一种新的聚离子选择性电极的定量方法

1.本发明涉及聚离子选择性电极的定量方法，具体地说是一种根据聚离子选择性电极初始电位变化速率来快速、准确、灵敏地定量的新方法。


背景技术：

2.聚合物膜聚离子选择性电极是一种应用于多电荷离子检测的电位传感器，具有成本低廉、操作简单的优点，包括聚阳离子选择性电极和聚阴离子选择性电极。其中，聚阳离子选择性电极敏感膜中掺杂有阳离子交换剂(硼酸盐衍生物或二壬基萘磺酸或其盐)作为活性位点，而阴离子选择性电极敏感膜的活性位点为阴离子交换剂(季铵盐类有机物)。该类传感器的工作原理是：待测液中的聚离子能够与敏感膜中的离子交换剂形成离子对，进而被选择性萃取到敏感膜中。同时，聚离子会从样品溶液体相不断向样品溶液-敏感膜界面处传输，形成水相内向离子流；被萃取到膜内的聚离子会进一步从界面处向膜体相传输，形成膜相内向离子流。当聚离子在水相和膜相中的离子流达到动力学平衡时，将观察到准稳态的电位响应。该电位响应值与基线电位的差值即为电位信号，与水相中的聚离子浓度呈正相关。
3.目前，传统的聚离子检测的电位分析方法主要有直接电位法或电位滴定法，可实现对一系列的聚阳离子(如鱼精蛋白、分子折叠体、树枝状化合物)和聚阴离子(如肝素、硫酸葡聚糖、dna、硫酸软骨素)的电位检测。另外，抗原-抗体识别反应、聚离子切割酶及其抑制剂和激活剂也能够通过聚离子电极实现指示。然而，直接电位检测法需要读取达到准稳态时的电位信号，对于低浓度的聚离子往往需要较长的时间，影响检测效率的提高。电位滴定法具有不受复杂样品中亲脂性小离子干扰的优点，但其装置复杂，也需要等待滴定平衡电位的出现，且精确度的提高依赖于滴定速率的降低，导致检测时间延长，不利于检测效率的提高。
4.此外，聚离子选择性电极的灵敏度的进一步提高受到了广泛关注。聚合物膜聚离子选择性电极的电位取决于溶液侧膜界面的聚离子浓度，其灵敏度与水相和膜相中的离子流强度相关。已有研究者通过降低膜中增塑剂比例、降低膜中离子载体含量等手段来抑制膜相中扩散的离子流，从而促进聚离子在膜界面的富集以提高灵敏度。但是，由于膜相中未结合离子载体的存在，膜相内的离子扩散不可能被完全消除。已被证实，超薄膜由于空间的局限性，可以从根本上阻止这种膜内的小离子扩散，有利于灵敏度提高。然而，超薄膜这一策略并未应用于聚离子选择性电极领域。
5.因此，发展一种新的聚离子选择性电极的定量方法，实现聚离子的更灵敏更快速的检测，对聚离子的高效准确低成本测定意义重大。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于针对上述不足之处提供一种根据聚离子选择性电极初始电位变化速率来快速、准确、灵敏地定量的新方法。
7.为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：
8.一种新的聚离子选择性电极的定量方法，以全固态超薄聚合物膜聚离子选择性电极作为工作电极，将其插入至待检测样品中，使待测聚离子在膜界面富集产生初始电位变化速率，根据待测样品的初始电位变化速率在标准曲线的对应值进而获得待测样品中的聚离子浓度。
9.所述标准曲线为将工作电极加入不同浓度含待检测聚离子的溶液中，通过电位测定仪记录加入不同浓度聚离子后的电极初始电位变化值，计算获得初始电位变化速率，根据初始电位变化速率与浓度绘制标准工作曲线。
10.所述初始电位变化速率为达到准稳态平衡电位前，固定时间内的电位信号(该时间点的电位值和基线的差值)与时间的比值；其中，固定时间可以是1-300s。
11.所述待检测聚离子与工作电极所选择性响应的聚离子电荷相反时，向绘制标准曲线的不同浓度含待检测聚离子溶液或待检测液中加入指示聚离子(即工作电极所选择性响应的能够与待测聚离子静电络合的聚离子)，通过测量与不同浓度相反电荷待测聚离子络合后剩余指示聚离子的初始电位变化绘制标准曲线，检测待检测液中待检测聚离子浓度。
12.上述指示聚离子的加入量是使其能够完全静电络合待检测液中的聚离子，并有剩余(其一般根据跟指示聚离子的种类和与反离子的结合比例、以及电极的线性范围进行选择)。
13.所述全固态超薄聚合物膜聚离子选择性电极为固体电极底部粘附转导层材料，再于转导层材料表面粘附超薄聚合物膜，其中，超薄聚合物膜的厚度为200nm-20μm，优选为5μm及以下。
14.具体的检测方法为
15.a.将所述工作电极浸入含0.12m nac1的tris-hc1缓冲溶液中活化0.5-3h，然后插入盛有缓冲溶液的测量池中，待电极稳定后得到基线电位；
16.b.将标准不同浓度的待检测聚离子加入测量池中，聚离子在电极膜表面富集，引起膜界面电位变化；
17.c.根据加入聚离子后初始电位变化速率对聚离子浓度绘制标准曲线；
18.d.将活化后工作电极直接插入盛有待测样品的测量池中，产生样品电位信号；通过样品溶液的初始电位变化速率与标准工作曲线对照得到待测聚离子的浓度。
19.所述待检测聚离子与工作电极所选择性响应的聚离子电荷相反时，步骤b)和步骤d)插入工作电极后加入能够与待检测聚离子静电络合的聚离子作为指示聚离子。
20.所述待检测聚离子为聚阳离子或聚阴离子；所述聚阳离子为鱼精蛋白、聚阳离子多肽、聚乙二胺树枝状化合物或聚丙烯亚胺树枝状化合物；聚阴离子为肝素、戊糖多硫酸钠、核酸、鹿角菜胶、硫酸葡聚糖、多硫酸软骨素或过硫酸化多硫酸软骨素。
21.所述工作电极中载体为玻碳电极、金电极或丝网印刷电极；转导层材料为导电聚合物、介孔碳、多孔石墨烯或掺杂金属纳米粒子的石墨烯复合材料。
22.所述聚合物膜是由聚合物基体材料、增塑剂、离子载体和亲脂性的惰性盐组成，按重量份数比为20-60：20-60：0.1-10：0.1-10混合，混合后溶于过量的四氢呋喃中，搅拌使其成为均匀溶液，然后用四氢呋喃稀释10-300倍，取适量稀释后溶液滴涂或旋涂于覆有转导层的电极载体上，室温下放置4-12h，即在电极载体上形成超薄聚合物敏感膜。
23.所述聚合物基体材料为聚氯乙烯、聚丁基丙烯酸酯、聚丙烯酸丁酯、聚醚酰亚胺、橡胶或溶胶凝胶膜；增塑剂为邻-硝基苯辛醚(o-npoe)、二-2-乙基己基癸酯、癸二酸二丁酯或癸二酸二辛酯；离子载体为三-十二烷基甲基氯化铵、三-十四烷基甲基氯化铵、二壬基萘磺酸、二壬基萘磺酸盐或硼酸盐衍生物；亲脂性的惰性盐为四(十二烷基)-四(4-氯苯基)硼酸铵(eth500)。
24.检测原理：聚离子选择性电极的电位取决于溶液侧膜界面的聚离子浓度。其灵敏度与水相和膜相中的离子流强度相关。本发明利用超薄聚合物敏感膜的空间局限性，阻止被萃取到膜内的聚离子从界面处进一步向膜体相的扩散，抑制膜相内的离子流。进而加速待测聚离子在膜界面处富集，引起电位信号的大幅度增强，即引起初始电位变化速率增大，这使得低浓度聚离子也更容易在膜表面富集，从而提高电极的灵敏度；由于水相中的离子流强度与聚离子浓度正相关，则薄膜电极实时电位信号受限于水相中离子流强度而与待测聚离子浓度正相关。因此，利用这种实时的非平衡的电位响应信号(即电位平衡前初始电位变化速率)能够实现聚离子的检测。同时，得益于于本发明电极响应灵敏度提高的优势，能够实现低浓度聚离子的灵敏检测，避免了传统聚离子选择性电极需要较长时间等待低浓度聚离子达到准稳态后读取电位信号进行定量的缺点。
25.同时，由于聚阳离子和聚阴离子会形成无电位响应的络合物，基于此可用于相反电荷聚离子的检测。以聚阳离子选择性电极检测聚阴离子为例，向待测溶液中加入固定量聚阳离子，待测溶液中聚阴离子的静电络合作用会降低所加入自由聚阳离子的浓度，引起电位信号的降低。因此，进一步利用本发明上述根据初始电位速率定量的方式，以聚阳离子选择性电极为例，将聚阳离子选择性电极作为信号转换器，通过向待测溶液中加入聚阳离子作为指示离子，检测样品中待检测聚阴离子络合后剩余的指示离子的浓度，可实现对其相反电荷聚阴离子的直接检测。同理，利用聚阴离子选择性电极可实现对聚阳离子的检测。
26.本发明的优点在于：
27.1.本发明采用初始电位变化速率和待测物浓度关系进行定量，利用的是准稳态平衡前任意固定时间内的电位变化，无需像传统聚离子电极一样等待准稳态响应的出现，大大缩短了聚离子尤其是低浓度聚离子的检测时间。
28.2.本发明电极灵敏度高，可实现低浓度聚离子的直接检测。
29.3.本发明电极可利用聚离子络合现象实现反离子的直接电位检测，无需传统滴定的复杂装置和繁琐步骤，同样能够消除复杂样品中背景离子的干扰，因而本法可以直接用于复杂样品中的聚离子检测。
30.4.本发明电极制备简单，成本低廉，全固态设计，无内充液，使其便于储存和携带，操作简单，适用于现场监测。
附图说明
31.图1为本发明电极的示意图(其中1为电极载体，2为转导层，3为聚合物敏感膜)。
32.图2为本发明电极的测试装置示意图(其中1为电极载体，2为转导层，3为聚合物敏感膜，4为外参比电极，5为电位测定仪，6为检测池，7为检测液，8为具有搅拌作用的磁性搅拌子)。
33.图3为本发明电极和传统厚度的聚合物膜鱼精蛋白选择性电极对鱼精蛋白响应的
对照。
34.图4为本发明的鱼精蛋白选择性电极聚合物膜厚度对鱼精蛋白响应灵敏度的影响。
35.图5为本发明电极测定不同浓度鱼精蛋白的电位信号响应曲线。
36.图6为本发明电极测定不同浓度鱼精蛋白的标准工作曲线。
37.图7为采用本发明方法实际测定待检测液中鱼精蛋白的浓度曲线图。
具体实施方式
38.为了更清楚地说明本发明，下面结合附图及实施例对本发明作进一步阐述，但下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围，本发明的保护范围应包括权利要求的全部内容。
39.本发明所基于的是超薄聚离子敏感膜，利用薄膜能够加速样品中待测聚离子在膜界面富集的原理，增强电位信号，提高电极灵敏度，呈现随时间增大且与样品浓度正相关的非平衡电位响应。因此，不同于传统电极的直接电位检测法需要读取准稳态时的电位信号进行定量，基于本发明电极灵敏度提高的优势，能够利用这种非平衡的电位响应信号实现聚离子的检测。具体方式是：通过电位测定仪记录加入不同浓度聚离子后的电极电位变化，获得不同浓度的初始电位变化速率，以初始电位变化速率于浓度绘制标准工作曲线，对照标准工作曲线即得未知样品中的聚离子浓度。同时，由于聚阳离子和聚阴离子会形成无电位响应络合物，该聚离子选择性电极也可作为信号转换器实现对其相反电荷聚离子的直接检测，不需要引入复杂的电位滴定装置。同时，全固态的电极结构，使其便于储存和携带。综上，本发明发展的这种新的聚离子选择性电极的定量方法，具有操作简便、检测时间短、操作成本低以及适宜现场检测等优点，对聚离子的直接电位测定和以聚离子电极为信号转换器的反离子测定、酶测定和免疫测定具有重要意义。
40.实施例1
41.高灵敏聚阳离子选择性电极灵敏度测定。
42.覆有转导层的工作电极制备:au/pgr-pt电极是采用三电极体系通过循环伏安法在au电极表面一步电化学共还原氧化石墨烯(go)水分散液以及h2ptcl4制得，进一步的说，以含有0.1m liclo4、2.5mm h2ptcl4的go水溶液(1.0mg
·
ml-1
)为电解质溶液，工作电极为金电极，对电极为铂片(10mm
×
10mm)，参比电极为饱和甘汞电极(sce)。在采用循环伏安法电沉积时，电位窗口为-1.5v-0v，扫描速度为100mv
·
s-1
，扫描圈数为20圈。电沉积还原结束后，先用去离子水轻轻的冲洗电极表面，然后在去离子水中浸泡至少1h，用以除掉吸附在电极表面的go。最后，将电极再次浸泡在去离子水中去除liclo4，得到au/pgr-pt电极。
43.聚阳离子选择性工作电极的制备：按照质量百分数1％∶1％：49％∶49％将二壬基萘磺酸、四(十二烷基)-四(4-氯苯基)硼酸铵、聚氯乙烯、邻-硝基苯辛醚共100mg的混合物溶解于到1ml四氢呋喃溶液中，搅拌使其成为均匀溶液，取80μl膜溶液滴于覆有转导层的au/pgr-pt电极上，室温下放置，约12h后四氢呋喃蒸发完毕和即得传统厚度(150μm)的聚阳离子选择性工作电极；各取50μl、200μl、400μl膜溶液用四氢呋喃稀释到1ml，各取40μl稀释后的膜溶液分别滴于覆有转导层的au/pgr-pt电极上，室温下放置，约4h后四氢呋喃蒸发完毕，即在上述覆有转导层的工作电极(au/pgr-pt电极)上形成均匀的不同厚度聚合物敏感
薄膜，聚合物敏感薄膜厚度约5μm、20μm、40μm，即获得不同敏感膜厚度的薄膜工作电极。具体电极结构参见图1。
44.工作电极活化：将上述薄膜工作电极在含有0.12mol/l nacl的tris-hc1缓冲溶液(ph 7.4)中活化1h，传统厚度的工作电极活化12h。。
45.检测装置：上述获得的不同厚度聚合物敏感膜的聚阳离子选择性电极为工作电极(正极)，ag/agcl(3m kcl)电极为参比电极(负极)，正极与负极通过导线与chi 660e电化学工作站相连(参见图2)。选择“开路电位-时间”技术测定电位值。检测池底配套有磁力搅拌器以转动磁力搅拌子。
46.电极灵敏度增强测试：用上述不同工作电极(5μm、150μm)分别在磁力搅拌3000rpm条件下，以15ml含有0.12mol/l nacl的tris-hcl缓冲溶液(ph 7.4)为背景电解质溶液，待各基线电位稳定后，分别加入不同浓度的鱼精蛋白(1μg/ml或2μg/ml)，加样后产生电位信号，测定各电极的灵敏度(参见图3)。
47.由图3的灵敏度对比可见，在150s内，传统厚度的聚合物敏感膜工作电极对1μg/ml甚至2μg/ml的鱼精蛋白均没有表现出明显的电位响应，而5μm超薄膜工作电极对1μg/ml鱼精蛋白样品的电位响应达24mv，而对2μg/ml鱼精蛋白样品电位响应高达80mv。由此可见本发明超薄聚合物敏感膜电极灵敏度大大提高，可实现根据初始电位变化值或变化速率检测鱼精蛋白的定量方式。
48.同时，进一步用上述不同厚度聚合物敏感膜的工作电极进行灵敏度的检测，用上述不同工作电极(5μm、、20μm、40μm)分别在磁力搅拌3000rpm条件下，以15ml含有0.12mol/l nacl的tris-hcl缓冲溶液(ph 7.4)为背景电解质溶液，待各基线电位稳定后，分别加入不同浓度的鱼精蛋白(0.4μg/ml或0.8μg/ml)，加样后产生电位信号，测定各电极的灵敏度(参见图4)。
49.由图4灵敏度可见，随着电极敏感膜厚度的增大，电位信号明显减小，超过20μm便不能明显地提高灵敏度，证实超薄膜确实可以提高聚离子选择性电极的灵敏度，且敏感膜越薄，灵敏度越高。
50.实施例2
51.利用实施例1所制备的高灵敏聚阳离子选择性电极(聚合物敏感膜厚度为5μm)作为工作电极测定鱼精蛋白。其测定步骤如下：
52.工作电极活化：将上述电极在含有0.12mol/l nacl的tris-hc1缓冲溶液(ph 7.4)中活化1h，即得到活化好的高灵敏聚阳离子选择性电极。
53.检测装置：工作电极(正极)，ag/agcl(3m kcl)电极为参比电极(负极)，正极与负极通过导线与chi 660e电化学工作站相连(参见图2)。选择“开路电位-时间”技术测定电位值。检测池底配套有磁力搅拌器以转动磁力搅拌子。
54.在磁力搅拌3000rpm条件下，以15ml含有0.12mol/l nacl的tris-hc1缓冲溶液(ph 7.4)为背景电解质溶液，待基线电位稳定后，分别加入不同量的鱼精蛋白(0-1.4μg/ml)，加样后分别产生不同的标准信号，记录150s内的电位变化获得不同浓度的电位信号响应曲线(参见图5)，读取不同浓度下150s内的电位变化值，计算该值与时间的比值获得初始电位变化速率，利用该初始电位变化速率与相应的浓度作图即可得鱼精蛋白的标准工作曲线(参见图6)。
55.测定未知浓度鱼精蛋白，在相同磁力搅拌条件下，将选择性电极插入未知浓度的鱼精蛋白溶液中，读取150s内电位变化值(参见图7)计算初始电位变化速率，对照标准工作曲线(如图6)计算出相应的浓度。
56.由图7的电位变化值计算初始电位变化速率为0.116，与标准曲线(图6)对照可知，未知鱼精蛋白浓度为0.78μg。
57.实施例3
58.利用实施例1所制备的高灵敏聚阳离子选择性电极(聚合物敏感膜厚度为5μm)作为工作电极测定羊血中的肝素。其测定步骤如下：
59.工作电极活化：将上述电极在含有0.12mol/l nacl的tris-hc1缓冲溶液(ph 7.4)中活化1h,即得到活化好的高灵敏聚阳离子选择性电极。
60.检测装置：聚阳离子选择性电极为工作电极(正极)，ag/agcl(3m kcl)电极为参比电极(负极)，正极与负极通过导线与chi 660e电化学工作站相连(参见图2)。选择“开路电位-时间”技术测定电位值。检测池底配套有磁力搅拌器以转动磁力搅拌子。
61.将新鲜羊血中加入柠檬酸钠，防止其凝固，用此血液为背景电解质配置不同浓度的已知浓度的肝素样品。在磁力搅拌条件下，将聚离子电极插入盛有含不同浓度肝素的标准羊血样品的测量池中，待电极稳定后得到基线电位；将固定量标准鱼精蛋白加入测量池中使其浓度为1.1μg/ml，肝素和鱼精蛋白结合比率为10:1，剩余未络合的鱼精蛋白在电极膜表面富集，电位上升；由于样品中肝素的浓度不同，加入如鱼精蛋白后分别产生不同的标准信号，记录150s内的电位变化获得不同浓度肝素存在下的电位信号响应曲线，读取150s内的电位变化值，计算该值与时间(150s)的比值获得初始电位变化速率，利用该初始电位变化速率与相应的肝素浓度作图即可得肝素的标准工作曲线。
62.测定未知浓度肝素，在相同磁力搅拌条件下，将选择性电极插入未知浓度的肝素溶液中，将固定量标准鱼精蛋白加入测量池中使其浓度为1.1μg/ml，产生电位信号，读取150s内电位变化值计算初始电位变化速率，对照标准工作曲线计算出相应的浓度。
63.若检测中所测鱼精蛋白浓度无法引起明显的电极电位变化，则可能是因为样品中肝素浓度超过0.1u/ml，使得样品中无剩余鱼精蛋白或浓度低于检测限，则可对样品进行稀释后重复上述检测步骤。
64.实施例4
65.采用本发明电极测定人血中的肝素：以新鲜的血液为背景电解质，配置不同已知浓度的肝素样品，参照实施例3，在磁力搅拌条件下，对照标准工作曲线计算出相应的浓度。
66.实施例5
67.高灵敏聚阴离子选择性电极测定缓冲液中的肝素。
68.覆有转导层的工作电极制备:au/pgr-pt电极是采用三电极体系通过循环伏安法在au电极表面一步电化学共还原氧化石墨烯(go)水分散液以及h2ptcl4制得，进一步的说，以含有0.1m liclo4、2.5mm h2ptcl4的go水溶液(1.0mg
·
ml-1
)为电解质溶液，工作电极为金电极，对电极为铂片(10mm
×
10mm)，参比电极为饱和甘汞电极(sce)。在采用循环伏安法电沉积时，电位窗口为-1.5v-0v，扫描速度为100mv
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s-1
，扫描圈数为20圈。电沉积还原结束后，先用去离子水轻轻的冲洗电极表面，然后在去离子水中浸泡至少1h，用以除掉吸附在电极表面的go。最后，将电极再次浸泡在去离子水中去除liclo4，得到au/pgr-pt电极。
69.固定有聚合物敏感膜的工作电极的制备：按照质量百分数1％∶1％：49％∶49％将三-十二烷基甲基氯化铵、四(十二烷基)-四(4-氯苯基)硼酸铵、聚氯乙烯、癸二酸二辛酯共100mg的混合物溶解于到1ml四氢呋喃溶液中，搅拌使其成为均匀溶液，然后用四氢呋喃稀释20倍，取40μl稀释后的膜溶液滴于覆有转导层的au/pgr-pt电极上，室温下放置，约4h后四氢呋喃蒸发完毕，即在电极上形成均匀的超薄聚合物敏感膜。具体电极结构参见图1。
70.检测装置：聚阴离子选择性电极为工作电极(正极)，ag/agcl(3m kcl)电极为参比电极(负极)，正极与负极通过导线与chi 660e电化学工作站相连(参见图2)。选择“开路电位-时间”技术测定电位值。检测池底配套有磁力搅拌器以转动磁力搅拌子。
71.将上述电极在含有0.12mol/l nacl的tris-hc1缓冲溶液(ph 7.4)中活化1h。即得到活化好的高灵敏聚阴离子选择性电极。
72.在磁力搅拌3000rpm条件下，以15ml含有0.12mol/l nacl的tris-hc1缓冲溶液(ph 7.4)为背景电解质溶液，待基线电位稳定后，分别加入不同量的肝素达到一系列浓度(0.1-2u/ml)，记录30s内的电位变化获得不同浓度的电位信号响应曲线，读取不同浓度下30s内的电位变化值，计算该值与时间的比值获得初始电位变化速率，利用该初始电位变化速率与相应的浓度作图即可得肝素的标准工作曲线。
73.测定未知浓度肝素，在相同磁力搅拌条件下，将选择性电极插入未知浓度的肝素溶液中，读取30s内电位变化值计算初始电位变化速率，对照标准工作曲线计算出相应的浓度。
74.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制。其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围内。

技术特征：
60：20-60：0.1-10：0.1-10混合，混合后溶于过量的四氢呋喃中，搅拌使其成为均匀溶液，然后用四氢呋喃稀释10-300倍，取适量稀释后溶液滴涂或旋涂于覆有转导层的电极载体上，室温下放置4-12h，即在电极载体上形成超薄聚合物敏感膜。

技术总结
本发明涉及聚离子选择性电极的定量方法，具体地说是一种根据聚离子选择性电极初始电位变化速率来快速、准确、灵敏地定量的新方法。以全固态超薄聚合物膜聚离子选择性电极作为工作电极，将其插入至待检测样品中，使待测聚离子在膜界面富集产生初始电位变化速率，根据待测样品的初始电位变化速率在标准曲线的对应值进而获得待测样品中的聚离子浓度。本发明发展的这种新的聚离子选择性电极的定量方法，具有操作简便、检测时间短、操作成本低以及适宜现场检测等优点，对聚离子的直接电位测定和以聚离子电极为信号转换器的反离子测定、酶测定和免疫测定具有重要意义。定和免疫测定具有重要意义。定和免疫测定具有重要意义。


技术研发人员：秦伟 王凯凯 梁荣宁
受保护的技术使用者：中国科学院烟台海岸带研究所
技术研发日：2022.04.06
技术公布日：2023/9/22