双相障碍诊断生物标记物

1.本发明涉及医学诊断领域，具体涉及用于区分或鉴别诊断双相障碍和抑郁障碍的生物标记物。本发明还涉及利用此生物标记物的检测来区分或鉴别诊断双相障碍和抑郁障碍的试纸条。


背景技术：

2.精神疾病(mental illness)，也称为精神障碍(mental disorder)，是一类具有对所有病理性精神活动的一种总称，其体现为以临床显著的个体认知、情感调节或行为紊乱为特征的一种综合征。常见的精神疾病包括精神分裂症、心境障碍、焦虑障碍、抑郁障碍等多种病症。
3.目前，精神疾病的分类标准有包括基于美国精神医学协会的dsm系统、基于世界卫生组织的icd系统、基于中国的ccmd系统等。但是，这些系统均是建立在临床症状评估的基础上，缺乏客观的生物学诊断指标，即具有一组类似症状的患者被归为同一类疾病的范畴，而这一组类似症状可能是由完全不同的生物学因素/病理因素所引起。相反，具有不同症状的患者虽然依据临床症状评估被分类为不同疾病，但是这些症状可能是否相同的生物学因素/病理因素所引起。这对于精神疾病的准确治疗带来了困难。
4.双相障碍(bipolar disorder,bpd或bp)是一种临床上既有重度或轻度躁狂发作，又有抑郁发作的精神疾病。双相障碍临床表现复杂，情绪低落或高涨、动力减退或增加等症状反复、不规律出现，并会伴随有焦虑症状、还可能出现幻觉、妄想等症状。类似地，抑郁障碍(major depression disorder,mdd或major depression,md)也是一种临床症状十分丰富的精神疾病，主要临床表现为心境低落，同时伴有认知和行为改变，也出现幻觉、妄想等症状。
5.双相障碍和抑郁障碍所出现的临床症状多样化且部分症状交叉重叠导致二者临床诊断困难。因此，寻找和确立一个或一组明确的生物标记物来客观诊断双相障碍和抑郁障碍具有重要意义。


技术实现要素：

6.本发明基于质谱确定了包括诸如dmtn、lrrc4、krt13、bpifb1、sdcbp等在内的多个生物标记物及其组合可用于特异性区分双相障碍和抑郁障碍，对于双相障碍的诊断具有高特异性。
7.一方面，本发明提供了用于检测来自受试者的样品中生物标记物的试剂在制备用于区分或鉴别诊断双相障碍和抑郁障碍的试纸条中的用途，其中，其中所述受试者疑似患有精神障碍但难以确定该精神障碍为双相障碍或抑郁障碍，所述生物标记物包括选自以下的一种或多种：twf2、tpm1、actr2、capza2、tubb1、nap1l1、tubb、ube2l3、ef1g、psmb3、prdx5、tuba4a、sh3bgrl、coro1c、cttn、dmtn、pcmt1、krt13、arpc5、cald1、usp14、sh3bgrl2、dbnl、anxa3、pgm2、capza1、adh4、ube2v2、arpc2、gmpr、pdia6、ywhaq、pa2g4、anxa5、snx12、
mapre2、lims1、dynll1、sumo3、mapre1、bin2、urod、lrrc4、pygb、serpinb6、pde5a、myl6、mob1b、septin11、nsfl1c、unc13d、boc、slc9a3r1、g6pd、sema3a、ptpn6、dbi、uba7、otub1、fhl1、ola1、atp6v1a、clic4、psmb8、gdf2、snx3、gnb2、arhgap18、dnm1l、hk1、rad23a、dcn、ank1、cct8、coro1b、aco1、eif6、stxbp2、naxe、cln5、txnl1、mpp1、cct3、bpifb1、pdcd6ip、pabpc1、pla2g15、txndc17、fh、xpnpep1、sdcbp、psmb5、pdlim5、psmd2、tpm3、septin6、actr3、cast、vasp、acat2、pafah1b3、lod4、cpb1、ilk、cndp2、pygl、prf1、pdlim7、lgalsl、yars1、crkl、wdr44、hpse、adh5、blvra、ap1g1、cavin2和cbr1。
8.在一个实施方式中，所述生物标记物包括选自以下一种或多种：dmtn、lrrc4、krt13、bpifb1、sdcbp和它们的组合。
9.另一方面，本发明提供了一种能够检测如本发明所述的生物标记物的试纸条，其特征在于，所述试纸条包括底板以及在底板上依次顺序搭接粘贴如下部件：
10.(i)样品垫，
11.(ii)样品结合垫，其中所述样品结合垫的上部进一步包被有抗体层，其中所述抗体层包括标记物缀合的抗如本发明所述的生物标记物的抗体，以及用作质控的抗体，
12.(iii)样品反应垫，其中所述样品反应垫上设置有检测带和质控带，其中，
13.iii-a)所述检测带包被有如本发明所述的生物标记物的检测带，
14.(iii-b)所述质控带固定有用作质控的抗原或抗体，和
15.(iv)吸水垫。
16.又一方面，本发明提供了一种能够检测如本发明所述的生物标记物的试纸卡，其特征在于，所述试纸卡包括：
17.(i)本发明的试纸条，和
18.(ii)包覆本发明的试纸条的外壳，其中所述外壳包括：
19.(ii-a)设置有加样孔和检测窗的卡盖，其中所述加样孔开口于所述样品垫的上侧，以暴露出所述样品垫的部分区域，所述检测窗开口于所述样品反应垫的上侧，以暴露出所述检测带和所述质控带的全部区域，和
20.(ii-b)与所述卡盖彼此连接的底座。
21.本发明通过质谱方法确定的生物标记物以及基于这些标记物开发的试纸条/试纸卡可以特异性区分双相障碍和抑郁障碍，对于双相障碍的诊断具有高特异性。
附图说明
22.图1是一种示例性的同时检测dmtn、lrrc4、krt13、bpifb1、sdcbp的试纸条的侧视图。
23.图2是一种示例性的同时检测dmtn、lrrc4、krt13、bpifb1、sdcbp的试纸卡的俯视图。
24.图3是本发明实验设计的示意图。
25.图4是pca分析的图。
26.图5是显示bpd与md患者的蛋白组存在显著上调/下调蛋白的火山图。
27.图6显示出经lasso筛选出来的dmtn、lrrc4、krt13、bpifb1和sdcbp在bpd与mdd病人血浆中的蛋白定量结果散点图。
28.图7显示出dmtn、lrrc4、krt13、bpifb1和sdcbp在鉴别诊断bpd与mdd受试者中的选择准确性。
具体实施方式
29.本发明通过质谱的方法对临床上难以从症状上区分且疑似患有双相障碍和抑郁障碍的患者的血浆样品进行了分析，发现了一系列具有潜在诊断学价值的生物标记物。这些生物学标记物可用于特异性区分双相障碍和抑郁障碍。
30.具体地，本发明通过收集经过临床确诊为双相障碍(bpd)的患者以及临床确诊为抑郁障碍(mdd)的患者，以及健康捐赠者的血浆样品，对这些样品中的蛋白通过质谱和所得的定量蛋白质组学数据进行差异化表达的蛋白质(differentially expressed protein；dep)分析，再对鉴定到的dep进行机器学习，采用最小绝对收缩和选择算子(lasso)回归算法模型筛选出可以鉴别诊断由此区分出双相障碍(bpd)以及抑郁障碍(mdd)的患者的蛋白生物标志物，筛选获得包括dmtn、lrrc4、krt13、bpifb1、sdcbp在内的多个具有潜在诊断学价值的生物标记物，利用接受操作特征曲线下的面积(roc auc)用于评估生物标志物在识别具有风险的双相障碍受试者中的选择准确性。结果表明这些生物标记物可用于特异性区分双相障碍和抑郁障碍，对于双相障碍的诊断具有高特异性。
31.因此，第一方面，本发明提供了用于检测来自受试者的样品中生物标记物的试剂在制备用于区分或鉴别诊断双相障碍和抑郁障碍的试纸条中的用途，其中，其中所述受试者疑似患有精神障碍但难以确定该精神障碍为双相障碍或抑郁障碍，所述生物标记物包括选自以下的一种或多种：twf2、tpm1、actr2、capza2、tubb1、nap1l1、tubb、ube2l3、ef1g、psmb3、prdx5、tuba4a、sh3bgrl、coro1c、cttn、dmtn、pcmt1、krt13、arpc5、cald1、usp14、sh3bgrl2、dbnl、anxa3、pgm2、capza1、adh4、ube2v2、arpc2、gmpr、pdia6、ywhaq、pa2g4、anxa5、snx12、mapre2、lims1、dynll1、sumo3、mapre1、bin2、urod、lrrc4、pygb、serpinb6、pde5a、myl6、mob1b、septin11、nsfl1c、unc13d、boc、slc9a3r1、g6pd、sema3a、ptpn6、dbi、uba7、otub1、fhl1、ola1、atp6v1a、clic4、psmb8、gdf2、snx3、gnb2、arhgap18、dnm1l、hk1、rad23a、dcn、ank1、cct8、coro1b、aco1、eif6、stxbp2、naxe、cln5、txnl1、mpp1、cct3、bpifb1、pdcd6ip、pabpc1、pla2g15、txndc17、fh、xpnpep1、sdcbp、psmb5、pdlim5、psmd2、tpm3、septin6、actr3、cast、vasp、acat2、pafah1b3、lod4、cpb1、ilk、cndp2、pygl、prf1、pdlim7、lgalsl、yars1、crkl、wdr44、hpse、adh5、blvra、ap1g1、cavin2和cbr1。
32.在一个实施方式中，所述生物标记物包括选自以下一种或多种：dmtn、lrrc4、krt13、bpifb1和sdcbp。在一个实施方式中，所述生物标记物为dmtn、lrrc4、krt13、bpifb1和sdcbp的组合。
33.在本文中，术语“包括”、“包含”、“具有”、或“含有”及其在本文中的其它变体形式为包含性的或开放式的，且不排除其它未列举的元素或方法步骤。
34.在本文中，术语“生物标记物”，也称为“生物标志物”，是指反映受试者的生物状态的可测量指标。此生物标志物可以是在受试者中的任何物质(例如基因或蛋白质)，只要它们与被检受试者的特定生物状态(例如，疾病)有关系。生物标记物可以是一个标记物，也可以是由两个或更多个生物标记物组成的一组标记物。本发明中的生物标记物是指蛋白质。
35.在本文中，用于区分双相障碍和抑郁障碍的生物标记物的名称参照uniprot蛋白
质数据库中的定义。
36.术语“dmtn”是指成束蛋白肌动蛋白结合蛋白(dematin actin binding protein)。dmtn在uniprot蛋白质数据库中的编号为q08495，具体参见https://www.uniprot.org/uniprot/q08495。
37.术语“lrrc4”是指富含lrr基序的蛋白(leucinerich repeat containing protein,lrrc4)。lrrc4在uniprot蛋白质数据库中的编号为q9hbw1，具体参见https://www.uniprot.org/uniprot/q9hbw1。
38.术语“krt13”是i型角蛋白13(keratin 13)。krt13在uniprot蛋白质数据库中的编号为p13646，具体参见https://www.uniprot.org/uniprot/p13646。
39.术语“bpifb1”是指bpi折叠折叠家族b成员1(bpi fold containing family b member 1)。bpifb1在uniprot蛋白质数据库中的编号为q8tdl5，具体参见https://www.uniprot.org/uniprot/q8tdl5。
40.术语“sdcbp”是指多配体(蛋白)聚糖结合蛋白(syndecan binding protein)。sdcbp在uniprot蛋白质数据库中的编号为o00560，具体参见https://www.uniprot.org/uniprot/o00560。
41.在本文中，所提及的疾病的诊断标准依据为美国精神科学会的精神疾病诊断和统计手册第4版(简称“dsm-iv”)，具体诊断标准可以参见《dsm-iv-tr guidebook》，the essential companion of the diagnostic and statistical manual of mental disorders,fourth edition text revision,2004。根据dsm-iv的诊断标准，抑郁障碍和双相障碍归属于精神类疾病的中心境障碍(mood disorders)。心境障碍在临床上表现为心境发作(mood episodes)，包括重性抑郁发作(major depressive episode)，躁狂发作(manic episode)和混合躁狂发作(mixed episode)。临床症状虽然可以作为心境障碍具体分型/亚型的诊断构件，但是其无法独立用于区分/诊断心境障碍的亚型或用于心境障碍的进一步分型。
42.根据dsm-iv的诊断标准，心境障碍的临床亚型包括双相障碍(bipolar disorder,bpd或bp)、抑郁障碍(major depression disorder或major depressive disorder,mdd，或major depression,md)、环性心境障碍(cyclothymic disorder)、其它心境障碍包括例如由躯体情况导致的心境障碍，因物质引起的心境障碍等。在本发明中，术语“双相障碍”、“bpd”和“bp”可以互换使用；术语“抑郁障碍”、“mdd”和“md”也可以互换使用。双相障碍又进一步包括双相i型障碍(bipolar i disorder，bp-i)和双相ii型障碍(bipolar ii disorder，bp-ii)。
43.需要注意的是，目前也存在对于双相障碍和抑郁障碍不一致的诊断标准。例如，dsm-iv将双相障碍和抑郁障碍归类为心境障碍的临床亚型，但是2013年出版的dsm-5已经将双相障碍和抑郁障碍从心境障碍中独立出来，与精神分裂症、抑郁障碍等并列为精神疾病的大类疾病。再例如，疾病和相关健康问题的国际统计分类第10版(icd-10)将双相障碍和抑郁障碍归类为心境障碍的临床亚型，随后2018年出版的icd-11中此分类标准并未改变，依旧将双相障碍和抑郁障碍归类为心境障碍的临床亚型。在本发明中，所提及的双相障碍和抑郁障碍的分类和诊断依据均以dsm-iv为准。在一个实施方式中，本发明的对象患有双相障碍临床分型依据dsm-iv诊断标准进行。在一个实施方式中，本发明的对象患有抑郁
障碍临床分型依据dsm-iv诊断标准进行。
44.术语“区分或者鉴别诊断双相障碍和抑郁障碍”是指通过检测本发明发现的一种或多种生物标记物可以对双相障碍进行诊断，尤其用于对在临床表现上显示出类似于抑郁障碍临床表现的双相障碍患者进行诊断。在本文中，术语“患者”等同于“受试者”，二者在文中可以互换。
45.在本文中，术语“样品”是指分离自受试者的组织或体液的样品，包括但不限于例如血浆，血清，尿液等。具体地，该样品可以是获得自怀疑患有或患有双相障碍和抑郁障碍的受试者的血液样品、血浆样品或血清样品的形式。在一个实施方式中，所述样品为血液样品，优选所述样品是血浆样品。
46.本发明通过质谱分析发现包括诸如dmtn、lrrc4、krt13、bpifb1和sdcbp等的一系列生物标记物在患有双相障碍的患者的血浆样品中表达水平的上调，而这一情况抑郁障碍的患者的血浆样品中并未出现。在一个实施方式中，所述生物标记物的表达平的上调提示所述患者患有双相障碍；所述生物标记物的表达水平的上调大于等于健康人及抑郁症患者平均值提示所述患者患有双相障碍。
47.在本文中，术语“能够检测生物标记物的表达水平的试剂”是指能够用于确定生物标记物在获得自受试者的样品中的表达水平是否升高、不变或降低的物质或手段/方法。测定生物样品中生物标记物(即蛋白质)的表达水平的方法是本领域技术人员已知的。例如，生物标记物的表达水平可以使用能够特异性结合此生物标记物的抗体，通过基于抗体的免疫测定方法来检测。再例如，生物标记物的表达水平通过定量质谱或靶向质谱，如selected/multiple reaction monitoring or srm/mrm(picotti&aebersold,nat methods 2012),parallel reaction monitoring or prm等方法进行测定来测定(peterson et al.,mcp 2012；vidva&spacil,anal chim acta 2017)。在一个实施方式中，所述生物标记物的表达水平通过免疫测定。
48.在一个实施方式中，生物标记物的表达水平通过能够特异性结合生物标记物的试剂来检测；可选地，所述生物标记物的表达水平通过靶向生物标记物的抗体来检测；可选地，所述抗体选自单克隆抗体或多克隆抗体。制备抗体例如单克隆抗体的方法是本领域技术人员已知的，可以参见clackson et al.,nature 352,624-628(1991)and marks et al.,j.mol.biol.222,581-597(1991)。本发明中靶向生物标记物的抗体也是可以商购的，例如：
49.针对dmtn的抗体：来自thermo兔多克隆抗dmtn抗体(目录号#pa5-38473)、来自sigma-aldrich的兔多克隆抗dmtn抗体(目录号#hpa024290)；
50.针对lrrc4的抗体：来自r&d system鼠单克隆抗lrrc4抗体(目录号#mab4995)、来自thermo的兔多克隆抗lrrc4抗体(目录号#pa5-78649)；
51.针对krt13的抗体：来自abcam的兔单克隆抗krt13抗体(目录号#ab92551)、来自novus的鼠单克隆抗krt13抗体(目录号#nbp3-07848)；
52.针对bpifb的抗体：来自r&d system鼠单克隆抗bpifb的抗体(目录号#mab10195)、来自abcam的兔多克隆抗bpifb的抗体(目录号#ab203350)；
53.针对sdcbp的抗体：来自sigma-aldrich的兔多克隆抗sdcbp抗体(目录号#s1701)来自boster的兔多克隆抗sdcbp抗体(目录号#a02475)。
54.在一个实施方式中，本发明的试剂可进一步被修饰以带有可检测的标记。在一个实施方式中，本发明的抗体可进一步被修饰以带有可检测的标记。
55.在一个实施方式中，可检测标记可以包括例如使用辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡糖氧化酶、放射性同位素、荧光报告子、胶体金等。可选地，所述抗体可进一步被修饰以带有可检测的标记，例如可以被胶体金标记。
56.在一个实施方式中，所述受试者为通过现行精神障碍诊断和分类系统难以对双相障碍和抑郁障碍进行区分的受试者；可选地，所述现行精神障碍诊断和分类系统为：基于美国精神医学协会的dsm的系统(例如dsm iv或dsm v)、基于世界卫生组织的icd的系统(例如icd-10或icd-11)、和/或基于中国的ccmd(例如ccmd-3)的系统。
57.第二方面，本发明进一步提供了一种能够检测如本发明所述的生物标记物的试纸条。图1是一种示例性的同时检测dmtn、lrrc4、krt13、bpifb1和sdcbp的试纸条的侧视图。如图1所述，本本发明的试纸条包括底板1以及在底板1上依次顺序搭接粘贴样品垫2、样品结合垫4、样品反应垫5和吸水垫6。样品垫2上进一步包括点样区3。
58.底板1用于承载并固定样品垫2、样品结合垫4、样品反应垫5和吸水垫6。在一个实施方式中，底板1的材料可为塑料。
59.样品垫2用于接收样品，其在试纸条的结构中与样品结合垫4搭接。样品垫2与样品结合垫4的搭接方式包括样品垫2搭接在样品结合垫4上方，样品垫2搭接在样品结合垫4下方，和样品垫2和样品结合垫4交错搭接。样品垫2的材料可由玻璃纤维素膜、聚酯纤维素膜或无纺布制成。样品垫2上进一步包括点样区3，此点样区3与此试纸条包裹在试纸卡后从加样孔部位所露出的区域相对应。
60.样品垫2所接受的样品包括血液样品，例如血浆样品或血清样品。样品垫2需要经过溶液处理，包括将样品垫2整体浸润于蛋白封闭剂例如牛血清白蛋白溶液中进行过夜封闭，随后干燥。
61.样品结合垫4分别与样品垫2和样品反应垫5搭接。样品结合垫4与样品反应垫5搭接方式包括样品反应垫5搭接在样品结合垫4上方，样品反应垫5搭接在样品结合垫4下方，和样品反应垫5和样品结合垫4交错搭接。
62.样品结合垫4的上部进一步包被有抗体层(未示出)。所述抗体层包括标记物缀合的抗twf2的第一抗体、标记物缀合的抗tpm1的第二抗体、标记物缀合的抗actr2的第三抗体，标记物缀合的抗capza2的第四抗体，标记物缀合的抗tubb1的第五抗体，以及用作质控的第六抗体。在一个实施方式中，所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。在一个实施方式中，用于与抗体缀合的标记物为胶体金。胶体金和荧光微球可以采用可商购的胶体金。胶体金与抗体的缀合方法是本领域已知的。
63.样品反应垫5上设置有5条检测带，即检测带a-e，以及一条质控带，即质控带f。在一个实施方式中，样品反应垫上设置有5条检测带和1条质控带。检测带a-e可分别具有dmtn、lrrc4、krt13、bpifb1和sdcbp作为检测抗原。检测带a-e所包含的抗原dmtn、lrrc4、krt13、bpifb1和sdcbp的顺序可以改变。
64.本发明的试纸条在使用时，待测样品由样品垫向样品结合垫方向扩散，并随后通过包被标记物缀合的抗twf2的第一抗体、标记物缀合的抗tpm1的第二抗体、标记物缀合的抗actr2的第三抗体，标记物缀合的抗capza2的第四抗体，标记物缀合的抗tubb1的第五抗
体的样品结合垫。
65.如果待测样品中含有dmtn、lrrc4、krt13、bpifb1和sdcbp的一种或几种时，相应dmtn、lrrc4、krt13、bpifb1和sdcbp就会和样品结合垫上相应的标记物缀合的抗体相结合，由此掩蔽此抗体上相应的抗原位点。随后，此被掩蔽的抗体会继续通过样品反应垫，由于其抗原结合位点已被掩蔽，导致其无法再与样品反应垫上设置的相应抗原相结合。因此，此抗体带有的标记，例如胶体金标记无法在样品反应垫上的检测线处聚集，进而不能显色。视觉上，此挑对应的检测线不显色或显色较浅。反之，如果待测样品中不含有dmtn、lrrc4、krt13、bpifb1和sdcbp的一种或几种时，样品结合垫上相应的标记物缀合的抗体则将可以与样品反应垫上设置的相应抗原相结合，因此相应的检测线显色较深。
66.质控带e可以为抗原或者抗体。在一个实施方式中，质控带e为igg抗原。在一个实施方式中，质控带e为抗igg的抗体。
67.吸水垫6可由选自由玻纤材料制成。
68.本发明的试纸条可用于检测存在于人血浆样品中是否存在dmtn、lrrc4、krt13、bpifb1和sdcbp，尤其是是否存在过量高表达的dmtn、lrrc4、krt13、bpifb1和sdcbp，所述生物标记物的表达水平的上调提示所述患者患有双相障碍。
69.所述生物标记物一种或者多种的表达水平的为正常人以及抑郁患者相比的1.2倍及以上提示所述患者患有双相障碍。
70.在一个实施方式中，本发明进一步提供了一种同时检测dmtn、lrrc4、krt13、bpifb1和sdcbp的试纸条，其特征在于，所述试纸条包括底板以及在底板上依次顺序搭接粘贴如下部件：
71.(i)样品垫，
72.(ii)样品结合垫，其中所述样品结合垫的上部进一步包被有抗体层，其中所述抗体层包括标记物缀合的抗dmtn的第一抗体、标记物缀合的抗lrrc4的第二抗体、标记物缀合的抗krt13的第三抗体，标记物缀合的抗bpifb1的第四抗体，标记物缀合的抗sdcbp的第五抗体，以及用作质控的第六抗体，
73.(iii)样品反应垫，其中所述样品反应垫上设置有5条检测带和1条质控带，其中，
74.iii-a)所述检测带分别为包被有dmtn的第一检测带，包被有lrrc4的第二检测带，包被有krt13的第三检测带，包被有bpifb1的第四检测带，和包被有sdcbp的第五检测带，
75.(iii-b)所述质控带固定有用作质控的抗原或抗体，和
76.(iv)吸水垫。
77.第三方面，本发明进一步提供了一种能够检测如本发明所述的生物标记物的试纸卡。图2是一种示例性的同时检测dmtn、lrrc4、krt13、bpifb1和sdcbp的试纸卡的俯视图。对图2与图1相同的附图标记不再进行重复描述。
78.如图2所示，试纸卡包括试纸条，和包覆所述的试纸条的外壳，其中所述外壳包括：设置有加样孔9和检测窗10的卡盖7，以及与所述卡盖7彼此连接的底座8。
79.加样孔9开口于样品垫2的上侧，以暴露出样品垫2的部分区域。所暴露出的样品垫2的部分区域对应于图1的点样区3。检测窗10开口于样品反应垫3的上侧，以暴露出检测带a-e和质控带f的全部区域。试纸卡的设计使得试纸条更加易于携带和保存。而且，试纸卡可实现在相应的检测仪中对试纸条检测结果的定量分析。
80.在一个实施方式中，本发明进一步提供了一种同时检测dmtn、lrrc4、krt13、bpifb1和sdcbp的试纸卡，其特征在于，所述试纸卡包括：
81.(i)本发明的试纸条，和
82.(ii)包覆本发明的试纸条的外壳，其中所述外壳包括：
83.(ii-a)设置有加样孔和检测窗的卡盖，其中所述加样孔开口于所述样品垫的上侧，以暴露出所述样品垫的部分区域，所述检测窗开口于所述样品反应垫的上侧，以暴露出所述检测带和所述质控带的全部区域，和
84.(ii-b)与所述卡盖彼此连接的底座。
85.实施例
86.以下实施例以举例的方式进一步说明本发明。应当理解，本发明不限于如下所述的实施例中的任何一个。
87.i.实验材料和方法
88.本部分描述了实施例中实验所采用的实验方法和材料。
89.1.入组标准和样品采集
90.本研究经北京安定医院伦理委员会批准(伦理批准(2017)科研(24)号)。从所有参与者那里都获得了书面知情同意书。
91.1.1bpd和mdd患者招募标准
92.招募北京安定医院就诊的门诊患者及社区健康志愿者采集粪便样本，纳入标准如下：
93.(1)年龄18-65岁，性别不限，符合精神疾病诊断与统计手册第四版(dsm-iv)抑郁障碍、双相障碍诊断标准的患者；
94.(2)所有患有mdd的患者都经历过抑郁发作(简称mdd)，bpd患者目前患有抑郁症，但非躁狂发作期；
95.(3)汉密尔顿抑郁量表-17项(hamd-17)评和年轻躁狂评分量表(ymrs)用于评估mdd或bpd的严重程度；
96.(3)有一定文化程度，能够配合完成评估及随访。
97.1.2健康对照招募标准
98.(1)性别、年龄、教育程度、居住地等与病例组匹配，诊断评估不符合抑郁障碍诊断；
99.(2)经dsm-iv临床定式访谈评定无精神疾病；
100.(3)签署知情同意书。
101.1.3排除标准:
102.(1)共患精神科其他疾病的患者；
103.(2)共患严重的躯体疾病且目前治疗不稳定的患者；
104.(3)妊娠及哺乳期妇女；
105.(4)受试者正在参加其他临床试验。
106.最终招募抑郁症患者83例，双向抑郁症患者73例，健康对照78例。
107.1.4样品采集
108.每份人血液样品制备为人血浆样品200ul，血浆样品的制备包括以下步骤：采集血
液样本，使用edta血常规管(含抗凝剂)，混匀血液和抗凝剂，离心，用移液器将血浆转移到eppendorf离心管中，立即添加蛋白酶抑制剂，冷冻样品(-80℃)。
109.2.质谱样品的制备
110.2.1高丰度蛋白质的去除：在配备安捷伦多重亲合去除柱-人类-14(agilent multi affinity removal column-human-14)的agilent 1290infinity ii液相色谱系统上对高丰度蛋白质进行去除，操作按照使用手册进行。
111.2.2用于数据非依赖性采集(dia)质谱分析的肽样品的制备
112.血浆蛋白质用三氯乙酸(tca)溶液进行沉淀，用20mm(2-羧乙基)膦盐酸盐(tcep)进行还原并用40mm碘乙酰胺进行烷基化。将混合物用胰蛋白酶以胰蛋白酶:蛋白质为1/100(w/w)的比例在37℃消化过夜。使用monospinc18柱(glscience，东京，日本)对裂解物进行脱盐，然后真空离心至干燥。干燥的肽在dia分析之前进行复溶。
113.2.3用于谱文库生成的肽样品的制备
114.混合来自每个样品的肽段以获得总量约80-100ug的肽段混合物，然后真空离心至干燥。干燥的肽在含有2％乙腈(acn)的milli-q水中复溶以用于分级分离(fractionation)。
115.3.用于数据非依赖性采集(data dependent analysis,dia)质谱分析的dia数据库的构建
116.采用的色谱柱为waters acquity uplc peptide beh c18,300a,1.7um,1mm*150mm(waters,cat#:186005594)
117.3.1肽段分级缓冲液的配制
118.100x储备液(2m氨水，ph 10.5)，流动相工作液包含：缓冲液a(97％h2o，2％乙腈，1x储备液)，缓冲液b(2％h2o，97％乙腈，1x储备液)。
119.3.2用肽段高ph反相分级的缓冲液a溶解上述2中已除盐的肽段。
120.3.3液相设置：
121.流速：0.1ml/min，柱温箱温度：50℃，波长：214nm；带宽：12nm
122.梯度设置：
[0123][0124]
[0125]
3.4主馏分共30个馏分，根据早段、中段和晚段合并成三个馏分，即：
[0126]
f1＝tube 1+tube 31
[0127]
f2＝tube 2+tube 32
[0128]
f3＝tube 3+tube 33
[0129]
..........
[0130]
f30＝tube 30+tube60
[0131]
将早段馏分(0
–
4min)和晚段馏分(64
–
68min)合并成f0，一共产生了31个馏分。
[0132]
3.5样品脱盐及溶解
[0133]
馏分合并完后离心干燥，-80℃保存。在质谱分析前，0.1％甲酸溶解样品，至样品终浓度为200ng/μl，加入用作指示经验保留时间的试剂irt，16000
×
g离心30min，取上清。
[0134]
4.dia lc-ms/ms分析
[0135]
所有31个馏分样品都在离子迁移谱四极杆飞行时间质谱仪(timstof pro)上结合纳升高效液相nanoelute和电喷雾离子源进行分析。
[0136]
样品分析时的dia质谱方法：我们将四级杆隔离窗口定义为tims扫描时间的函数，以实现所有施加电压的无缝和同步斜坡。根据m/z离子迁移率平面，我们为单次100毫秒tims扫描定义了4个窗口，每个dia循环64个窗口。在pasef msms扫描期间，碰撞能量作为迁移率的函数从1/k0＝1.6vs/cm2时的59ev线性上升到1/k0＝0.6vs/cm2时的20ev。
[0137]
5.dia样品数据分析
[0138]
上述得到的原始文件数据搜索使用由biognosys开发的spectronaut完成(14.0版本)。数据库的建立是使用spectronaut的pulsar数据库搜索引擎从dda-pasef原始数据生成的。对于随后的dia-pasef数据的目标分析，样品的dia文件使用spectronaut默认设置进行处理，只有xic提取窗口的校正因子根据厂家建议设置为0.8，母离子和蛋白质水平的p值设置为《1％。每个患者样本都被视为生物重复样品。从每个样品中抽取同等体积样品混合作为质量控制样品，每运行约12个样品后插入一个质量控制样品。所有质量控制的样品中定量蛋白的中值变异系数在蛋白质水平上为18.6％。
[0139]
6.机器学习
[0140]
首先基于训练集蛋白组数据利用lasso回归模型，即无偏地估计在mdd和bpd这两种疾病病人中显示差异表达的多个(dep)蛋白在区分这两种疾病中所做的贡献。其基本思想是构造一个惩罚函数，从输入变量中(每个蛋白在mdd和bpd入组病人中的质谱定量信息)选择与输出参数(判断为bpd或者是mdd病人)具有强相关性的主要变量，并建立一个细化的回归模型，筛选出与鉴别bpd与mdd密切相关的蛋白生物标志物，达到特征选择的目的。我们同时采取交叉验证进行内部验证构造的惩罚函数可计算出经上述过程选取的标志物在验证集样品中的表现。其次，我们利用roc曲线评估基于上述模型选取的标志物的效果。roc曲线的x轴为真阴性率及特异性(false positive rate，specificity)，y轴为真阳性率及灵敏性(true positive rate，sensitivity)，坐标轴范围分别为[1,0]或者[100％，0]，及[0,1]或者[0,100％]。曲线与坐标轴之间的面积叫做曲线下面积(area under curve，auc)。其中auc取值范围是[0.5,1]或者[50％,100％]，数值越高就有越有较高的准确性。lasso和roc都通过r软件进行计算。
[0141]
ii.实验结果
[0142]
1.差异化表达的蛋白质(dep)的检测
[0143]
采用前述部分i中方法进行差异化表达的蛋白质(dep)的检测。蛋白标志物按照bpd与mdd比较，表达差异的倍数从高到底排列，同时还列出了t-test分析的p值，p《0.05为具有显著意义。
[0144]
表1差异化表达蛋白
[0145]
[0146]
[0147]
[0148][0149]2–
pca分析显示蛋白数据可以清晰区分健康、bpd与mdd患者
[0150]
对于表1中所示的dep蛋白的bpd与mdd患者中的数据进行pca主成分分析，显示bpd与mdd及健康对照根据蛋白组表达可以实现清晰地分别聚集。结果显示在图4中。
[0151]3–
火山图分析显示bpd与mdd患者的蛋白组存在显著上调的蛋白
[0152]
如图5所示，火山图按照每个检测出的蛋白在bpd与mdd t-检验比较中变化的倍数和p值，这中间显示红色的点代表与mdd相比，bpd中显著上调≥2倍，p《0.05的蛋白，蓝色表示显著下调≥2倍，p《0.05的蛋白。
[0153]
在后续实验中，同时通过利用建模及机器学习的方式，对于区分mdd和bpd这两类疾病的标志物选出，并在训练集和测试集中测试其准确性，以盼筛选有实际临床应用价值的标志物。
[0154]
4-lasso建模筛选标志物
[0155]
表2 lasso模型筛选获得的5个最佳的生物标志物
[0156]
uniprot id标志物名称lasso coefq08495dmtn-0.18q9hbw1lrrc4-0.14p13646krt13-0.11q8tdl5bpifb1-0.092o00560sdcbp-0.086
[0157]
经lasso无偏地估计在mdd和bpd这两种疾病病人中显示显著上调的标志物在区分这两种疾病中所做的贡献，筛选得到如本表中生物标志物。coef代表此标志物所做贡献，根据其绝对值大小排列得出排名前五的标志物，此值不为零即代表该标志物有所贡献。
[0158]
从lasso获得的5个最佳的生物标志物可以看出，这5个标志物并非是在质谱中显示出从差异倍数及p值上看显著性最强数据的5个标志物，但lasso模型在对标志物贡献进行综合分析后，找到了与质谱结果不同的5个最佳的生物标志物。这体现了lasso建模的重要性。
[0159]
5-lasso筛选标志物在bpd和md病人样品中的蛋白质谱定量数据
[0160]
对lasso模型筛选获得5个最佳的生物标志物的质谱结果进一步分析。图6显示出经lasso筛选出来的dmtn、lrrc4、krt13、bpifb1和sdcbp在bpd与mdd病人血浆中的蛋白定量结果散点图。每个点代表一个病人的质谱定量数据，该数据可以直观代表这些标志物在病人血浆中的表达水平及范围。
[0161]
6-利用roc曲线验证上述标志物对于区分bpd与mdd的准确性
[0162]
利用接受操作特征曲线下的面积(auc)用于评估生物标志物在区分即鉴别诊断bpd与mdd受试者中的选择准确性，值越高代表这些标志物越准。如图7所示，dmtn、lrrc4、krt13、bpifb1和sdcbp显示出在鉴别诊断bpd与mdd受试者中的选择准确性。
[0163]
用高深度高精度的质谱的方法，寻找到在bpd与mdd直接差异表达的蛋白经机器学习进行无偏移地筛选，获得的蛋白标志物组合，与仅仅用p值或者蛋白表达差异倍数进行排序获得的标志物相比，提高了在扩大样品及多中心验证中重复的几率，为下一步的临床应用打下了基础。同时值得注意的是，在筛选获得的5个标志物中，dmtn与lrcc4都被报道表达在神经系统，而且有实验证据表明可参与调控神经系统病变。dmtn可以保护由人类阿尔兹海默症相关淀粉样前体蛋白app(amyloid-beta precursor protein)异位表达在模式动物中所引起的发育和行为缺陷(hopkins 2013)，lrcc4直接参与对脑脊髓炎中的神经元起保护作用(zhang et al.,2021)。这些数据也为本发明所发现的标志物和双相抑郁在内的神经系统病存在潜在关联提供了理论依据。

技术特征：
1.用于检测来自受试者的样品中生物标记物的试剂在制备用于区分或鉴别诊断双相障碍和抑郁障碍的试纸条中的用途，其中，其中所述受试者疑似患有精神障碍但难以确定该精神障碍为双相障碍或抑郁障碍，所述生物标记物包括选自以下的一种或多种：twf2、tpm1、actr2、capza2、tubb1、nap1l1、tubb、ube2l3、ef1g、psmb3、prdx5、tuba4a、sh3bgrl、coro1c、cttn、dmtn、pcmt1、krt13、arpc5、cald1、usp14、sh3bgrl2、dbnl、anxa3、pgm2、capza1、adh4、ube2v2、arpc2、gmpr、pdia6、ywhaq、pa2g4、anxa5、snx12、mapre2、lims1、dynll1、sumo3、mapre1、bin2、urod、lrrc4、pygb、serpinb6、pde5a、myl6、mob1b、septin11、nsfl1c、unc13d、boc、slc9a3r1、g6pd、sema3a、ptpn6、dbi、uba7、otub1、fhl1、ola1、atp6v1a、clic4、psmb8、gdf2、snx3、gnb2、arhgap18、dnm1l、hk1、rad23a、dcn、ank1、cct8、coro1b、aco1、eif6、stxbp2、naxe、cln5、txnl1、mpp1、cct3、bpifb1、pdcd6ip、pabpc1、pla2g15、txndc17、fh、xpnpep1、sdcbp、psmb5、pdlim5、psmd2、tpm3、septin6、actr3、cast、vasp、acat2、pafah1b3、lod4、cpb1、ilk、cndp2、pygl、prf1、pdlim7、lgalsl、yars1、crkl、wdr44、hpse、adh5、blvra、ap1g1、cavin2和cbr1。2.如权利要求1所述的用途，其中所述生物标记物包括选自以下一种或多种：dmtn、lrrc4、krt13、bpifb1和sdcbp。3.如权利要求1或2所述的用途，其中所述生物标记物为dmtn、lrrc4、krt13、bpifb1和sdcbp的组合。4.如权利要求1-3中任一项所述的用途，其中所述样品为血液样品，优选所述样品是血浆样品。5.如权利要求1-4中任一项所述的用途，其中所述生物标记物的表达水平的上调提示所述患者患有双相障碍；所述生物标记物一种或者多种的表达水平的为正常人以及抑郁患者相比的1.2倍及以上提示所述患者患有双相障碍。6.如权利要求1-5中任一项所述的用途，其中所述生物标记物的表达水平通过免疫测定或质谱测定。7.如权利要求1-5中任一项所述的用途，其中所述生物标记物的表达水平通过能够特异性结合生物标记物的试剂来检测；可选地，所述生物标记物的表达水平通过靶向生物标记物的抗体来检测；可选地，所述抗体选自单克隆抗体或多克隆抗体。8.如权利要求1-7中任一项所述的用途，其中所述试剂可进一步被修饰以带有可检测的标记；优选地，所述抗体可进一步被修饰以带有可检测的标记，例如胶体金标记。9.如权利要求1-8中任一项所述的用途，其中所述受试者为通过现行精神障碍诊断和分类系统难以对双相障碍和抑郁障碍进行区分的受试者；可选地，所述现行精神障碍诊断和分类系统为：基于美国精神医学协会的dsm的系统(例如dsmiv或dsm v)、基于世界卫生组织的icd的系统(例如icd-10或icd-11)、和/或基于中国的ccmd(例如ccmd-3)的系统。10.一种能够检测如权利要求1-3中任一项所述的生物标记物的试纸条，其特征在于，所述试纸条包括底板以及在底板上依次顺序搭接粘贴如下部件：(i)样品垫，(ii)样品结合垫，其中所述样品结合垫的上部进一步包被有抗体层，其中所述抗体层包括标记物缀合的抗如权利要求1-3中任一项所述的生物标记物的抗体，以及用作质控的抗体，
(iii)样品反应垫，其中所述样品反应垫上设置有检测带和质控带，其中，iii-a)所述检测带包被有如权利要求1-3中任一项所述的生物标记物的检测带，(iii-b)所述质控带固定有用作质控的抗原或抗体，和(iv)吸水垫。11.如权利要求10所述的试纸条，其特征在于，(ii)样品结合垫，其中所述样品结合垫的上部进一步包被有抗体层，其中所述抗体层包括标记物缀合的抗dmtn的第一抗体、标记物缀合的抗lrrc4的第二抗体、标记物缀合的抗krt13的第三抗体，标记物缀合的抗bpifb1的第四抗体，标记物缀合的抗sdcbp的第五抗体，以及用作质控的第六抗体，(iii)样品反应垫，其中所述样品反应垫上设置有5条检测带和1条质控带，其中，iii-a)所述检测带分别为包被有dmtn的第一检测带，包被有lrrc4的第二检测带，包被有krt13的第三检测带，包被有bpifb1的第四检测带，和包被有sdcbp的第五检测带，(iii-b)所述质控带固定有用作质控的抗原或抗体。12.一种能够检测如权利要求1-3中任一项所述的生物标记物的试纸卡，其特征在于，所述试纸卡包括：(i)权利要求10或11所述的试纸条，和(ii)包覆权利要求10或11所述的试纸条的外壳，其中所述外壳包括：(ii-a)设置有加样孔和检测窗的卡盖，其中所述加样孔开口于所述样品垫的上侧，以暴露出所述样品垫的部分区域，所述检测窗开口于所述样品反应垫的上侧，以暴露出所述检测带和所述质控带的全部区域，和(ii-b)与所述卡盖彼此连接的底座。

技术总结
本发明涉及双相障碍诊断生物标记物，提供了一种用于区分或鉴别诊断双相障碍和抑郁障碍的方法，包括确定来自受试者的样品中的生物标记物的表达水平，所述生物标记物为DMTN、LRRC4、KRT13、BPIFB1和SDCBP，其中所述生物标记物的表达水平的升高提示所述患者患有双相障碍。本发明还提供了利用上述生物标记物的检测来区分或鉴别诊断双相障碍和抑郁障碍的试纸条和/或试纸卡。本发明的方法、试纸条和/或试纸卡可以特异性地诊断双相障碍。试纸卡可以特异性地诊断双相障碍。


技术研发人员：王刚 黄超兰 陈扬 杨健 高帅鑫
受保护的技术使用者：北京大学
技术研发日：2022.03.16
技术公布日：2023/9/22