一种透明质酸-蛋白偶联体的制备方法及其应用与流程

1.本发明涉及透明质酸衍生物的技术领域，尤其涉及一种透明质酸-蛋白偶联体的制备方法及其应用。


背景技术：

2.透明质酸是一种天然存在的生物聚合物，在细菌和包括人类在内的高等动物体内具有重要的生物学功能。透明质酸在临床、组织工程修复及基因和药物输送方面有许多应用。因透明质酸具有良好的生物相容性，从而在生物发育和机体损伤修复过程中发挥重要作用。
3.人生长素对人体组织如骨骼、肌肉、结缔组织、毛发和皮肤等有促进生长的功能，可增进蛋白质和核酸的合成，调节糖类和脂类代谢。目前，生长素的给药方式为注射剂，因此开发其他给药系统具有显著经济效益和社会效益。
4.cn 113929792a公开了将透明质酸6-位羧基与带有丙二醇结构单元的酰肼偶联形成酰肼化合物，继之以用氧化剂氧化丙二醇侧链为醛基，来制备原位交联水凝胶。
5.cn 107019706a公开了顺铂-醛基化透明质酸纳米复合物的制备方法，其醛基化透明质酸的制备方法是将透明质酸的2-位-和3-位羟基氧化开环为醛基，从而形成亚胺键和配位键连接的顺铂-透明质酸复合物。
6.cn 113508143a公开了利用商品化的甘油改性透明质酸和商品化的酰肼改性透明质酸制备原位交联水凝胶的方法。
7.cn 115836987a公开了利用商品化的不同分子量透明质酸和商品化的qt40＠和phycoderm＠的不同比例的组合物(即-混合物)的制备方法。
8.cn 110907641b公开了一种透明质酸检测试剂盒及检测方法。
9.cn 104302670a公开了制造用于经皮给药的透明质酸-蛋白结合体的方法。该方法首先将透明质酸钠通过氧化的方法转变成醛修饰的玻尿酸，然后将醛修饰的玻尿酸与蛋白在缓冲溶液中反应24h，继之以加入氰基硼氢化钠和肼基甲酸乙酯反应24h。但是该方法在制备醛修饰的玻尿酸时，其取代度不能稳定在一个固定值，且用这种方法制备的透明质酸-生长素结合体产率不高，且该种制备方法复杂、不能应用至批量生产；有大量的生长素未反应滞留在反应体系中。
10.综上所述，如何设计一种制备方法简单且适用于工业化生产的透明质酸-蛋白偶联体的制备方法，是目前本领域技术人员亟待解决的问题。


技术实现要素：

11.本发明实施例的主要目的在于提出一种透明质酸-蛋白偶联体的制备方法及其应用，旨在设计一种工艺简单且适用于工业化生产的透明质酸-蛋白偶联体的制备方法。
12.本发明解决上述技术问题的技术方案是，提供一种透明质酸-蛋白偶联体的制备方法，包括：
13.在反应釜中加入纯化水，透明质酸分批加入反应釜中，搅拌至溶解，避光；
14.加入高碘酸钠，并搅拌；
15.加入乙二醇，淬灭反应；
16.对淬灭反应物进行超滤纯化，得ha-ald；
17.[化学式1]
[0018][0019]
将ha-ald加入至新的反应釜中，避光；
[0020]
加入醋酸钠缓冲溶液，搅拌至溶解；
[0021]
调整反应釜温度为2℃-8℃，加入hgh，并搅拌；
[0022]
加入氰基硼氢化钠；
[0023]
加入肼基甲酸乙酯，得透明质酸-蛋白偶联体；
[0024]
[化学式2]
[0025][0026]
其中，被醛基化修饰的透明质的分子量为10kda-2200kda；
[0027]
被醛基化修饰的透明质酸的取代度为10％-30％；
[0028]
n-末端氨基-蛋白质的分子量为22kda-75kda。
[0029]
在本发明一实施例中，所述对淬灭反应物进行超滤纯化，得ha-ald的步骤中，超滤条件为：前期进液端压力0.12mpa，10psi；后期进液端压力为0.15mpa，15psi；水温为22℃-26℃，每滤出5l液体，加5l水，至滤出液电导率为5μs-7μs；浓缩液体。
[0030]
在本发明一实施例中，所述对淬灭反应物进行超滤纯化，得ha-ald的步骤包括：
[0031]
采用超滤器对淬灭反应物超滤纯化；
[0032]
将纯化后的液体置于冻干机中，设置温度为-45℃，保持3h；
[0033]
抽真空至真空度为0.2mbar，升温至-10℃(升温时长60min)，保持4h；
[0034]
升温至25℃(升温时长90min)，保持14h；
[0035]
抽真空14h。
[0036]
在本发明一实施例中，所述加入肼基甲酸乙酯，得透明质酸-蛋白偶联体的步骤之后还包括，对反应后的溶液进行超滤；超滤的条件为：进液端压力0.09mpa，超滤液为pbs；每滤出10l液体，向溶液中加入10lpbs，循环超滤9次。
[0037]
在本发明一实施例中，所述加入高碘酸钠，并搅拌的步骤中，高碘酸钠与透明质酸的摩尔比为2:1。
[0038]
在本发明一实施例中，所述加入乙二醇，淬灭反应的步骤中，乙二醇与透明质酸的质量比为1:1。
[0039]
在本发明一实施例中，所述加入醋酸钠缓冲溶液，搅拌至溶解的步骤中，加入醋酸钠缓冲溶液配成5g/l的ha-ald溶液，醋酸钠缓冲溶液ph为5至6.5。
[0040]
在本发明一实施例中，所述调整反应釜温度为2℃-8℃，加入hgh，并搅拌的步骤中，ha-ald与hgh的摩尔比为1:3。
[0041]
在本发明一实施例中，所述加入肼基甲酸乙酯的步骤中，肼基甲酸乙酯的量是溶液中醛基的量的5倍。
[0042]
为解决上述技术问题，本发明还提出根据上述透明质酸-蛋白偶联体的制备方法制备的透明质酸-蛋白偶联体在生物医药和医学美容的应用。
[0043]
本发明的技术方案，本技术将富含羟基的透明质酸用氧化剂氧化，形成含醛基的醛基化透明质酸，在特定ph条件下，将蛋白的n-末端氨基与醛基化透明质酸反应，形成亚胺化合物，最后亚胺化合物经还原剂的还原胺化反应，形成透明质酸-蛋白偶联体。本发明的制备方法操作简单，制备周期短，原料生产工艺成熟，适合于规模化生产。制得的透明质酸-蛋白偶联体生物相容性好，适合应用于生物医药和医学美容领域。
附图说明
[0044]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
[0045]
图1为本发明所述ha-醛-tbc的化学流程示意图；
[0046]
图2为本发明所述透明质酸-蛋白偶联体的化学流程示意图；
[0047]
图3为本发明所述ha-醛-tbc的取代度烘干核磁图；
[0048]
图4为本发明生长素在210nm和280nm波长下的色谱图；
[0049]
图5为本发明所述透明质酸-蛋白偶联体在210nm和280nm波长下的色谱图；
[0050]
图6为本发明所述透明质酸-蛋白偶联体的的分子量分析图；
[0051]
图7为本发明所述透明质酸-蛋白偶联体中每分子ha链对应的hgh分子数量及基于hgh投料量的生物结合图；
[0052]
图8为本发明所述透明质酸-蛋白偶联体和hgh的圆二色谱图；
[0053]
图9本发明所述透明质酸-蛋白偶联体、hgh及ha的经皮给药活性分析；
[0054]
图10为本发明所述透明质酸-蛋白偶联体的制备流程图。
具体实施方式
[0055]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0056]
需要说明，本发明实施例中所有方向性指示(诸如上、下、左、右、前、后
……
)仅用于解释在某一特定姿态(如附图所示)下各部件之间的相对位置关系、运动情况等，如果该特定姿态发生改变时，则该方向性指示也相应地随之改变。
[0057]
另外，在本发明中如涉及“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“若干”、“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
[0058]
在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“连接”、“固定”等应做广义理解，例如，“固定”可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系，除非另有明确的限定。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
[0059]
另外，本发明各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。
[0060]
本发明提出一种透明质酸-蛋白偶联体的制备方法，旨在设计一种工艺简单且适用于工业化生产的透明质酸-蛋白偶联体的制备方法。
[0061]
下面将在具体实施例中对本发明提出的透明质酸-蛋白偶联体的制备方法的具体结构进行说明：
[0062]
在本实施例的技术方案中，如图10所示，一种透明质酸-蛋白偶联体的制备方法，包括：
[0063]
s10：在反应釜中加入纯化水，透明质酸分批加入反应釜中，搅拌至溶解，避光；
[0064]
可以理解地，反应釜的搅拌速度为300r/min左右，反应釜的温度设置为25℃-26℃，透明质酸分批缓慢加入反应釜，搅拌30min，至固体全部溶解，用锡纸将反应釜包裹，形成避光的反应环境。
[0065]
s20：加入高碘酸钠，并搅拌；
[0066]
可以理解地，本技术通过采用高碘酸钠作为氧化剂，高碘酸钠与透明质酸的摩尔比为2:1，反应时长为2小时-10小时，以在透明质酸的2位和3位羟基开环为醛基。
[0067]
s30：加入乙二醇，淬灭反应；
[0068]
可以理解地，通过乙二醇进行猝灭反应1小时，以使溶液中的高碘酸钠与透明质酸不会再发生反应，进而使得透明质酸的取代度稳定在一个稳定的值。
[0069]
s40：对淬灭反应物进行超滤纯化，得ha-ald；
[0070]
可以理解地，超滤器的前期进液端压力0.12mpa，10psi；后期进液端压力为0.15mpa，15psi。水温保持在24℃左右，每滤出5l液体，加5l水，共超滤16次；至滤出液电导率为5-7μs；最后浓缩液体至5l左右；用1l水进行洗膜，膜洗液加入到超滤浓缩液中；其中，保持水温为24℃左右，可以降低ha-ald的黏度，使ha-ald的纯净度提高，也能缩短超滤时间。前期进液端压力小是因为溶液中小分子杂质多，压力小就可以将小分子杂质都滤出去，后期进液端压力大，是因为溶液中大部分都是大分子物质，需要压力大一些才能将小分子杂质都滤出去。该种超滤方法适合大规模生产的工艺参数。
[0071]
ha-ald的冷冻处理，将纯化后的ha-ald液体放入冻干机，设置板层温度为-45℃，维持3小时，然后在30min内抽真空，真空度抽到0.2mbar；设置板层温度为-10℃，升温时间60min，维持4小时；设置板层温度为25℃，升温时间90min；抽极限真空14小时。共冻干24小
时；可节约冻干成本，更适合工业化生产。
[0072]
[化学式1]
[0073][0074]
s50：将ha-ald加入至新的反应釜中，避光；
[0075]
可以理解地，在ha-ald与hgh反应时，溶液中还有大量的醛基，如果不避光会使醛基不稳定，从而使ha-ald与hgh的结合率下降。
[0076]
s60：加入醋酸钠缓冲溶液，搅拌至溶解；
[0077]
可以理解地，加入醋酸钠缓冲溶液配成5g/l的ha-ald溶液，醋酸钠缓冲溶液的ph为5至6.5，优选地醋酸钠缓冲溶液的ph为5.5。
[0078]
s70：调整反应釜温度为2℃-8℃，加入hgh，并搅拌；
[0079]
可以理解地，设置反应釜各项参数，反应釜中的温度设置为2℃-8℃左右，hgh沿投料口缓慢加入反应釜中，
[0080]
s80：加入氰基硼氢化钠；
[0081]
可以理解地，加入醛基5倍量的氰基硼氢化钠后，反应18小时。
[0082]
s90：加入肼基甲酸乙酯，得透明质酸-蛋白偶联体；
[0083]
在2℃-8℃条件下反应18小时，本技术根据生长素的性质，探索出在2℃-8℃条件下反应18h，这个反应条件既能保证结合率为96％。
[0084]
可以理解地，加入醛基5倍量肼基甲酸乙酯到反应釜中，低温封闭反应24小时，肼基甲酸乙酯用于封闭未能与蛋白反应的醛基。
[0085]
[化学式2]
[0086][0087]
其中，被醛基化修饰的透明质的分子量为10kda-2200kda；
[0088]
优选地，被醛基化修饰的透明质的分子量为100kda。
[0089]
被醛基化修饰的透明质酸的取代度为10％-30％；
[0090]
优选地，被醛基化修饰的透明质酸的取代度为16％。
[0091]
n-末端氨基-蛋白质的分子量为22kda-75kda。
[0092]
可以理解地，本技术将富含羟基的透明质酸用氧化剂氧化，形成含醛基的醛基化透明质酸，在特定ph条件下，将蛋白的n-末端氨基与醛基化透明质酸反应，形成亚胺化合物，最后亚胺化合物经还原剂的还原胺化反应，形成透明质酸-蛋白偶联体。本发明的制备方法操作简单，制备周期短，原料生产工艺成熟，适合于规模化生产。制得的透明质酸-蛋白偶联体生物相容性好，适合应用于生物医药和医学美容领域。
[0093]
在本发明一实施例中，所述对淬灭反应物进行超滤纯化，得ha-ald的步骤中，超滤
条件为：前期进液端压力0.12mpa，10psi；后期进液端压力为0.15mpa，15psi；水温为22℃-26℃，每滤出5l液体，加5l水，至滤出液电导率为5μs-7μs；浓缩液体。(用1l水进行洗膜，膜洗液加入到超滤浓缩液中。其中保持水温为24℃左右，可以降低ha-ald的黏度，使ha-ald的纯净度提高，也能缩短超滤时间。前期进液端压力小是因为溶液中小分子杂质多，压力小就可以将小分子杂质都滤出去，后期进液端压力大，是因为溶液中大部分都是大分子物质，需要压力大一些才能将小分子杂质都滤出去)
[0094]
在本发明一实施例中，所述对淬灭反应物进行超滤纯化，得ha-ald的步骤包括：
[0095]
采用超滤器对淬灭反应物超滤纯化；
[0096]
将纯化后的液体置于冻干机中，设置温度为-45℃，保持3h；
[0097]
抽真空至真空度为0.2mbar，升温至-10℃(升温时长60min)，保持4h；
[0098]
升温至25℃(升温时长90min)，保持14h；
[0099]
抽真空14h。
[0100]
在本发明一实施例中，所述加入肼基甲酸乙酯，得透明质酸-蛋白偶联体的步骤之后还包括，对反应后的溶液进行超滤；超滤的条件为：进液端压力0.09mpa，超滤液为pbs(0.01m，ph＝7.2-7.4)；每滤出10l液体，向溶液中加入10lpbs，循环超滤9次。
[0101]
可以理解地，本技术采用超滤的方法进行纯化，超滤所用的膜包截流分子量大小、膜包材质、超滤压力、超滤次数等工艺参数，更适合大规模生产。
[0102]
在本发明一实施例中，所述加入高碘酸钠，并搅拌的步骤中，高碘酸钠与透明质酸的摩尔比为2:1。
[0103]
在本发明一实施例中，所述加入乙二醇，淬灭反应的步骤中，乙二醇与透明质酸的质量比为1:1。
[0104]
在本发明一实施例中，所述加入醋酸钠缓冲溶液，搅拌至溶解的步骤中，加入醋酸钠缓冲溶液配成5g/l的ha-ald溶液，醋酸钠缓冲溶液ph为5至6.5。
[0105]
在本发明一实施例中，所述调整反应釜温度为2℃-8℃，加入hgh，并搅拌的步骤中，ha-ald与hgh的摩尔比为1:3。
[0106]
在本发明一实施例中，所述加入肼基甲酸乙酯的步骤中，肼基甲酸乙酯的量是溶液中醛基的量的5倍。
[0107]
本发明还提出根据透明质酸-蛋白偶联体的制备方法制备的透明质酸-蛋白偶联体在生物医药和医学美容的应用。
[0108]
实施例1
[0109]
ha-ald的制备
[0110]
向20l玻璃反应釜中加入10l的纯化水，调节搅拌速度至300r/min左右，水浴锅加热温度设置为26℃。称取100g透明质酸(ha)，分批缓慢加入到反应釜中，搅拌30min，至固体全部溶解。用锡纸将反应釜包裹住，形成避光环境。
[0111]
调整搅拌速度为247r/min，称取106.20g高碘酸钠(与ha单体的摩尔比为2:1)加入到反应釜中，在25-26℃下反应3小时。
[0112]
称取100g乙二醇加入到反应釜中，淬灭反应1小时。
[0113]
反应停止，用超滤器进行超滤纯化。超滤条件为：前期进液端压力0.12mpa，10psi；后期进液端压力为0.15mpa，15psi.水温保持在24℃，每滤出5l液体，加5l水，共超滤16次。
至滤出液电导率为5-7μs.最后浓缩液体至5l左右。用1l水进行洗膜，膜洗液加入到超滤浓缩液中。其中保持水温为24℃左右，可以降低ha-ald的黏度，使ha-ald的纯净度提高，也能缩短超滤时间。前期进液端压力小是因为溶液中小分子杂质多，压力小就可以将小分子杂质都滤出去，后期进液端压力大，是因为溶液中大部分都是大分子物质，需要压力大一些才能将小分子杂质都滤出去。
[0114]
将纯化后的ha-ald液体放入冻干机，设置板层温度为-45℃，维持3小时，然后在30min内抽真空，真空度抽到0.2mbar；设置板层温度为-10℃，升温时间60min，维持4小时；设置板层温度为25℃，升温时间90min；抽极限真空14小时。共冻干24小时。
[0115]
醛修饰的玻尿酸取代度的测定
[0116]
称取ha-ald固体0.25g，加入到250ml烧瓶中，用锡纸包裹住烧瓶。向烧瓶中加入50ml醋酸/醋酸钠缓冲溶液(ph＝5.2)，搅拌至固体全部溶解。向烧瓶中加入0.19g氰基硼氢化钠，0.42g肼基甲酸乙酯，在24℃下反应24小时。
[0117]
反应结束后，将反应液加入到透析膜中(7kda)，用纯化水进行透析，每隔2小时换一次水，透析24小时左右，其反应试验反应流程如图1所示。
[0118]
透析完的液体倒入平皿，放入烘干箱中，80℃烘干4小时左右。烘干后的固体加入到核磁管，加入0.55ml重水溶解，如图3的ha-醛-tbc的核磁图谱中，在δ＝1.85-1.95ppm的ha的乙酰氨基基团的甲基共振定为内标，δ＝1.3-1.4ppm表示ha-醛-tbc中三个甲基的峰，根据这两个峰的峰面积计算取代度，具体计算公式为取代度＝(1.3-1.4ppm峰面积/9/2)
÷
(1.85-1.95ppm峰面积/3)，计算得到醛修饰玻尿酸的取代度为16％。
[0119]
透明质酸-蛋白偶联体的制备
[0120]
称取40.00gha-ald，加入到20l反应釜中，将反应釜用锡纸包裹住。向反应釜中加入8l醋酸/醋酸钠缓冲溶液(ph＝5.5)，配成5g/l的ha-ald溶液。搅拌1小时左右，至固体全部溶解。
[0121]
设置反应釜制冷机的各项参数，使反应釜中的温度为2℃-8℃。调整搅拌速度为100r/min，将hgh原液26g(ha-ald与hgh的摩尔比为1:3)沿投料口缓慢加入到反应釜中，缓慢搅拌10min左右，使hgh均匀分布在溶液中；然后称取氰基硼氢化钠13.20g(醛基的5倍量)，加入到反应釜中，在2℃-8℃下反应18小时。
[0122]
称取21.80g肼基甲酸乙酯(醛基的5倍量)加入到反应釜中，低温封闭反应24小时，其反应试验反应流程如图2所示。
[0123]
结束反应后，用超滤器进行超滤纯化。超滤条件为：进液端压力0.09mpa，超滤液为pbs(0.01m，ph＝7.2-7.4)。每滤出10l液体，向溶液中加入10lpbs，循环超滤9次。
[0124]
传统的生长素用hplc检测，如图4所示的液相色谱图，在210nm和280nm波长下的hplc分析结果，hgh的出峰时间为19min左右。而本技术最终得到的透明质酸-蛋白偶联体反应液用hplc检测，如图5所示的液相色谱图；在210nm和280nm波长下的hplc分析结果，透明质酸-蛋白偶联体的出峰时间前移了，证明hgh偶联到ha链上。
[0125]
本技术制备的透明质酸-蛋白偶联体用示差折光检测器，在hplc下所测得的分子量结果。取已知分子量的多糖配成一定浓度的溶液作为对照品，ha-hgh配成溶液作为供试品。照分子排阻色谱法，用合适的凝胶柱，以0.2mol/l氯化钠溶液为流动相，柱温35℃，流速为每分钟0.5ml，示差折光检测器。检测结果由gpc软件进行校正计算最终产物的分子量。如
图6所示，透明质酸-蛋白偶联体的重均分子量为24万左右，证明一个ha(10万分子量)上连了6个hgh分子(每分子hgh分子量为2.2万)。
[0126]
如图7所示，透明质酸-蛋白偶联体中每分子ha链对应的hgh分子数量及基于hgh投料量的生物结合率。由图可见无论投料比是多少，生物结合率都可以达到96％以上。
[0127]
如图8所示，比较hgh与透明质酸-蛋白偶联体的圆二色谱(cd)分析结果，hgh图谱峰与ha-hgh图谱峰基本一致，说明偶联到ha链上的hgh二级结构未发生改变。
[0128]
如图9所示，本技术得到的透明质酸-蛋白偶联体、hgh和ha的经皮给药活性分析(a：fitc，b：pbs(空白对照)，c：hgh-fitc，d：ha-fitc，e：透明质酸-蛋白偶联体)由图可见透明质酸-蛋白偶联体有部分样品穿过表皮，有效地传递到了真皮层，本技术制备得到的透明质酸-蛋白偶联体可应用于生物医药和医学美容领域。
[0129]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。

技术特征：
1.一种透明质酸-蛋白偶联体的制备方法，其特征在于，包括：在反应釜中加入纯化水，透明质酸分批加入反应釜中，搅拌至溶解，避光；加入高碘酸钠，并搅拌；加入乙二醇，淬灭反应；对淬灭反应物进行超滤纯化，得ha-ald；[化学式1]将ha-ald加入至新的反应釜中，避光；加入醋酸钠缓冲溶液，搅拌至溶解；调整反应釜温度为2℃-8℃，加入hgh，并搅拌；加入氰基硼氢化钠；加入肼基甲酸乙酯，得透明质酸-蛋白偶联体；[化学式2]其中，被醛基化修饰的透明质的分子量为10kda-2200kda；被醛基化修饰的透明质酸的取代度为10％-30％；n-末端氨基-蛋白质的分子量为22kda-75kda。2.根据权利要求1所述的透明质酸-蛋白偶联体的制备方法，其特征在于，所述对淬灭反应物进行超滤纯化，得ha-ald的步骤中，超滤条件为：前期进液端压力0.12mpa，10psi；后期进液端压力为0.15mpa，15psi；水温为22℃-26℃，每滤出5l液体，加5l水，至滤出液电导率为5μs-7μs；浓缩液体。3.根据权利要求1所述的透明质酸-蛋白偶联体的制备方法，其特征在于，所述对淬灭反应物进行超滤纯化，得ha-ald的步骤包括：采用超滤器对淬灭反应物超滤纯化；将纯化后的液体置于冻干机中，设置温度为-45℃，保持3h；抽真空至真空度为0.2mbar，升温至-10℃(升温时长60min)，保持4h；升温至25℃(升温时长90min)，保持14h；抽真空14h。4.根据权利要求1所述的透明质酸-蛋白偶联体的制备方法，其特征在于，所述加入肼基甲酸乙酯，得透明质酸-蛋白偶联体的步骤之后还包括，对反应后的溶液进行超滤；超滤的条件为：进液端压力0.09mpa，超滤液为pbs(0.01m，ph＝7.2-7.4)；每滤出10l液体，向溶
液中加入10lpbs，循环超滤9次。5.根据权利要求1所述的透明质酸-蛋白偶联体的制备方法，其特征在于，所述加入高碘酸钠，并搅拌的步骤中，高碘酸钠与透明质酸的摩尔比为2:1。6.根据权利要求1所述的透明质酸-蛋白偶联体的制备方法，其特征在于，所述加入乙二醇，淬灭反应的步骤中，乙二醇与透明质酸的质量比为1:1。7.根据权利要求1所述的透明质酸-蛋白偶联体的制备方法，其特征在于，所述加入醋酸钠缓冲溶液，搅拌至溶解的步骤中，加入醋酸钠缓冲溶液配成5g/l的ha-ald溶液，醋酸钠缓冲溶液ph为5至6.5。8.根据权利要求1所述的透明质酸-蛋白偶联体的制备方法，其特征在于，所述调整反应釜温度为2℃-8℃，加入hgh，并搅拌的步骤中，ha-ald与hgh的摩尔比为1:3。9.根据权利要求1所述的透明质酸-蛋白偶联体的制备方法，其特征在于，所述加入肼基甲酸乙酯的步骤中，肼基甲酸乙酯的量是溶液中醛基的量的5倍。10.如权利要求1至9中任一项所述的透明质酸-蛋白偶联体的制备方法制备的透明质酸-蛋白偶联体在生物医药和医学美容的应用。

技术总结
本发明公开一种透明质酸-蛋白偶联体的制备方法及其应用。本发明将富含羟基的透明质酸用氧化剂氧化，形成含醛基的醛基化透明质酸，在特定pH条件下，将蛋白的N-末端氨基与醛基化透明质酸反应，形成亚胺化合物，最后亚胺化合物经还原剂的还原胺化反应，形成透明质酸-蛋白偶联体。本发明的制备方法操作简单，制备周期短，原料生产工艺成熟，适合于规模化生产。制得的透明质酸-蛋白偶联体生物相容性好，制备得到的透明质酸-蛋白偶联体适合应用于生物医药和医学美容领域。药和医学美容领域。药和医学美容领域。


技术研发人员：席玥 许晓冬 孙丛丽 王恩思
受保护的技术使用者：吉林省奇健生物技术有限公司
技术研发日：2023.06.25
技术公布日：2023/9/22