一种人上颌窦黏膜固有层间充质干细胞的提纯方法及应用

1.本发明属于生物医疗技术领域，尤其涉及一种人上颌窦黏膜固有层间充质干细胞的提纯方法及应用。


背景技术：

2.骨缺损修复和骨骼再生一直是临床治疗难题，构建组织工程骨是实现骨重塑的重要手段。间充质干细胞是组织工程技术的种子细胞类型之一，在临床转化中具有很高的实用性。其作为一种低免疫原性的多能干细胞，具有多向分化和免疫调控等功能，是再生医学领域重要的细胞治疗策略。成体干细胞是来源于成人身体中已分化组织中的未分化细胞，来源组织包括骨髓、脂肪、神经和皮肤等。成体间充质干细胞多来源于受体自身，不产生免疫排斥，不引起瘤变，也不存在伦理争议，分离提取和增殖分化培养条件也相对简单，在器官组织修复及生理功能恢复上具有独特优势，是干细胞治疗手段中的重要种子细胞来源。
3.人源成体间充质干细胞的组织来源一直在不断被探索和开发中。目前研究报道用于骨再生的间充质干细胞主要是骨髓来源的间充质干细胞(bm-msc)和脂肪来源的间充质干细胞(at-msc)。bm-msc虽然成骨和成软骨效果显著，但需提取自体骨髓，组织获得难度大，手术创伤大，且体外培养的bm-msc增殖速率相对较慢，细胞倍增时间约为48小时，传代至第5/6代时出现分化和衰老的现象。at-msc的细胞增殖速度较好，倍增时间可缩短至约24小时，在传至第9/10代时仍维持干性表型，但由于存在表观遗传因素驱动的“组织记忆”效应，at-msc更容易分化为脂肪组织，成骨效果不稳定。因此，目前仍需进一步寻找和开发用于骨组织工程的成体间充质干细胞群。
4.近年来，在口腔种植学的上颌窦区骨再生领域，有关上颌窦黏膜成骨潜能及其来源的间充质干细胞的研究引起了学者的广泛关注。上颌窦黏膜组织结构如图1所示，在模拟上颌窦底提升手术模型的体内实验中观察到，将上颌窦黏膜从窦底骨壁上剥离抬高，并利用种植体维持二者的空间距离，经过愈合周期，紧邻黏膜下方有新骨形成，说明了上颌窦黏膜具有成骨潜力。与此同时，在体外研究中将成人上颌窦黏膜离体培养，所获得的细胞经传代纯化后，表达间充质干细胞相关表面标志物，表达率在90％以上，且该细胞具备自我更新和多向分化能力。由此，上颌窦黏膜来源间充质干细胞被确认存在，并猜测上颌窦黏膜的成骨潜能来源于其中的间充质干细胞的增殖和分化。
5.上颌窦黏膜具有解剖位置特殊性，其贴附骨组织而存在，具备骨膜特性，同时临床发现，上颌窦黏膜具有较强的自修复性，说明其中含有的干细胞群增殖速度较快。如此一来，上颌窦黏膜来源的间充质干细胞兼备了细胞增殖速度快和可成骨分化的双重优势，可弥补单一应用bm-msc和at-msc的不足。由于上颌窦黏膜易于取下进行离体细胞培养，且取出部分黏膜基本不会对人体健康造成负面影响，在短期内黏膜可自愈合和再生，因此，从上颌窦黏膜中获取的间充质干细胞有望成为一种新的人类成体间充质干细胞供源，不仅可以开发其用于牙槽骨等口腔内组织再生的工程技术之中，甚至还可能将其作为诱导全身其他部位骨骼再生的重要种子干细胞。
6.目前，人源上颌窦黏膜来源的间充质干细胞虽然已被提取和鉴定，但实施技术并不成熟，未建立标准化的分离培养流程。上颌窦黏膜存在解剖位置的特殊性，这使得其结构复杂，层次多样，现有研究中并未依据黏膜的亚层结构逐一分离并进行细胞提纯和培养，且培养方法各异，导致所获得的细胞群体存在异质性，因此对这一来源的细胞的命名和认知也各有差异，影响了其在骨组织工程领域的应用。


技术实现要素：

7.本发明实施例的目的在于提供一种人上颌窦黏膜固有层间充质干细胞的提纯方法及应用，旨在解决上述背景技术中提出的问题。
8.本发明实施例是这样实现的，一种人上颌窦黏膜固有层间充质干细胞的提纯方法，包括以下具体步骤：
9.步骤1、细胞提取：
10.步骤1.1、将获得的上颌窦黏膜全层组织浸泡于含10％青霉素-链霉素(hyclone)的预冷生理盐水中，浸泡30min；细胞提取过程全程无菌、冰上操作，将黏膜转移至无额外添加的α-mem培养基中(biosharp)，使其完全舒展，骨膜层组织面向上，利用眼科镊将少部分余留的骨膜层剥离，使撕脱后的组织面充分暴露血管，余留的组织为固有层及上皮层，将黏膜彻底清洗去除血液；将骨膜层进行组织贴壁培养，作为对照；
11.步骤1.2、采用中性蛋白酶dispaseⅱ(solarbio)消化剩余上颌窦黏膜组织，即固有层和上皮层，dispaseⅱ消化液利用hepes缓冲液配置成1u/ml，并用孔径为0.22μm的过滤膜除菌；每5mm*5mm的组织块用1ml的dispaseⅱ消化液37℃孵育，每10分钟颠倒混匀一次；
12.步骤1.3、消化1.5小时后，取出黏膜剩余组织，即固有层，用生理盐水清洗3次，每次液体体积为1ml，将消化液和用于清洗的生理盐水一并离心，程序为300g，5min，并进行细胞培养，作为对照；
13.步骤1.4、组织彻底清洗后，利用眼科镊将整块组织分离至约9mm2大小，在tc处理的t25培养瓶(whb)中进行组织块贴壁培养，每瓶放置4-6枚组织块，完全培养液使用α-mem(biosharp)，10％胎牛血清(procell)，1％青霉素-链霉素(hyclone)；
14.步骤1.5、保证培养瓶不受外力移动，37℃，5％co2孵箱中静置培养72小时后，进行半量换液，之后每2-3天全量换液，至细胞融合度达到80％-90％进行传代；
15.步骤2、传代：
16.步骤3、细胞的冻存和复苏。
17.进一步的技术方案，在所述步骤1.2中，hepes缓冲液的成份为n-2-羟乙基-哌嗪基-n-2-乙基磺酸的兼性离子缓冲液。
18.进一步的技术方案，所述步骤2包括以下具体步骤：
19.使用0.25％胰蛋白酶溶液(hyclone)消化细胞，时间为3min，待细胞完全变圆后，使用2倍胰蛋白酶体积的含10％胎牛血清的α-mem培养液终止消化，吹打瓶底，使细胞完全脱离培养瓶悬浮在液体中，将液体完全移入离心管中；将原培养瓶用生理盐水轻柔清洗2次，每次用量为2ml，并将清洗后的液体一并移入离心管中，以完全清除消化后悬浮的单细胞；将移至离心管的细胞悬液离心，程序为300g，5min，重悬，按照细胞融合度50％-60％接种。
20.进一步的技术方案，所述步骤3中的细胞冻存包括以下步骤：
21.去除步骤2中离心后的上清液，留细胞沉淀，加入细胞冻存液，配比为92％dmso和8％胎牛血清，使用梯度冻存法保存细胞，程序为4℃，30min；-20℃，30min；-80℃，过夜；液氮，长期储存。
22.进一步的技术方案，所述步骤3中的细胞复苏包括以下步骤：
23.冻存细胞从液氮取出后，立即放至37℃水浴至刚好完全融化，将该液体与单纯α-mem培养基以1:9的比例混合，离心，程序为300g，5min，去净上清液，加入完全培养基重悬细胞，按照细胞融合度60％-70％接种；第二天，全量换液一次，之后每2-3天全量换液，至细胞融合度达到80％-90％进行传代。
24.本发明实施例的另一目的在于，一种人上颌窦黏膜固有层间充质干细胞的应用，基于上述人上颌窦黏膜固有层间充质干细胞的提纯方法制备的人上颌窦黏膜固有层间充质干细胞，将所述人上颌窦黏膜固有层间充质干细胞应用于细胞骨组织工程中。
25.本发明实施例提供的一种人上颌窦黏膜固有层间充质干细胞的提纯方法及应用，发现并提取培养了人源上颌窦黏膜固有层间充质干细胞，黏膜单一亚层体外培养，区别于目前将上颌窦黏膜全层进行体外培养，解决现有上颌窦黏膜间充质干细胞的来源混杂、提纯困难的问题。并将所获得的上颌窦黏膜固有层间充质干细胞进行了成骨功能验证，证明其可以成骨分化，证实其在骨再生组织工程技术环节中的应用价值。
附图说明
26.图1为上颌窦黏膜组织结构示意图；
27.图2为本发明实施例提供的一种人上颌窦黏膜固有层间充质干细胞的提纯方法的流程图；
28.图3为上颌窦黏膜体外逐层分离过程图；a.内窥镜下观察被剥离的健康上颌窦黏膜颜色形态均正常，可以用于体外培养；b.取下的上颌窦黏膜(逐层分离前)，该图为骨膜层向上，肉眼观察部分位置骨膜已破裂脱落，可见明显的毛细血管；c.利用镊子小心分离骨膜层；d1.获得的上颌窦黏膜骨膜层，肉眼观察为薄层纤维样结构；d2.将剩余的上颌窦黏膜上皮层和固有层浸泡在中性酶蛋白消化液中以获得上皮层单细胞悬液；d3.对消化后的剩余组织进行充分清洗，获得上颌窦黏膜固有层，肉眼观察为较骨膜层稍厚的纤维样结构；e.骨膜层的石蜡包埋切片he染色光镜照片(
×
200)；f.去掉骨膜层的黏膜石蜡包埋切片he染色光镜照片(
×
200)。
29.图4为人上颌窦黏膜各亚层的原代细胞；
30.图5为固有层间充质干细胞传代至p1、p5和p10代时的细胞形态图；
31.图6为p1代的骨膜层间充质干细胞图；
32.图7为冻存后复苏的p1代固有层间充质干细胞形态图；
33.图8为固有层间充质干细胞和骨膜层间充质干细胞集落形成实验结果图；
34.图9为固有层间充质干细胞和骨膜层间充质干细胞的增殖速率图；
35.图10为上颌窦黏膜固有层间充质干细胞诱导组和对照组的细胞分化图；
36.图11为固有层间充质干细胞和骨膜层间充质干细胞的多向分化结果比较；
37.图12为固有层间充质干细胞(a:a1,a2,a3)与骨膜层间充质干细胞(b:b1,b2,b3)
rna测序的基因表达情况分析图；
38.图13为固有层间充质干细胞(a1,a2,a3)和骨膜层间充质干细胞(b1,b2,b3)的多种干细胞相关阳性(a)和阴性(b)标志物基因表达量点线图；
39.图14为固有层间充质干细胞和骨膜层间充质干细胞成骨诱导后与非诱导对比的rna-seq分析。(a).kegg pathway富集分析；(b).固有层间充质干细胞成骨差异基因聚类热图；(c).骨膜层间充质干细胞成骨差异基因聚类热图。
40.图15为固有层间充质干细胞和骨膜层间充质干细胞的多向分化qrt-pcr结果；
41.图16为固有层间充质干细胞和骨膜层间充质干细胞的成骨诱导western blot蛋白表达结果；
42.图17为固有层间充质干细胞与人牙龈成纤维细胞、人牙髓来源间充质干细胞成骨向分化效果比对；
43.图18为固有层间充质干细胞和骨膜层间充质干细胞的成骨诱导二维和三维培养成骨蛋白细胞荧光染色结果(一)；
44.图19为固有层间充质干细胞和骨膜层间充质干细胞的成骨诱导二维和三维培养成骨蛋白细胞荧光染色结果(二)。
具体实施方式
45.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
46.以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述。
47.如图2和3所示，本发明一个实施例提供的一种人上颌窦黏膜固有层间充质干细胞的提纯方法，包括以下具体步骤：
48.步骤1、细胞提取：
49.步骤1.1、将获得的上颌窦黏膜全层组织浸泡于含10％青霉素-链霉素(hyclone)的预冷生理盐水中，浸泡30min。细胞提取过程全程无菌、冰上操作，将黏膜转移至无额外添加的α-mem培养基中(biosharp)，使其完全舒展，骨膜层组织面向上，利用眼科镊将少部分余留的骨膜层剥离，使撕脱后的组织面充分暴露血管，余留的组织为固有层及上皮层，将黏膜彻底清洗去除血液。需注意，由于骨膜层与骨壁连接较为紧密，与上颌窦黏膜固有层之间连接较为疏松，在手术中取下黏膜组织时，一部分骨膜层可能会留在骨壁上而未被取下。在体外分离时，通过观察组织面的完整度判断是否有骨膜层，并将剩余骨膜层分离。将分离后的骨膜层进行组织贴壁培养，作为对照。利用眼科镊将组织轻柔牵拉分离，不使用剪碎或搅碎等方法，最大程度减少机械应力和局部产热对细胞的损伤。
50.步骤1.2、采用中性蛋白酶dispaseⅱ(solarbio)消化剩余上颌窦黏膜组织，即固有层和上皮层，此种蛋白酶可切割纤连蛋白和iv型胶原蛋白，但不能切割层粘连蛋白，v型胶原蛋白，血清白蛋白或转铁蛋白。由于在上皮层基底膜主要表达的胶原蛋白类型为iv型，而固有层结缔组织主要的胶原蛋白类型为v型，因此使用dispaseⅱ可将上皮层和固有层从上皮基底膜中分离，并不损伤固有层的组织结构。dispaseⅱ消化液利用hepes缓冲液(成份为n-2-羟乙基-哌嗪基-n-2-乙基磺酸的兼性离子缓冲液)配置成1u/ml，并用孔径为0.22μm
的过滤膜除菌。每5mm*5mm的组织块用1ml的dispaseⅱ消化液37℃孵育，每10分钟颠倒混匀一次。
51.步骤1.3、消化1.5小时后，取出黏膜剩余组织，即固有层，用生理盐水清洗3次，每次液体体积为1ml。冲洗的目的是为了完全清除余留在固有层组织上的上皮层细胞。将消化液和用于清洗的生理盐水一并离心，程序为300g，5min，并进行细胞培养，作为对照。由于上皮组织是由大量的细胞组成，细胞间质很少，因此，离心重悬轻柔吹打后将得到上皮中的单细胞悬液。
52.步骤1.4、组织彻底清洗后，利用眼科镊将整块组织分离至约9mm2大小，在tc处理的t25培养瓶(whb)中进行组织块贴壁培养，每瓶放置4-6枚组织块，完全培养液使用α-mem(biosharp)，10％胎牛血清(procell)，1％青霉素-链霉素(hyclone)。上述分离组织的方法为物理方法分离，仅利用眼科镊将组织轻柔牵拉分离，不使用剪碎或搅碎等方法，最大程度减少机械应力和局部产热对细胞的损伤。
53.步骤1.5、保证培养瓶不受外力移动，37℃，5％co2孵箱中静置培养72小时后，多数组织块可贴壁，此时动作轻柔的半量换液，尽量避免组织块脱落，之后每2-3天全量换液，至细胞融合度达到80％-90％进行传代。需注意，若组织块在换液时脱落，培养时注意保证培养瓶静止不收外力，活力较好的组织块仍可继续贴附在底壁上。单一的人上颌窦黏膜固有层原代细胞如图4所示，光学显微镜下观察为间充质干细胞特有纺锤样形态，细胞大小形态均一。此外，骨膜层原代细胞也表现为形态均一的间充质干细胞形态，而上皮层原代细胞表现为形态较为均一的表皮细胞形态。
54.步骤2、传代：
55.使用0.25％胰蛋白酶溶液(hyclone)消化细胞，时间为3min，待细胞完全变圆后，使用2倍胰蛋白酶体积的含10％胎牛血清的α-mem培养液终止消化，轻柔吹打瓶底，使细胞完全脱离培养瓶悬浮在液体中，将液体完全移入离心管中。将原培养瓶用生理盐水轻柔清洗2次，每次用量为2ml，并将清洗后的液体一并移入离心管中，以完全清除消化后悬浮的单细胞。操作时，动作应轻柔准确，最大程度避免组织块从瓶底脱落。冲洗结束后，瓶中继续加入4-5ml完全培养液，可继续进行组织块培养。将移至离心管的细胞悬液离心，程序为300g，5min，重悬，按照细胞融合度50％-60％接种。
56.如图5所示，固有层细胞传代至p1、p5和p10代时的细胞形态略有不同，随着传代次数的增加，细胞胞体增宽变长，漩涡幅度减弱。如图6所示，传至p1代的骨膜层细胞表现为大小均一的间充质干细胞形态，呈旋涡状生长。不同的是，固有层细胞略短小，骨膜层细胞略细长。
57.步骤3、细胞的冻存和复苏：
58.细胞冻存：去除步骤2中离心后的上清液，留细胞沉淀，加入细胞冻存液，配比为92％dmso和8％胎牛血清，使用梯度冻存法保存细胞，程序为4℃，30min；-20℃，30min；-80℃，过夜；液氮，长期储存。
59.细胞复苏：冻存细胞从液氮取出后，迅速放至37℃水浴至刚好完全融化，立刻将该液体与单纯α-mem培养基以1:9的比例混合，离心，程序为300g，5min，去净上清液，加入完全培养基重悬细胞，按照细胞融合度60％-70％接种。第二天，全量换液一次，之后每2-3天全量换液，至细胞融合度达到80％-90％进行传代。需注意，为避免细胞复苏时活力降低的风
险，接种时细胞融合度稍高于传代时的细胞融合度，细胞存活率较高。
60.如图7所示，冻存后复苏的固有层细胞形态仍均匀一致，与正常传代至p1代的细胞形态相似。
61.在本发明实施例中，α-mem培养基是改良版最低必需培养基，含hepes、丙酮酸钠、核糖核苷及脱氧核糖核苷。
62.作为本发明的一种优选实施例，在所述步骤1.3中，酶消化的时长对间充质干细胞的纯度和活性均有影响，时间过长会导致细胞活性降低，但时间过短会导致消化不彻底细胞分离不纯，因此选择中性蛋白酶dispaseⅱ的作用时间为1.5小时，经流式鉴定所获得的细胞纯度较高。
63.作为本发明的一种优选实施例，所述方法还包括：
64.步骤4、细胞干性、自我更新及增殖能力检测：
65.使用流式细胞术检测间充质干细胞表面标志物来鉴定所获得的细胞纯度。使用细胞集落形成实验检测干细胞特有的自我更新能力，cck8法进行细胞增殖和活力检测，并与同为间充质细胞的骨膜层细胞进行比较。
66.在本发明实施例中，所述步骤4包括以下具体步骤：
67.步骤4.1、流式细胞术检测：
68.使用0.25％胰酶消化贴壁细胞，终止反应后得到细胞悬液，300g离心5min。弃去上清，加入一定量pbs缓冲液洗涤2-3次，弃去上清，得到的细胞沉淀用100ul的pbs缓冲液重悬到细胞密度在5
×
10
6-10
×
106/ml之间。在室温下用5ul的封闭液孵育15min，以阻断fc受体。随后，在每个细胞悬液中加入10ul抗人抗体cd90(fitc标记)、cd105(apc标记)、cd45(pe-cy7标记)、hla-dr(fitc标记)、cd73(apc标记)、cd34(pe-cy7标记)。分别使用标记fitc、apc和pe-cy7的小鼠igg1作为同型对照。室温孵育15min后，用pbs缓冲液清洗细胞，300g离心5min，重悬于200μlpbs缓冲液中，用流式细胞仪(bd bioscience,san jose,usa)分析细胞，并用flowjo软件(flowjo,llc,oregon,usa)分析细胞。根据细胞正向散射(fsc)和侧向散射(ssc)特性(r1门)对细胞进行门控，然后分析标志物标记的表达情况。
69.如表1所示，经流式鉴定证实，所培养原代细胞传代至p1代时即可获得纯度较高的间充质干细胞，传代至p5代时继续维持间充质干细胞纯度，传代至p10时间充质干细胞表面标志物表达率在95％以上。
70.表1
[0071][0072]
步骤4.2、细胞集落形成实验：
[0073]
使用0.25％胰酶消化贴壁细胞，终止反应后得到细胞悬液，300g离心5min。计数5
×
102个p1代细胞每孔接种到6个孔板上，培养7天。随后用4％多聚甲醛固定细胞，pbs冲洗2次，用0.1％结晶紫染色30分钟，pbs冲洗2次。≥50个细胞的聚集物被标记为细胞集落，并在倒置光学显微镜下计数，并通过扫描仪(epson)进行全视图扫描。
[0074]
如图8所示，经细胞集落形成实验证实，所获得固有层间充质干细胞具有自我更新能力。结合细胞生长曲线结果可以看出，固有层间充质干细胞增殖能力能强，速度更快。
[0075]
步骤4.3、cck8实验：
[0076]
以2
×
103个细胞每孔接种于96孔板中，分别在培养第1-7天时，以cck8液与新鲜培养液1:10的比例37℃避光孵育60min，450nm处测吸光度(a)值。
[0077]
结果如图9所示，固有层间充质干细胞的增殖速率较骨膜层间充质干细胞快。
[0078]
本发明的一种实施例提供的一种人上颌窦黏膜固有层间充质干细胞在细胞骨组织工程中的应用，基于上述方法制备的人上颌窦黏膜固有层间充质干细胞。
[0079]
在本发明实施例中，为了验证人上颌窦黏膜固有层间充质干细胞成骨的可行性，进行了如下操作：
[0080]
操作1、多向分化诱导方法：
[0081]
使用人相关干细胞成骨、成脂、成软骨诱导分化试剂盒(oricell)进行多向分化的诱导和鉴定。以所获得的骨膜层间充质干细胞作为对照。
[0082]
1)成骨诱导鉴定：将待诱导的上颌窦黏膜固有层和骨膜层间充质干细胞按照1
×
104个/cm2的细胞密度接种于24孔板中，每孔加入0.5ml普通完全培养基，细胞置于37℃，5％co2的孵箱培养24小时，更换培养基为诱导分化培养基，每孔0.5ml，之后每3天更换一次新鲜的诱导分化培养基。使用茜素红染色法评定钙结节形成效果，测定时间为诱导培养21天。
[0083]
2)成脂诱导鉴定：将待诱导的上颌窦黏膜固有层和骨膜层间充质干细胞按照1
×
104个/cm2的细胞密度接种于24孔板中，每孔加入0.5ml普通完全培养基，细胞置于37℃，5％co2的孵箱培养72小时，使细胞达到融合度100％，更换培养基为诱导分化培养基a液，72小
时后吸去全部a液，更换为诱导分化培养基b液，24小时后，吸去b液，更换为诱导分化培养基a液。按此方式交替使用a液和b液，重复诱导和维持过程。使用油红o法评定脂肪形成效果，测定时间为诱导培养21天，镜下可观察到出现足量且大小适中的脂滴。
[0084]
3)成软骨诱导鉴定：将待诱导的上颌窦黏膜固有层和骨膜层间充质干细胞以5
×
105个转移至15ml离心管中，250g，4min离心。弃上清，加入0.5ml诱导分化预混液(含添加物ⅰ的基础培养基)，重悬细胞，150g，5min离心，弃上清，并重复一次。使用0.5ml的诱导分化培养基(含添加物ⅱ的诱导分化预混液)重悬清洗后的细胞，150g，5min离心，拧松离心管盖便于气体交换，37℃，5％co2的孵箱培养。48小时后，轻弹离心管底部使软骨球脱离管底悬浮在液体中。自接种起，每3天更换一次新鲜的诱导分化培养基，并轻弹软骨球使之脱离管底悬浮在液体中。将诱导得到的软骨球做石蜡切片，使用阿利辛兰染色法评定软骨组织中的内酸性粘多糖，测定时间为诱导培养21天，且肉眼观察到软骨球形成。
[0085]
如图10所示，经诱导后，上颌窦黏膜固有层间充质干细胞可向成骨、成脂及成软骨三向分化，与未诱导的对照组相比效果显著，且各向分化效果均一。图11为固有层间充质干细胞和骨膜层间充质干细胞的多向分化结果比较。
[0086]
操作2、rna-seq分析：
[0087]
对所获得固有层间充质干细胞和骨膜层间充质干细胞进行了rna-seq检测，对两种同为间充质来源的细胞干性标志物相关基因进行测序分析比对。随后，将细胞做成骨诱导处理并与非诱导状态的细胞进行rna-seq分析比较。
[0088]
有参转录组测序实验方法如下：
[0089]
1)rna抽提和文库构建
[0090]
提取总rna。使用nanodrop 2000分光光度计(thermo scientific,usa)鉴定rna纯度和定量，使用agilent 2100bioanalyzer(agilent technologies,santa clara,ca,usa)评估rna完整性。使用vahts universal v5 rna-seq library prep试剂盒依照说明书构建转录组文库。转录组测序和分析由上海欧易生物技术有限公司(shanghai,china)进行。
[0091]
2)rna测序和差异表达基因分析
[0092]
采用illumina novaseq 6000测序平台对文库进行测序，并生成150bp双端reads。每个样本大约获得50raw reads。采用fastp软件对fastq格式的raw reads进行处理，去除低质量reads后获得clean reads用于后续数据分析。使用hisat2软件进行参考基因组比对，并进行基因表达量(fpkm)计算，并通过htseq-count获得每个基因的reads计数(counts)。使用r(v 3.2.0)对基因(counts)进行pca分析以及绘图，以评估样本生物学重复。利用deseq2软件进行差异表达基因分析，其中符合p值《0.05且foldchange》2或foldchange《0.5阈值的基因被定义为差异表达基因(degs)。使用r(v 3.2.0)对degs进行层次聚类分析，以展示基因在不同组和样本中的表达模式。基于超几何分布算法对差异表达基因进行go和kegg pathway富集分析，用于筛选显著性富集功能条目。
[0093]
如图12所示，固有层间充质干细胞(a:a1,a2,a3)与骨膜层间充质干细胞(b:b1,b2,b3)的细胞样本主成分pca分析(a)、基因fpkm表达量分析(b)及样本聚类分析(c)结果表明，组内各样本显示高度一致性，而差异基因柱状图(d)及火山图(e)结果可见，两种细胞的基因表达类型有显著差异，说明了两种细胞表型的差异性。如图13所示，在多种干细胞相关阳性(a)和阴性(b)标志物基因表达量点线图中可见，两种细胞所表达基因均指向二者为干
细胞表型，但相关基因表达量有所差异。额外发现，固有层间充质干细胞特殊表达cd14基因，此基因在多数成体干细胞中不表达，但近年也被发现表达在猪精原干细胞中。kegg和成骨差异基因聚类结果分析如图14所示。
[0094]
操作3、基因及蛋白表达情况检测：
[0095]
对诱导后的固有层间充质干细胞进行了基因和表达蛋白的功能验证检测。由于成骨分化是所需达到的主要技术效果指标，因此对上颌窦黏膜固有层间充质干细胞体外培养后进行了比较全面的成骨指标评价，并与骨膜层间充质干细胞的成骨分化效果进行比对，说明二者的差异以及单一亚层培养在实际应用中的重要性。此外，也将固有层间充质干细胞与口腔内其他两种可提取培养的人来源的细胞进行成骨分化效果比对，分别是牙龈成纤维细胞和牙髓间充质干细胞，以此进一步说明固有层间充质干细胞的在骨组织工程中的应用价值。
[0096]
1)qrt-pcr检测：
[0097]
以5
×
104个细胞每孔接种于12孔板中，24h后对实验组更换诱导液，对照组更换完全培养基，每2天换液。关键基因mrna表达测定时间为诱导培养7天和14天，使用qrt-pcr法进行测定。基因的引物设计和合成均由上海生工生物工程股份有限公司完成，使用引物序列如下：
[0098][0099][0100]
细胞总rna提取，全程无酶操作：
[0101]
(1)pbs冲洗两遍，吸干液体，每孔内加入1ml rnaiso(takara)，镜下观察，待细胞完全脱落裂解后，收集液体至1.5ml rnase-free eppendorf管(下同)内，加入200μl三氯甲烷，充分涡旋混匀，4℃静置10min，离心机12000
×
g离心15min。
[0102]
(2)小心吸取上清300-400μl，加入等量异丙醇，上下颠倒混匀，-20℃过夜，次日取
出，离心机12000
×
g离心10min。
[0103]
(3)弃上清，加入depc水配置的70％乙醇400μl，充分涡旋振荡，离心机12000
×
g离心10min。重复该步骤。
[0104]
(4)弃上清，滤纸条吸干多余液体，加20μl预热55℃的depc水，使rna充分溶解至溶液透明。
[0105]
(5)取2μl液体检测rna浓度，其余用eppendorf管分装后保存于-80℃冰箱，避免使用时反复冻融。
[0106]
cdna的合成，全程在冰上操作:
[0107]
根据primescripttm rt reagent kit with gdnaeraser(takara)说明书计算配置逆转录反应液，充分混匀，获得的cdna置于-80℃冰箱中保存。合成过程分两步进行，第一步去除基因组dna反应条件：42℃，2min；4℃，暂存，反应液配置如下：
[0108][0109][0110]
第二步逆转录反应条件：37℃，15min；85℃，5sec；4℃，暂存，反应液配置如下：
[0111][0112]
qrt-pcr反应:
[0113]
配制实时定量pcr(quantitative real-time pcr,qrt-pcr)反应体系，反应体系全程在冰上操作，参照荧光实时定量试剂盒说明书(takara)依次加入反应液。每个待测样品设置3个复孔，按照95℃，30sec；95℃，5sec；60℃，34sec，实时定量检测40ct内荧光强度的改变，以gapdh为内参基因计算2-δδct值，进行相对定量分析。
[0114][0115]
固有层间充质干细胞和骨膜层间充质干细胞的多向分化qrt-pcr结果如图15所示。
[0116]
2)western blot检测：
[0117]
以1
×
105个细胞每孔接种于6孔板中，24h后对实验组更换诱导液，对照组更换完全培养基，每2天换液。成骨关键基因胞内蛋白测定时间为诱导培养7天和14天，使用western blot法进行测定：
[0118]
(1)样品准备
[0119]
①
弃培养液，pbs清洗2次后，使用带抑制剂的蛋白裂解液(beyotime)充分裂解细胞，12000g离心3min，取上清。
[0120]
②
使用bca蛋白定量试剂盒(beyotime)测定蛋白浓度，计算并调整各样品浓度一致，以1:4的比例将5x sds-page蛋白上样缓冲液(beyotime)加入样品中，充分混匀；
[0121]
③
样品置于100℃水浴锅内加热，10min。
[0122]
(2)电泳
[0123]
①
按说明书(beyotime)配置电泳缓冲液，室温暂存；
[0124]
②
安装预制胶电泳胶板(beyotime)，电泳仪(君意东方)内槽倒入电泳缓冲液，依次加入蛋白marker(thermo fisher scientific)和等量样品，设置电压(150v)、电流(300ma)、功率(120w)，电泳时间约40min。
[0125]
(3)半干转膜：
[0126]
①
按照说明书(beyotime)配转膜液；
[0127]
②
于转移电泳槽上按照正极到负极的顺序依次放置滤纸、硝酸纤维素膜(nc膜,beyotime)和电泳胶，排净气泡；
[0128]
③
设置电压(18v)、电流(400ma)、功率(120w)，转膜时间15min。
[0129]
(4)封闭
[0130]
将nc膜置于封闭液(新赛美)中，置于摇床上，封闭1h。
[0131]
(5)抗体孵育
[0132]
按说明书稀释一抗(abclonal)，β-actin(1:1000)，alp(1:1000)，runx2(1:1000)，ocn(1:1000)。将nc膜置于一抗内孵育，置于摇床上，4℃过夜。
[0133]
(6)冲洗
[0134]
使用western洗涤液和pbs交替冲洗nc膜各三次，10min/次。
[0135]
(7)抗体孵育
[0136]
按说明书(beyotime)稀释配置二抗液体(1:500)，将nc膜置于二抗液中，置于摇床上，孵育1h。
[0137]
(8)冲洗
[0138]
使用western洗涤液(beyotime)和pbs交替冲洗nc膜各三次，10min/次。
[0139]
(9)染色与检测
[0140]
使用碱性磷酸酶显色试剂盒(beyotime)染色，30min，使用epson scan扫描仪电子化蛋白条带，使用image j分析实验结果。固有层间充质干细胞和骨膜层间充质干细胞的成骨诱导western blot蛋白表达结果如图16所示。
[0141]
3)碱性磷酸酶染色：
[0142]
以2
×
104个细胞每孔接种于24孔板中，24h后对实验组更换成骨诱导液，对照组更换完全培养基，每2天换液。碱性磷酸酶测定时间为诱导培养7天，使用bcip/nbt碱性磷酸酶
显色试剂盒(beyotime)进行测定。使用4％多聚甲醛固定贴壁细胞，pbs冲洗3次，加入配置好的染液，室温避光染色至少30min。染色结果在倒置显微镜(olympus)下观察，并使用扫描仪(epson)进行全视图扫描。固有层间充质干细胞与人牙龈成纤维细胞、人牙髓来源间充质干细胞染色结果如图17所示。
[0143]
4)细胞免疫荧光染光：
[0144]
将细胞在4％的多聚甲醛中固定，用pbs洗涤3次，加入0.1％ triton穿透30min，加入免疫封闭液封闭1h后加入兔源一抗(abclonal)，4℃过夜。次日pbs清洗2-3次，加入二抗山羊抗兔igg，室温孵育1h，冲洗后加入鬼笔环肽进行细胞骨架肌动蛋白染色30min，最后加入dapi进行细胞核染色5min，荧光显微镜(olympus)观察荧光并拍照记录。荧光染液和相应指标为：runx2抗体(成骨通路转录因子)，col1a1抗体(胞内成骨早期蛋白)，ocn(胞内成骨晚期蛋白)。固有层间充质干细胞与人牙龈成纤维细胞、人牙髓来源间充质干细胞ocn染色结果如图17所示。
[0145]
操作4、细胞成骨诱导的三维培养(3d culture)
[0146]
由于细胞组织工程中通常需要将细胞与支架材料预先混合再进行体内移植，因此额外进行了所获得的上颌窦黏膜固有层间充质干细胞和骨膜层间充质干细胞在3d成骨诱导条件下的培养结果。展示了培养3天和7天时，细胞骨架形态的差异和细胞早期成骨蛋白col-1a1表达情况。二维培养使用tc处理的孔板(labselect)，三维培养使用光交联微球水凝胶材料，水凝胶前体溶液为10％甲基丙烯酸明胶和0.1％苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂蓝光光引发剂。培养结果利用细胞免疫荧光染色进行展示，如图18和19所示。
[0147]
综上所述，各向分化鉴定染色及qrt-pcr结果显示，固有层间充质干细胞各向分化能力没有特殊偏向性，而骨膜层间充质干细胞成骨、成软骨能力更强。如图17所示，其中依次为碱性磷酸酶染色(alp)、茜素红染色(ars)及成骨蛋白ocn细胞荧光染色，人上颌窦黏膜固有层间充质干细胞与人牙龈成纤维细胞、人牙髓来源间充质干细胞相比，其体外成骨性能更加突出。在成骨诱导后的rna-seq结果中，将go富集的与成骨相关的差异基因绘制聚类热图，可看到固有层间充质干细胞经诱导后成骨相关基因被显著调控，但相关基因数量较骨膜层间充质干细胞少。kegg pathway富集分析表明，固有层间充质干细胞显著表达的通路与成骨高度相关，所富集到的通路与骨膜层间充质干细胞高表达的通路有高度一致性，但富集显著性相对较低。成骨相关蛋白的western blot检测证实，固有层间充质干细胞被诱导成骨分化的时间周期较骨膜层间充质干细胞稍长。二维培养和三维培养的成骨诱导结果同样说明了成骨时间周期的不同。此外，二维培养时细胞骨架形态仍为干细胞的特征梭形形态，而三维培养明显可见细胞骨架形态为成骨细胞的方形形态，说明了对固有层间充质干细胞三维培养的必要性，以及细胞骨组织工程的有效性。
[0148]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种人上颌窦黏膜固有层间充质干细胞的提纯方法，其特征在于，包括以下具体步骤：步骤1、细胞提取：步骤1.1、将获得的上颌窦黏膜全层组织浸泡于含10％青霉素-链霉素的预冷生理盐水中，浸泡30min；细胞提取过程全程无菌、冰上操作，将黏膜转移至无额外添加的α-mem培养基中，使其完全舒展，骨膜层组织面向上；利用眼科镊将余留的骨膜层剥离，使撕脱后的组织面充分暴露血管，余留的组织为固有层及上皮层，将黏膜彻底清洗去除血液；将骨膜层进行组织贴壁培养，作为对照；步骤1.2、采用中性蛋白酶dispaseⅱ消化剩余上颌窦黏膜组织，即固有层和上皮层，dispaseⅱ消化液利用hepes缓冲液配置成1u/ml，并用孔径为0.22μm的过滤膜除菌；每5mm*5mm的组织块用1ml的dispaseⅱ消化液37℃孵育，每10分钟颠倒混匀一次；步骤1.3、消化1.5小时后，取出黏膜剩余组织，即固有层，用生理盐水清洗3次，每次液体体积为1ml，将消化液和用于清洗的生理盐水一并离心，程序为300g，5min，并进行细胞培养，作为对照；步骤1.4、组织彻底清洗后，利用眼科镊将整块组织分离至9mm2大小，在tc处理的t25培养瓶中进行组织块贴壁培养，每瓶放置4-6枚组织块，完全培养液使用α-mem，10％胎牛血清，1％青霉素-链霉素；步骤1.5、保证培养瓶不受外力移动，37℃，5％co2孵箱中静置培养72小时后，进行半量换液，之后每2-3天全量换液，至细胞融合度达到80％-90％进行传代；步骤2、传代：步骤3、细胞的冻存和复苏。2.根据权利要求1所述的人上颌窦黏膜固有层间充质干细胞的提纯方法，其特征在于，在所述步骤1.2中，hepes缓冲液为含有n-2-羟乙基-哌嗪基-n-2-乙基磺酸的兼性离子缓冲液。3.根据权利要求1所述的人上颌窦黏膜固有层间充质干细胞的提纯方法，其特征在于，所述步骤2包括以下具体步骤：使用0.25％胰蛋白酶溶液消化细胞，时间为3min，待细胞完全变圆后，使用2倍胰蛋白酶体积的含10％胎牛血清的α-mem培养液终止消化，吹打瓶底，使细胞完全脱离培养瓶悬浮在液体中，将液体完全移入离心管中；将原培养瓶用生理盐水清洗2次，每次用量为2ml，并将清洗后的液体一并移入离心管中，以完全清除消化后悬浮的单细胞；将移至离心管的细胞悬液离心，程序为300g，5min，重悬，按照细胞融合度50％-60％接种。4.根据权利要求3所述的人上颌窦黏膜固有层间充质干细胞的提纯方法，其特征在于，所述步骤3中的细胞冻存包括以下步骤：去除步骤2中离心后的上清液，留细胞沉淀，加入细胞冻存液，配比为92％dmso和8％胎牛血清，使用梯度冻存法保存细胞，程序为4℃，30min；-20℃，30min；-80℃，过夜；液氮，长期储存。5.根据权利要求4所述的人上颌窦黏膜固有层间充质干细胞的提纯方法，其特征在于，所述步骤3中的细胞复苏包括以下步骤：冻存细胞从液氮取出后，立即放至37℃水浴至刚好完全融化，将该液体与单纯α-mem培
养基以1:9的比例混合，离心，程序为300g，5min，去净上清液，加入完全培养基重悬细胞，按照细胞融合度60％-70％接种；第二天，全量换液一次，之后每2-3天全量换液，至细胞融合度达到80％-90％进行传代。6.一种人上颌窦黏膜固有层间充质干细胞的应用，基于上述的人上颌窦黏膜固有层间充质干细胞的提纯方法制备的人上颌窦黏膜固有层间充质干细胞，将所述人上颌窦黏膜固有层间充质干细胞应用于细胞骨组织工程中。

技术总结
本发明适用于生物医疗技术领域，提供了一种人上颌窦黏膜固有层间充质干细胞的提纯方法，包括以下具体步骤：步骤1、细胞提取；步骤2、传代；步骤3、细胞的冻存和复苏。该方法发现并提取培养了人源上颌窦黏膜固有层间充质干细胞，黏膜单一亚层体外培养，区别于目前将上颌窦全层进行体外培养的方式。并同步将该细胞进行了成骨功能验证，证明其可以成骨分化，具有骨组织工程应用前景。骨组织工程应用前景。骨组织工程应用前景。


技术研发人员：周延民 吕慧欣 孙晓琳 王一涵 刘修玉 陈静霞
受保护的技术使用者：吉林大学
技术研发日：2023.06.20
技术公布日：2023/9/22