.8，粘度为10厘泊(cp)至15cp，可溶性固形物的含量为0.9％至2.0％，菌落总数小于50cfu/ml，无致病菌检出，且活菌数小于50cfu/ml，以符合化妆品对于生物安全性的相关规定。
59.上述山茶花发酵物经过进一步成分分析后，还包含1.5mg/ml至4.0mg/ml 的蛋白质、4.0mg/ml至15.0mg/ml的粗多糖(如表1所示)、1.0mg/ml至 3.0mg/ml的总黄酮、0.4mg/ml至1.5mg/ml的总酚。由表1结果显示，相较于未发酵的山茶花水煮液，含有山茶花的初始体系经过酵母发酵后，其山茶花发酵液的粗多糖总含量显著提升约396％。
60.表1
[0061][0062]
样品处理是参考《中华人民共和国药典》(2015版第一部第3页)。简言之，取乙醇将样品的浓度稀释至10％，利用孔径0.45μm的滤膜过滤后，做为待测液备用。
[0063]
接着，上述待测液以及标准品进行高效液相层析(hplc)，以检测芦丁含量，其利用shim-pack gist c(18)层析管柱(4.6mm
×
250mm，5μm)，流动相为乙腈：甲醇：0.04％醋酸溶液＝16：8：76，流速为1ml/分钟，检测波长为360nm，进样量为10μl，柱温30℃，其结果如图1至图3所示。
[0064]
请参阅图1，其显示芦丁(rutin)标准品的高效液相层析(hplc)图谱。由图1 结果可知，芦丁标准品的出峰时间为12.227分钟，且芦丁的标准曲线如式(i)所示：
[0065]
y＝16694x+25528，r2＝0.9997
ꢀꢀꢀ
(i)。
[0066]
请参阅图2，其显示未发酵的山茶花水煮液的芦丁hplc图谱。请参阅图3，其显示根据本发明一实施例的发酵后的山茶花发酵物的芦丁hplc图谱。图2 及图3的结果根据式(i)的芦丁的标准曲线计算后，其芦丁含量如表2所示。
[0067]
表2
[0068][0069]
由表2结果可知，相较于未发酵的山茶花水煮液，含有山茶花的初始体系经过酵母发酵后，其山茶花发酵液的芦丁含量显著提升40％。
[0070]
另外，上述待测液以及标准品进行高效液相层析(hplc)，以检测儿茶素化合物的含量，其利用shim-pack gist c(18)层析管柱(4.6mm
×
250mm，5μm)。流动相a：分别将90ml乙腈，20ml冰乙酸，2ml(10mg/ml)edta二钠加入 1l容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀ph＝
3.07，溶液需经过0.45μm滤膜。流动相b：分别将800ml乙腈，20ml乙酸，2ml(10mg/ml)edta二钠加入1l 容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，将溶液利用0.45μm滤膜过滤。流速为1ml/ 分钟，检测波长为278nm，柱温35℃。梯度条件如表3所示。样品处理是参考“茶叶中茶黄素的测定-高效液相色谱法(gb/t 30483-2013)”。简言之，取稳定溶液将样品的浓度稀释至10％，利用孔径0.45μm的滤膜过滤后，做为待测液备用，其中稳定溶液为25ml edta-2na、25ml抗坏血酸溶液以及50ml乙腈，加水至500ml。相关结果如图4至图6所示。
[0071]
表3
[0072][0073]
请参阅图4，其显示混合数种儿茶素类化合物标准品的hplc图谱。图4 的儿茶素标准出峰时间则如表4所示。
[0074]
表4
[0075][0076]
由图4结果可知，各种儿茶素化合物的出峰时间不一，且其各自的标准曲线如式(ii)至式(viii)所示：
[0077]
egc：y＝2002.8x-135.7，r2＝0.9999
ꢀꢀꢀ
(ii)；
[0078]
+c：y＝5633.6x+3978.4，r2＝0.9997
ꢀꢀꢀ
(iii)；
[0079]
咖啡因：y＝23897x+24240，r2＝0.9999
ꢀꢀꢀ
(iv)；
[0080]
ec：y＝7162.4x+4996.8，r2＝0.9999
ꢀꢀꢀ
(v)；
[0081]
egcg：y＝11646x-11668，r2＝0.9992
ꢀꢀꢀ
(vi)；
[0082]
ecg：y＝11177x+7094.1，r2＝0.9999
ꢀꢀꢀ
(vii)；以及
[0083]
茶黄素：y＝17927x+6.7917，r2＝0.9997
ꢀꢀꢀ
(viii)。
[0084]
请参阅图5，其显示未发酵的山茶花水煮液的儿茶素类化合物hplc图谱。请参阅图6，其显示根据本发明一实施例的发酵后的山茶花发酵物的儿茶素类化合物hplc图谱。图5及图6的结果根据式(ii)至式(viii)的各种儿茶素化合物的标准曲线计算后，其主要的儿茶素化合物的含量如表5所示。
[0085]
表5
[0086][0087]
由表5结果显示，相较于未发酵的山茶花水煮液，含有山茶花的初始体系经过酵母发酵后，其山茶花发酵液的咖啡因含量显著提升约30％。
[0088]
实施例2
[0089]
2.1评估山茶花发酵液的抗皮脂功效
[0090]
此实施例是在受试者(5名)的前臂屈侧皮肤左右两侧设定受试区域(面积为 3cm
×
3cm)，测定样品按(2.0
±
0.1)mg/cm2的用量进行单次涂抹。先用市售皮肤光学检测仪器[例如德国ck公司生产的皮肤油脂测试仪(sebumeter)，型号sm815] 测定各测试区的初始值(样品使用前)。经过默认的时间后，利用市售皮肤光学检测仪器测定受试区域及对照区域(即空白对照)的油脂含量，其结果如图7所示。关于受试者选择与测试方法，按照下述化妆品控油功效评价方法，通过测量吸油胶带吸收皮脂后的透明度，测得皮肤表面皮脂量。
[0091]
前述化妆品控油功效评价方法是通过测量吸油胶带吸收皮脂后的透明度，测得皮肤表面皮脂量。首先，征求5名受试者，其中受试者的年龄在18岁至45岁；妊娠或哺乳妇女除外；无严重系统疾病、无免疫缺陷或自身免疫性疾病者，受试部位没有接受过皮肤治疗、美容以及其他可能影响结果的测试；无活动性过敏性疾病者；无体质高度敏感者；近一个月内未曾使用激素类药物以及免疫抑制剂者；现在或最近一个月受试部位未参加其他临床实验者。
[0092]
受试者的受试部位为前臂屈侧皮肤，样品涂抹区域及对照区域随机分布在前臂屈侧皮肤左、右侧，样品涂抹区域及对照区域面积一致，各区域面积为至少3cm
×
3cm，区域间隔至少1cm，确保样品涂抹区及对照区域在统计学上达到平衡。若为化妆品实际使用位置，则样品涂抹区域及对照区域随机分布在前臂屈侧皮肤左、右侧，样品涂抹区域及对照区域面积一致。测试前，受试者在符合标准的测试环境中静坐至少30分钟，不能喝水或饮料，受试者前臂屈侧皮肤暴露，保持放松，避免触碰受试部位。
[0093]
测试时，前述受试者用碱性皂基清洁产品清洁面部，清水冲洗干净后，用无屑吸水干纸巾吸干，在符合标准的测试环境(测试环境温度：20℃至22℃，相对湿度：45
±
5％)中静坐，前臂屈侧皮肤暴露，保持放松，避免接触前臂屈侧皮肤，使用皮肤皮脂测试仪sm815测量前臂屈侧皮肤的皮肤表面皮脂量，其中受试者前臂屈侧皮肤皮脂量在8小时内超过120μg/cm2者作为受试者或化妆品实际使用位置(不受限测试前皮脂量)。
[0094]
接着在3分钟内，分别测量样品涂抹区域及对照区域的皮肤表面皮脂量，在各区域内不同位置测量3次，测量结果以3次测量平均值表示，作为初始值。若为样品实际使用位置，在定点测试区域内位置测量1次，作为初始值。
[0095]
样品按(2.0
±
0.1)mg/cm2/天的使用量进行单次涂抹，通过注射器或相当者进行定量取样，使用乳胶指套将样品均匀涂抹于规定区域内，并记录实际涂样量。在设定的测量时间点，分别在样品涂抹区域及对照区域内不同位置测量3次，获得各区域皮肤表面皮脂量，测量结果以3次测量的平均值表示。若为样品实际使用位置，在定点测试区域内位置测量1次，为其测量结果。
[0096]
设定的测量时间点间隔应不小于1小时，可根据产品评价需要设定多个测量时间点，整个测试周期通常不超过24小时。或长期使用0天(1、2或8小时)、14天、28天等多个测定点。样品使用期间如受试者皮肤出现不良反应，应立即终止试样，对不良反应予以记录。对样品涂抹区域及对照区域的测量值进行描述及统计，包括数量、均值、标准偏差、最小值、中位值及最大值等。分别计算样品涂抹区域及对照区域的初始值与其他测量时间点测量值之间的差值，然后利用此差值，统计分析不同测量时间点样品涂抹区域及对照区域的差别。如测试数据为常态分布(normal distribution)，则采用t检验方法进行统计分析；如测试数据为非常态分布(abnormal distribution)，则采用秩和检验(rank sum test) 方法进行统计。统计方法均采用双尾检验，检验水平a＝0.05。相关结果判定如下：
[0097]
阳性结果：与对照区域相比，样品涂抹区域皮脂测量值的差值呈显著性差异，表示被测样品有控油变化效果；
[0098]
阴性结果：与对照区域相比，样品涂抹区域皮脂测量值的差值无显著性差异，表示被测样品无控油变化参考意义。
[0099]
请参阅图7，其显示根据本发明一实施例的受试者皮肤涂抹发酵后的山茶花发酵物或未发酵的山茶花水煮液经14天后的皮肤油脂含量的直方图。由图7 的结果可知，受试者的对照区域(未涂抹)的皮肤油脂含量变化不大。然而，相较于受试者的受试区域涂抹未发酵的山茶花水煮液，受试者的受试区域涂抹实施例1的山茶花发酵液经5天后，确实可降低皮肤油脂含量。其次，受试者的受试区域涂抹实施例1的山茶花发酵液经7天及14天后，降低皮肤油脂含量的功效更加显著，如图7所示。
[0100]
2.2评估山茶花发酵液的淡化皱纹功效
[0101]
此实施例是在受试者具有皱纹的皮肤上设定受试区域(3cm
×
3cm)，并以第2.1节所述的市售仪器对受试区域的皮肤表面进行影像分析，以获得涂抹前的皮肤表面的纹理平均值(单位：任意单位，即未使用)。接着，受试区域的皮肤涂抹实施例1的山茶花发酵物(涂抹量为2.0
±
1.0mg/cm2/次)，每天涂抹一次，连续涂抹14天后，检测受试区域的皮肤表面的纹理平均值(即使用14天后)。
[0102]
请参阅图8a至图8j，其分别显示根据本发明一实施例的受试者的皮肤在山茶花发酵物涂抹前(图8a、图8c、图8e、图8g、图8i)或连续涂抹14天后(图 8b、图8d、图8f、图8h、图8j)的纹理外观照片。请参阅图9，其显示根据本发明一实施例的受试者皮肤涂抹或未涂抹发酵后的山茶花发酵物经14天后的纹理平均值。关于图8a至图8j的纹理平均值，可参阅表6及图9。
[0103]
表6
[0104][0105]
由图8a至图8j、表6及图9的结果可知，受试者使用实施例1的山茶花发酵物14天后，五名受试者中仅一名受试者的皮肤纹理无明显降低(图8a及图 8b)。其余四名受试者，相较于未使用的皮肤，使用实施例1的山茶花发酵物 14天后的皮肤纹理平均值明显降低11.81％，如图8c及图8j、表6及图9所示，确实具有淡化皱纹功效。
[0106]
2.3评估山茶花发酵液的致敏性
[0107]
斑贴试验主要是用于检测化妆品终产品或原料的刺激性。此实施例针对含有山茶花发酵物的化妆品组成物进行人体封闭式斑贴试验，以评估其潜在皮肤刺激性。
[0108]
首先，选择合适的受试者30人，年龄范围在18-60岁随机选择。称取0.020ml 至0.025ml的液体样品放入斑试器中备用。将0.2ml至0.025ml的液体样品滴加在滤纸片上，再将滤纸片置于斑试器内。每个样品均设置空白对照，在对照斑试器孔内加入与样品等量的样品溶剂，如蒸馏水或橄榄油。
[0109]
试验部位选为人体背部，利用无刺激性的胶带将斑试器固定贴敷于受试者背部。测试周期持续24小时。为了确保试验结果的准确度、可信度及科学，在测试期间受试者按照要求，不能摘掉斑试器，也不可使受试部位接触水。
[0110]
经24小时后，去除斑试器，静置30分钟后，等待压痕消失，观察皮肤的反应，其结果如表7所示。如果试验结果为阴性，则需要在斑贴试验后24小时及48小时分别再观察一次。
[0111]
表7
[0112][0113]
“‑”
：阴性反应；
[0114]
“±”
：可疑反应，仅有微弱红斑；
[0115]“+”：弱阳性反应(红斑反应)，出现红斑、浸润、水肿、丘疹；
[0116]“++”：强阳性反应(疱疹反应)，出现红斑、浸润、水肿、丘疹、疱疹，其反应可超出受试区域；
[0117]“+++”：极强阳性反应(融合性疱疹反应)，出现明显红斑、严重浸润、水肿、融合性疱疹，其反应超出受试区。
[0118]
请参阅表7，其为根据本发明一实施例的山茶花发酵物的斑贴试验结果。由表7可知，实施例1的山茶花发酵物在斑贴试验中均产生2级反应的不超过 1例，判断山茶花发酵物具有安全性、低致敏性，不会给人体带来不良反应。
[0119]
综言之，本发明以由山茶花、水与酵母所组成的初始体系、利用特定菌株的酵母进行特定的步骤、特定的有效成分及特定的比例、特定的分析模式或特定的评估方法仅用于例示说明山茶花发酵物及其制备方法及应用。然而，本领域技术人员应可理解，在不脱离本发明的精神及范围内，其他的山茶花、其他菌株的酵母、其他不可分离的成分、其他比例的有效成分、其他的分析模式或其他的评估方法，也可用于山茶花发酵物及其制备方法及应用，并不限于上述。
[0120]
根据上述实施例，本发明的山茶花发酵物及其制备方法，其将由山茶花、水与特定菌株的酵母所组成的初始体系，经发酵步骤、灭菌步骤及固液分离步骤后，所得的无细胞上清液为山茶花发酵物，其具有抗皮脂及淡化皱纹的功效，可做为有效成分并用于制备各种皮肤外用组成物。
[0121]
虽然本发明已以数个特定实施例揭露如上，但其他实施例也有可能。因此，本发明后附权利要求书的精神及范围不应限于这里包含的实施例所述。
[0122]
【生物材料保藏】
[0123]
酿酒酵母c-lye-6保藏于中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(china general microbiological culture collectioncenter，cgmcc，地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮政编码： 100101)，保藏日期为2021年03月16日，保藏编号为cgmcc no.22020。

技术特征：
1.一种山茶花发酵物，其特征在于，所述山茶花发酵物由初始体系经发酵步骤、灭菌步骤及固液分离步骤而制得，该初始体系是由山茶花、水与酵母所组成，该山茶花为干燥花朵，该发酵步骤是利用酵母于20℃至50℃的温度进行10小时至50小时，该酵母是酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)c-lye-6，在2021年03月16日保藏于中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmcc no.22020，且该山茶花发酵物包含0.5μg/ml至1.0μg/ml的芦丁以及0.3mg/ml至1.0mg/ml的儿茶素类化合物。2.根据权利要求1所述的山茶花发酵物，其特征在于，所述山茶花发酵物还包含4.0mg/ml至15.0mg/ml的粗多糖。3.根据权利要求1所述的山茶花发酵物，其特征在于，其中该儿茶素类化合物包含表没食子儿茶素、儿茶素、咖啡因、表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯以及茶黄素。4.根据权利要求1所述的山茶花发酵物，其特征在于，其中该山茶花及该水的重量体积比(g:ml)为2～10：100～300。5.根据权利要求1所述的山茶花发酵物，其特征在于，其中该酵母的菌体浓度为105cfu/ml至108cfu/ml。6.根据权利要求1所述的山茶花发酵物，其特征在于，其中该山茶花及该酵母的重量体积比(g:ml)为2～20：5～10。7.一种具抗皮脂功效的皮肤外用组成物，其特征在于，包含以根据权利要求1至权利要求6任一项所述的山茶花发酵物做为有效成分。8.一种具淡化皱纹功效的皮肤外用组成物，其特征在于，包含以根据权利要求1至权利要求6任一项所述的山茶花发酵物做为有效成分。9.一种山茶花发酵物用于制备具抗皮脂功效的皮肤外用组成物的用途，其特征在于，其中该皮肤外用组成物包含以根据权利要求1至权利要求6任一项所述的山茶花发酵物做为有效成分。10.根据权利要求9所述的山茶花发酵物用于制备具抗皮脂功效的皮肤外用组成物的用途，其特征在于，其中该山茶花发酵物具淡化皱纹功效。

技术总结
本发明有关于一种山茶花发酵物及其制备方法及应用。将由山茶花、水与特定菌株的酵母所组成的初始体系，经发酵步骤、灭菌步骤及固液分离步骤后，所得的无细胞上清液为山茶花发酵物，其具有抗皮脂及淡化皱纹功效，可做为有效成分并用于制备各种皮肤外用组成物。效成分并用于制备各种皮肤外用组成物。效成分并用于制备各种皮肤外用组成物。


技术研发人员：方祥铭 方晓薇
受保护的技术使用者：上海全丽生物科技有限公司
技术研发日：2022.03.16
技术公布日：2023/9/22