一种高效制备高活性脐带间充质干细胞的方法与流程

1.本发明涉及间充质干细胞制备技术领域，具体为一种高效制备高活性脐带间充质干细胞的方法。


背景技术：

2.间充质干细胞（mesenchymal stem cells，mscs）来源于早期的中胚层和外胚层，最初在骨髓中发现，具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点。近年来研究发现间充质干细胞对心脑血管疾病、骨和肌肉衰退性疾病、脑和脊髓神经损伤及自身免疫性疾病等有明显疗效，参与机体免疫调节和细胞生长。人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells ，huc-msc）是存在于新生儿脐带华通胶和血管周围组织中的一种间充质细胞，具有来源广泛，取材方便，增殖能力强，细胞表型稳定，免疫原性低等优点，并且可分泌大量细胞因子参与机体免疫调节，是临床研究与应用的合适材料来源，具有广泛的应用前景。


技术实现要素：

3.（一）解决的技术问题针对现有技术的不足，本发明提供了一种高效制备高活性脐带间充质干细胞的方法，具备便于培养、活性高等优点。
4.（二）技术方案为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种高效制备高活性脐带间充质干细胞的方法，包括以下步骤：1）原料采集：收集妊辰时长为37周至42周后分娩的胎儿的脐带，将其放入采集管内，使用酒精进行初步的消毒处理，随后将其放入清洁器皿中，向清洁器皿中注入浓度为0.85%的生理盐水中进行保存；2）原料转运：将恒温箱内的温度设置在23℃至28℃之间，随后将清洁器皿放入到恒温箱内对恒温箱进行闭合，将恒温箱连同其内存放有胎儿脐带的清洁器皿一同运转至无菌实验室内；3）预处理：将脐带从清洁器皿内取出，将其放置在洗涤器皿内，先向洗涤器皿内灌注医用酒精，在浸泡二十秒后将医用酒精倒出，随后使用浓度为90%生理盐水对脐带进行清洗两到三次，将残留的酒精清洗干净并清洗掉脐带表面的血迹；4）获取华通氏胶：将脐带放置在无菌工作台上，将其两端各减去2.0cm，随后将脐带的剩余部分均匀的剪成2.0cm～2.5cm长短的分段，使用镊子将分段后的脐带上的血管剔除下来，随后将剔除血管的脐带放入到装有生理盐水的容器中将其上残余的血迹清洗掉；5）剪碎获取的华通氏胶：在无菌工作台上将其剪成1立方毫米大小的碎片，将剪碎的碎片放入收集器皿内；6）混合酶消化：将胰蛋白酶、胶原酶ⅲ、透明质酸酶、中性蛋白酶和弹性蛋白酶进
行稀释混合，混合后的溶液中胰蛋白酶浓度为3%、胶原酶ⅲ浓度为5%、透明质酸酶浓度为4%、中性蛋白酶浓度为4%、弹性蛋白酶浓度为5%、其余为浓度为0.9%的生理盐水，去上述溶液放于烧杯中，将剪碎后的碎片放入到装有上述溶液的烧杯中，随后将烧杯放在水浴摇床上四小时。
5.7）收集细胞：将消化后的悬液过滤到离心试管中，并向离心试管内加入不含有钙和镁离子的平衡盐溶液进行稀释，随后将离心试管放在离心机上进行离心，对稀释后溶液内的成分进行分离，离心十分中将其顶部清液倒出，随后继续进行离心，此过程重复两次从而对细胞进行收集；8）初代细胞培养：将离心后收集到的细胞接种到细胞培养基上，随后将细胞培养基放入到培养箱内，将培养箱内的温度控制在35℃至38℃之间，并保证培养箱内的二氧化碳浓度为5%；9）传代培养：在初代培养的细胞密度到达80%后，使用0.15%胶原酶进行消化收集并传代培养，在次代细胞密度到达80%后再次进行传代培养，从而培养出三代细胞；10）质量检验：对三代细胞的质量进行检验，通过检测其细胞表面的标记物来确定细胞的质量，判断是否合格。
6.优选的，在对胎儿的脐带收集前，应对胎儿的健康状态进行检测，保证收集到的脐带来自于健康的胎儿，并且在对胎儿的脐带进行收集前，应首先取得胎儿监护人及其家属的同意，并按照相关条例签订同意书。
7.优选的，所述恒温箱在使用前及使用过后均需要进行消毒处理，胎儿的脐带从胎儿身上取下后到转运到无菌实验室内的时间应控制在四小时以内，以保证细胞的活性。
8.优选的，所述预处理过程中灌注医用酒精时应保证医用酒精能够完全淹没脐带的最高点，保证脐带完全浸没在医用酒精中。
9.优选的，在上述步骤中所使用到的全部器械在使用前及使用后均需要进行彻底的消毒处理。
10.优选的，在将华通氏胶进行剪碎的过程中将华通氏胶放置在带有栅格的无菌玻璃板上，借助放大镜在无菌玻璃板上进行剪。
11.优选的，所述水浴摇床上的水温保持在35℃～38℃，且所述水浴摇床的摇动频率为每分钟220次优选的，对三代细胞进行检验的过程中，要进行微生物检测，其中支原体的检测结果若出现阳性则为不合格，且合格的细胞内毒素应小于0.5eu/ml。
12.（三）有益效果与现有技术相比，本发明提供了一种高效制备高活性脐带间充质干细胞的方法，具备以下有益效果：该高效制备高活性脐带间充质干细胞的方法，整体的操作过程简单，并且在培养的过程中能够保证原代细胞的迁出率，并且经济成本较低，消化时间短，消化率易于进行把控，避免出现细胞贴壁率降低并且大量死亡的现象，并且培育出的细胞活性高，更加的便于后续临床治疗过程中使用。
具体实施方式
13.下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
14.实施例一：一种高效制备高活性脐带间充质干细胞的方法，包括以下步骤：1）原料采集：收集妊辰时长为37周至42周后分娩的胎儿的脐带，将其放入采集管内，使用酒精进行初步的消毒处理，随后将其放入清洁器皿中，向清洁器皿中注入浓度为0.85%的生理盐水中进行保存，在对胎儿的脐带收集前，应对胎儿的健康状态进行检测，保证收集到的脐带来自于健康的胎儿，并且在对胎儿的脐带进行收集前，应首先取得胎儿监护人及其家属的同意，并按照相关条例签订同意书；2）原料转运：将恒温箱内的温度设置在23℃至28℃之间，随后将清洁器皿放入到恒温箱内对恒温箱进行闭合，将恒温箱连同其内存放有胎儿脐带的清洁器皿一同运转至无菌实验室内，所述恒温箱在使用前及使用过后均需要进行消毒处理，胎儿的脐带从胎儿身上取下后到转运到无菌实验室内的时间应控制在四小时以内，以保证细胞的活性；3）预处理：将脐带从清洁器皿内取出，将其放置在洗涤器皿内，先向洗涤器皿内灌注医用酒精，在浸泡二十秒后将医用酒精倒出，随后使用浓度为90%生理盐水对脐带进行清洗两到三次，将残留的酒精清洗干净并清洗掉脐带表面的血迹，所述预处理过程中灌注医用酒精时应保证医用酒精能够完全淹没脐带的最高点，保证脐带完全浸没在医用酒精中；4）获取华通氏胶：将脐带放置在无菌工作台上，将其两端各减去2.0cm，随后将脐带的剩余部分均匀的剪成2.0cm～2.5cm长短的分段，使用镊子将分段后的脐带上的血管剔除下来，随后将剔除血管的脐带放入到装有生理盐水的容器中将其上残余的血迹清洗掉；5）剪碎获取的华通氏胶：在无菌工作台上将其剪成1立方毫米大小的碎片，将剪碎的碎片放入收集器皿内，在将华通氏胶进行剪碎的过程中将华通氏胶放置在带有栅格的无菌玻璃板上，借助放大镜在无菌玻璃板上进行剪碎；6）混合酶消化：将胰蛋白酶、胶原酶ⅲ、透明质酸酶、中性蛋白酶和弹性蛋白酶进行稀释混合，混合后的溶液中胰蛋白酶浓度为3%、胶原酶ⅲ浓度为5%、透明质酸酶浓度为4%、中性蛋白酶浓度为4%、弹性蛋白酶浓度为5%、其余为浓度为0.9%的生理盐水，去上述溶液放于烧杯中，将剪碎后的碎片放入到装有上述溶液的烧杯中，随后将烧杯放在水浴摇床上四小时，所述水浴摇床上的水温保持在35℃～38℃，且所述水浴摇床的摇动频率为每分钟220次。
15.7）收集细胞：将消化后的悬液过滤到离心试管中，并向离心试管内加入不含有钙和镁离子的平衡盐溶液进行稀释，随后将离心试管放在离心机上进行离心，对稀释后溶液内的成分进行分离，离心十分中将其顶部清液倒出，随后继续进行离心，此过程重复两次从而对细胞进行收集；8）初代细胞培养：将离心后收集到的细胞接种到细胞培养基上，随后将细胞培养基放入到培养箱内，将培养箱内的温度控制在35℃至38℃之间，并保证培养箱内的二氧化碳浓度为5%；
9）传代培养：在初代培养的细胞密度到达80%后，使用0.15%胶原酶进行消化收集并传代培养，在次代细胞密度到达80%后再次进行传代培养，从而培养出三代细胞；10）质量检验：对三代细胞的质量进行检验，通过检测其细胞表面的标记物来确定细胞的质量，判断是否合格，在对三代细胞进行检验的过程中，要进行微生物检测，其中支原体的检测结果若出现阳性则为不合格，且合格的细胞内毒素应小于0.5eu/ml。
16.在上述步骤中所使用到的全部器械在使用前及使用后均需要进行彻底的消毒处理本发明的有益效果是：该高效制备高活性脐带间充质干细胞的方法，整体的操作过程简单，并且在培养的过程中能够保证原代细胞的迁出率，并且经济成本较低，消化时间短，消化率易于进行把控，避免出现细胞贴壁率降低并且大量死亡的现象，并且培育出的细胞活性高，更加的便于后续临床治疗过程中使用。
17.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

技术特征：
1.一种高效制备高活性脐带间充质干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）原料采集：收集妊辰时长为37周至42周后分娩的胎儿的脐带，将其放入采集管内，使用酒精进行初步的消毒处理，随后将其放入清洁器皿中，向清洁器皿中注入浓度为0.85%的生理盐水中进行保存；2）原料转运：将恒温箱内的温度设置在23℃至28℃之间，随后将清洁器皿放入到恒温箱内对恒温箱进行闭合，将恒温箱连同其内存放有胎儿脐带的清洁器皿一同运转至无菌实验室内；3）预处理：将脐带从清洁器皿内取出，将其放置在洗涤器皿内，先向洗涤器皿内灌注医用酒精，在浸泡二十秒后将医用酒精倒出，随后使用浓度为90%生理盐水对脐带进行清洗两到三次，将残留的酒精清洗干净并清洗掉脐带表面的血迹；4）获取华通氏胶：将脐带放置在无菌工作台上，将其两端各减去2.0cm，随后将脐带的剩余部分均匀的剪成2.0cm～2.5cm长短的分段，使用镊子将分段后的脐带上的血管剔除下来，随后将剔除血管的脐带放入到装有生理盐水的容器中将其上残余的血迹清洗掉；5）剪碎获取的华通氏胶：在无菌工作台上将其剪成1立方毫米大小的碎片，将剪碎的碎片放入收集器皿内；6）混合酶消化：将胰蛋白酶、胶原酶ⅲ、透明质酸酶、中性蛋白酶和弹性蛋白酶进行稀释混合，混合后的溶液中胰蛋白酶浓度为3%、胶原酶ⅲ浓度为5%、透明质酸酶浓度为4%、中性蛋白酶浓度为4%、弹性蛋白酶浓度为5%、其余为浓度为0.9%的生理盐水，去上述溶液放于烧杯中，将剪碎后的碎片放入到装有上述溶液的烧杯中，随后将烧杯放在水浴摇床上四小时；7）收集细胞：将消化后的悬液过滤到离心试管中，并向离心试管内加入不含有钙和镁离子的平衡盐溶液进行稀释，随后将离心试管放在离心机上进行离心，对稀释后溶液内的成分进行分离，离心十分中将其顶部清液倒出，随后继续进行离心，此过程重复两次从而对细胞进行收集；8）初代细胞培养：将离心后收集到的细胞接种到细胞培养基上，随后将细胞培养基放入到培养箱内，将培养箱内的温度控制在35℃至38℃之间，并保证培养箱内的二氧化碳浓度为5%；9）传代培养：在初代培养的细胞密度到达80%后，使用0.15%胶原酶进行消化收集并传代培养，在次代细胞密度到达80%后再次进行传代培养，从而培养出三代细胞；10）质量检验：对三代细胞的质量进行检验，通过检测其细胞表面的标记物来确定细胞的质量，判断是否合格。2.根据权利要求1所述的一种高效制备高活性脐带间充质干细胞的方法，其特征在于：在对胎儿的脐带收集前，应对胎儿的健康状态进行检测，保证收集到的脐带来自于健康的胎儿，并且在对胎儿的脐带进行收集前，应首先取得胎儿监护人及其家属的同意，并按照相关条例签订同意书。3.根据权利要求1所述的一种高效制备高活性脐带间充质干细胞的方法，其特征在于：所述恒温箱在使用前及使用过后均需要进行消毒处理，胎儿的脐带从胎儿身上取下后到转运到无菌实验室内的时间应控制在四小时以内，以保证细胞的活性。4.根据权利要求1所述的一种高效制备高活性脐带间充质干细胞的方法，其特征在于，
所述预处理过程中灌注医用酒精时应保证医用酒精能够完全淹没脐带的最高点，保证脐带完全浸没在医用酒精中。5.根据权利要求1所述的一种高效制备高活性脐带间充质干细胞的方法，其特征在于，在上述步骤中所使用到的全部器械在使用前及使用后均需要进行彻底的消毒处理。6.根据权利要求1所述的一种高效制备高活性脐带间充质干细胞的方法，其特征在于，在将华通氏胶进行剪碎的过程中将华通氏胶放置在带有栅格的无菌玻璃板上，借助放大镜在无菌玻璃板上进行剪碎。7.根据权利要求1所述的一种高效制备高活性脐带间充质干细胞的方法，其特征在于，所述水浴摇床上的水温保持在35℃～38℃，且所述水浴摇床的摇动频率为每分钟220次。8.根据权利要求1所述的一种高效制备高活性脐带间充质干细胞的方法，其特征在于，在对三代细胞进行检验的过程中，要进行微生物检测，其中支原体的检测结果若出现阳性则为不合格，且合格的细胞内毒素应小于0.5eu/ml。

技术总结
本发明涉及间充质干细胞制备技术领域，且公开了一种高效制备高活性脐带间充质干细胞的方法，包括原料采集，收集妊辰时长为37周至42周后分娩的胎儿的脐带，将其放入采集管内，使用酒精进行初步的消毒处理，随后将其放入清洁器皿中，向清洁器皿中注入浓度为0.85%的生理盐水中进行保存；原料转运，随后将清洁器皿放入到恒温箱内，将恒温箱运转至无菌实验室内。该高效制备高活性脐带间充质干细胞的方法，整体的操作过程简单，并且在培养的过程中能够保证原代细胞的迁出率，并且经济成本较低，消化时间短，消化率易于进行把控，避免出现细胞贴壁率降低并且大量死亡的现象，并且培育出的细胞活性高，更加的便于后续临床治疗过程中使用。中使用。


技术研发人员：田程 曹森 贺国瑞 王玮玮
受保护的技术使用者：郑州普若提生物科技有限公司
技术研发日：2022.04.22
技术公布日：2023/9/22