一种编码表达新城疫病毒抗原的信使核酸分子的制作方法

1.本发明涉及兽用生物制品技术领域，具体的，涉及基于mrna的表达新城疫病毒蛋白抗原序列片段、变体或衍生物，可用于预防和治疗新城疫病毒感染导致的疾病的用途。


背景技术：

2.新城疫病毒(newcastle disease virus,ndv)属于副黏腺病毒科禽腮腺炎病毒属，是一种单链rna病毒，其基因组突变频率较高。每次大规模流行都是由新基因型的毒株所引发。新城疫症状表现为突然死亡，或精神萎靡，不产蛋或产软壳蛋、畸形蛋，产量下降。鸡表现为咳嗽症状，下痢排黄绿色稀粪等。给禽类养殖业造成严重的经济损失。
3.目前国内在一般采用灭活疫苗、弱毒疫苗、亚单位疫苗等。但随着新城疫病毒的变异，传统疫苗免疫效果相对较差、不能很快应对新毒株以及生成成本高的问题亟需新的疫苗方式来替代。mrna疫苗是最新的疫苗技术，本发明可以满足上述这些需求。


技术实现要素：

4.本发明提供一种预防和治疗新城疫病毒引起疾病的人工设计的核糖核酸分子。该核酸分子可以用于制备预防新城疫病毒导致的疾病的疫苗，也可以应用于治疗相应疾病。新城疫病毒可以指class i或class ii两大类各种不同的基因型。
5.本发明提供了一种编码表达新城疫病毒抗原的信使核酸分子，所述核酸分子的编码蛋白序列选自新城疫病毒编码蛋白的全长或部分序列；所述核酸分子的编码蛋白序列与seq id no:1有75％、80％、85％、90％、95％或99％相同的氨基酸序列，或所述核酸分子的编码蛋白序列与seq id no:1功能相同的序列。
6.进一步的，所述核酸分子包含seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5和seq id no:6中的多条序列，所述核酸分子与seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5和seq id no:6中的至少一条序列有70％-100％的同源性，所述核酸分子的开放阅读框编码病毒蛋白全长或部分肽段序列。
7.进一步的，核酸分子的编码包含异源的肽段，异源的肽段与核酸分子形成融合蛋白。
8.进一步的，异源肽段可以为信号肽、其到辅助蛋白形成多聚结构的肽段。
9.进一步的，核酸分子序列中的核苷包含1种或多种化学修饰核苷，所述化学修饰核苷包括5-甲基胞苷、假尿苷、n-1-甲基-假尿苷和n-6-甲基腺苷。
10.进一步的，核苷修饰比例为1％-70％。
11.进一步的，核苷修饰比例为5％-70％。
12.进一步的，核苷修饰比例为10％-60％。
13.进一步的，核苷修饰比例为20％-60％。
14.进一步的，核苷修饰比例为30％-60％。
15.进一步的，核苷修饰比例为40％-50％。
16.进一步的，核苷修饰比例为50％。
17.在一些实施方案中，人工设计的核酸分子编码衍生自新城疫病蛋白或肽段序列。在一些实施方案中，所述蛋白为nh蛋白。
18.在一些实施方案中，所述的mrna序列由seq id no：3-6组成。
19.在一些实施方案中，所述的mrna序列含有帽子结构，具体的为cap1。
20.在一些实施方案中，所述的mrna序列含有经过修饰的核苷1-甲基假尿嘧啶，其与尿苷的比例为50％：50％。
21.本发明至少具备以下一种或多种有益效果：
22.本发明的核酸分子针对突变频率高的新城疫病毒具有免疫效果好、能很快对应新毒株、生产成本低等优点；
23.核酸分子可以用于制备预防新城疫病毒导致的疾病的疫苗，也可以用于治疗相应疾病。新城疫病毒指class i或class ii两大类各种不同的基因型的新城疫病毒。
附图说明
24.下述附图进一步举例说明本发明，它们不应该由此解释为限制本发明的主题。
25.图1为核酸分子设计示意图，显示载体的结构与合成的mrna组合体；
26.图2为制备的核酸琼脂糖电泳图。
具体实施方式
27.为了使本发明的内容以及其优点更为清晰易懂，下面结合附图1-2来对具体实施方案进行进一步完整地描述。具体实施方案仅作为本发明的示范性列举，不构成对本发明的范围有任何限制。基于本发明中的实施例的原理，本领域技术人员通过对本发明技术方案进行局部细节的修改、等同或替代所得的其他实施例均属于本发明的保护范围。
28.除非另外指出，否则本发明中的实施方案可采用通常的有机化学、材料学、分子生物学、细胞生物学、免疫学、兽医学的常规技术和定义。这些常规技术的方案可来自于制造商的产品说明书或标准实验手册中，或相类似的参考文献。
29.实施例1：体外转录模板的制备
30.模板质粒的全基因合成：一个完整的编码ndv nh蛋白seq id no：1的mrna表达功能区块需要将含有t7启动子序列seq id no：2、5
‘
utr区seq id no：3、orf区seq id no：4、3
‘
utr区seq id no：5以及polya seq id no：6的dna序列串联排布。上述序列组合克隆于puc57载体多克隆位点ecori/hindiii酶切位点之间。
31.线性化体外转录模板制备：将质粒进行酶切线性化，再利用pcr反应可以得到大量扩增产物，反应中使用引物：正向seq id no：7；反向seq id no：8
32.配置反应体系包含：5x phusion buffer 50μl；dntp 2μl；正向引物1μl；反向引物1μl；模板质粒0.5μl；phusion enzyme 2μl；h2o 194.5μl；
33.反应条件：98℃30s循环28次；72℃10min；4℃恒温；当然，还可以采用以下参数循环28次，如98℃10s；55℃20s；72℃10s或72℃120s；、等参数。
34.离心柱法纯化pcr产物；
35.实施例2：mrna的制备
36.体外转录体系：利用t7rna聚合酶大量产生与模板dna可转录部分序列相同的核糖核酸序列。按照如下配比混合：10x buffer 2μl、atp(100mm)2μl、ctp(100mm)2μl、gtp(100mm)2μl、utp(100mm)1μl、m1ψtp(100mm)1μl、线性dna模板1μl和t7 enzyme 2μl；然后用h2o将体系总体积补至20μl；体系混匀后在37度反应3小时，然后添加1u/μl dnase i 1μl消化dna模板，混匀后处理30min。产物rna通过加入1/10体积的8m licl，在-20℃沉淀1h，通过4℃15000g 20min离心，去上清并用75％乙醇漂洗两次沉淀。rna干燥后用无核酶的水溶解。
37.加cap1帽子：前述制得的rna需要进行加热至60℃5min，然后急速置于冰上放5min。配置加帽体系：rna 10μg、10x capping buffer 2μl、gtp(10mm)1μl、sam(2mm)1μl、vaccina capping enzyme 1μl和2
’‑
o-methyltransferase1μl；然后用h2o将加帽体系总体积补至20μl；反应体系在37℃下保持30分钟。加帽的mrna通过加入1/10体积的8m licl，在-20℃沉淀1h，通过4℃15000g20min离心，去上清并用75％乙醇漂洗两次沉淀。rna干燥后用无核酶的水溶解，置于-80℃长期保存。
38.尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改和变型。

技术特征：
1.一种编码表达新城疫病毒抗原的信使核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的编码蛋白序列选自新城疫病毒编码蛋白的全长或部分序列；所述核酸分子的编码蛋白序列与seq id no:1有75％、80％、85％、90％、95％或99％相同的氨基酸序列，或所述核酸分子的编码蛋白序列与seq id no:1功能相同的序列。2.根据权利要求1的编码表达新城疫病毒抗原的信使核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5和seq id no:6中的多条序列，所述核酸分子与seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5和seq id no:6中的至少一条序列有70％-100％的同源性，所述核酸分子的开放阅读框编码病毒蛋白全长或部分肽段序列。3.根据权利要求2所述的编码表达新城疫病毒抗原的信使核酸分子，其特征在于，核酸分子的编码包含异源的肽段，异源的肽段与核酸分子形成融合蛋白。4.根据权利要求3所述的编码表达新城疫病毒抗原的信使核酸分子，其特征在于，异源肽段可以为信号肽、其到辅助蛋白形成多聚结构的肽段。5.根据权利要求1-4任一项所述的编码表达新城疫病毒抗原的信使核酸分子，其特征在于，核酸分子序列中的核苷包含1种或多种化学修饰核苷，所述化学修饰核苷包括5-甲基胞苷、假尿苷、n-1-甲基-假尿苷和n-6-甲基腺苷。6.根据权利要求5所述的编码表达新城疫病毒抗原的信使核酸分子，其特征在于，核苷修饰比例为1％-70％。7.根据权利要求5所述的编码表达新城疫病毒抗原的信使核酸分子，其特征在于，核苷修饰比例为5％-70％。8.根据权利要求5所述的编码表达新城疫病毒抗原的信使核酸分子，其特征在于，核苷修饰比例为10％-60％。9.根据权利要求5所述的编码表达新城疫病毒抗原的信使核酸分子，其特征在于，核苷修饰比例为20％-60％。10.根据权利要求5所述的编码表达新城疫病毒抗原的信使核酸分子，其特征在于，核苷修饰比例为30％-60％。11.根据权利要求5所述的编码表达新城疫病毒抗原的信使核酸分子，其特征在于，核苷修饰比例为40％-50％。12.根据权利要求5所述的编码表达新城疫病毒抗原的信使核酸分子，其特征在于，核苷修饰比例为50％。

技术总结
本发明涉及的是医药技术领域的一种肝脏靶向性多肽、组合物及其应用，其中所述肝脏靶向性组合物为氨基酸序列通式为TYKSGIGIDSGPKSGK的多肽与N-乙酰基神经氨酸形成的组合物。此组合物可结合核酸形成大小均一的复合物颗粒，从而实现核酸药物的肝脏靶向性递送。而实现核酸药物的肝脏靶向性递送。而实现核酸药物的肝脏靶向性递送。


技术研发人员：请求不公布姓名
受保护的技术使用者：苏州慧疗生物医药科技有限公司
技术研发日：2022.03.17
技术公布日：2023/9/22