一种提高间充质干细胞功能及分泌生长因子能力的方法与流程

1.本发明涉及医疗技术领域，具体为一种提高间充质干细胞功能及分泌生长因子能力的方法。


背景技术：

2.间充质干细胞(msc, mesenchymal stem cells)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层，属于多能干细胞，msc最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注，如间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复，间充质干细胞临床应用于解决多种血液系统疾病，心血管疾病，肝硬化，神经系统疾病，膝关节半月板部分切除损伤修复，自身免疫性疾病等方面取得了重大突破，挽救了更多病患的生命。此外，间充质干细胞在神经系统修复及更多方面具有长远的发展前景。
3.现有的间充质干细胞在培育时由于采用单一位置的间充质干细胞所以存在以下缺陷：一、间充质干细胞在进行培育时由于母体较为单一，所以培育出的间充质干细胞自身的功能性较少，二、由于细胞的活性较低，导致分泌生长因子的能力较低。


技术实现要素：

4.（一）解决的技术问题针对现有技术的不足，本发明提供了一种提高间充质干细胞功能及分泌生长因子能力的方法，具备提高自身功能性和自身活性和提高分泌生长因子的能力等优点，解决了背景技术中提出的问题。
5.（二）技术方案为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：本发明要解决的另一技术问题是提供一种提高间充质干细胞功能及分泌生长因子能力的方法，包括以下步骤：。
6.1）收集和培养：将来自不同位置的含有不同间充质干细胞组织进行剪切，然后接种到培养瓶中，组织之间的间隙为0-1.5cm，然后将培养瓶放入培养箱中进行孵育培养。
7.2）制备诱导间充质干细胞培养液：以高糖dmem为基础培养基，然后加入胎牛血清、青-链霉素和具有表皮细胞生长因子和胰岛素样生长因子的生长因子，其中胎牛血清用量为培养基总体积的为2-10%、青-链霉素用量为培养基总体积的1%；表皮细胞生长因子2-20ng/ml、胰岛素样生长因子5-40ng/ml。
8.3）将诱导间充质干细胞培养液加入到培育的间充质干细胞中：将制备好的诱导间充质干细胞培养液取出3ml加入到存放间充质干细胞的培养瓶中，制成诱导培养基，然后再次放入培养箱进行培养。
9.4）清洗间充质干细胞：将培养好的间充质干细胞的培养瓶，观察细胞融合度达80％-90％，然后去除培养基，然后放入勃脉力a清洗两次后，加入胰蛋白酶消化，待细胞悬浮后，加入无血清培养基中和，收集细胞，离心，弃去上清，用勃脉力a重悬细胞，调整密度，离心，弃去上清，此过程需要进行三次。
10.5）制备充质干细胞制剂：清洗后的间充质干细胞采用干细胞制剂液重悬，分装到2ml无菌冻存管中，封装0-8℃低温保存，24小时内使用；每管2ml体积，此为间充质干细胞制剂。
11.优选的，所述步骤三中，细胞传代时，需要加入胰蛋白酶对残留的组织进行消化，然后对细胞进行多次过滤和离心。
12.优选的，所述步骤二中生长因子还包括血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子，其中血管内皮生长因子30-100ng/ml,碱性成纤维细胞生长因子5-30ng/ml，所述诱导培养基中还含有抗坏血酸,所述的抗坏血酸的含量为0.5-10ug/ml。
13.优选的，所述步骤三中诱导培养基中需要添加氢化可的松,所述氢化可的松的含量为0.5-10ug/ml。
14.（三）有益效果与现有技术相比，本发明提供了一种提高间充质干细胞功能及分泌生长因子能力的方法，具备以下有益效果：1、该提高间充质干细胞功能及分泌生长因子能力的方法，通过采用不同位置的含有不同间充质干细胞组织和配置诱导间充质干细胞培养液的设置，在使用时可以大幅度增强间充质干细胞的功能，使最终得到的充质干细胞制剂内部的间充质干细胞功能性得到大大增强。
15.2、该提高间充质干细胞功能及分泌生长因子能力的方法，通过采用勃脉力a重悬细胞和调整细胞密度以及存放在0-8摄氏度中的设置，可以使间充质干细胞制剂中的间充质干细胞浓度较高，导致间充质干细胞的活性得到加强，使间充质干细胞的分泌生长因子能力进一步提升。
具体实施方式
16.下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
17.实施例一：一种提高间充质干细胞功能及分泌生长因子能力的方法，包括以下步骤：步骤一：收集和培养：将来自不同位置的含有不同间充质干细胞组织进行剪切，然后接种到培养瓶中，组织之间的间隙为0-1.5cm，然后将培养瓶放入培养箱中进行孵育培养。
18.步骤二：制备诱导间充质干细胞培养液：以高糖dmem为基础培养基，然后加入胎牛血清、青-链霉素和具有表皮细胞生长因子和胰岛素样生长因子的生长因子，其中胎牛血清用量为培养基总体积的为2-10%、青-链霉素用量为培养基总体积的1%；表皮细胞生长因子
2-20ng/ml、胰岛素样生长因子5-40ng/ml，生长因子还包括血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子，其中血管内皮生长因子30-100ng/ml,碱性成纤维细胞生长因子5-30ng/ml，诱导培养基中还含有抗坏血酸,的抗坏血酸的含量为0.5-10ug/ml。
19.步骤三：将诱导间充质干细胞培养液加入到培育的间充质干细胞中：将制备好的诱导间充质干细胞培养液取出3ml加入到存放间充质干细胞的培养瓶中，制成诱导培养基，然后再次放入培养箱进行培养，细胞传代时，需要加入胰蛋白酶对残留的组织进行消化，然后对细胞进行多次过滤和离心。
20.步骤四：清洗间充质干细胞：将培养好的间充质干细胞的培养瓶，观察细胞融合度达80％-90％，然后去除培养基，然后放入勃脉力a清洗两次后，加入胰蛋白酶消化，待细胞悬浮后，加入无血清培养基中和，收集细胞，离心，弃去上清，用勃脉力a重悬细胞，调整密度，离心，弃去上清，此过程需要进行三次，步骤三中诱导培养基中需要添加氢化可的松,氢化可的松的含量为0.5-10ug/ml。
21.步骤五：制备充质干细胞制剂：清洗后的间充质干细胞采用干细胞制剂液重悬，分装到2ml无菌冻存管中，封装2℃低温保存，24小时内使用；每管2ml体积，此为间充质干细胞制剂。
22.当封装在2℃进行低温保存时，保存时间越长，其活性越低，最终分泌生长因子能力也有较大的下降。
23.实施例二：一种提高间充质干细胞功能及分泌生长因子能力的方法，包括以下步骤：步骤一：收集和培养：将来自不同位置的含有不同间充质干细胞组织进行剪切，然后接种到培养瓶中，组织之间的间隙为0-1.5cm，然后将培养瓶放入培养箱中进行孵育培养。
24.步骤二：制备诱导间充质干细胞培养液：以高糖dmem为基础培养基，然后加入胎牛血清、青-链霉素和具有表皮细胞生长因子和胰岛素样生长因子的生长因子，其中胎牛血清用量为培养基总体积的为2-10%、青-链霉素用量为培养基总体积的1%；表皮细胞生长因子2-20ng/ml、胰岛素样生长因子5-40ng/ml，生长因子还包括血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子，其中血管内皮生长因子30-100ng/ml,碱性成纤维细胞生长因子5-30ng/ml，诱导培养基中还含有抗坏血酸,的抗坏血酸的含量为0.5-10ug/ml。
25.步骤三：将诱导间充质干细胞培养液加入到培育的间充质干细胞中：将制备好的诱导间充质干细胞培养液取出3ml加入到存放间充质干细胞的培养瓶中，制成诱导培养基，然后再次放入培养箱进行培养，细胞传代时，需要加入胰蛋白酶对残留的组织进行消化，然后对细胞进行多次过滤和离心。
26.步骤四：清洗间充质干细胞：将培养好的间充质干细胞的培养瓶，观察细胞融合度达80％-90％，然后去除培养基，然后放入勃脉力a清洗两次后，加入胰蛋白酶消化，待细胞悬浮后，加入无血清培养基中和，收集细胞，离心，弃去上清，用勃脉力a重悬细胞，调整密度，离心，弃去上清，此过程需要进行三次，步骤三中诱导培养基中需要添加氢化可的松,氢化可的松的含量为0.5-10ug/ml。
27.步骤五：制备充质干细胞制剂：清洗后的间充质干细胞采用干细胞制剂液重悬，分装到2ml无菌冻存管中，封装4℃低温保存，24小时内使用；每管2ml体积，此为间充质干细胞
制剂。
28.当封装在4℃进行低温保存时，温度较为适宜，在0-12小时之间使用时，其间充质干细胞的活性基本不受损，分泌生长因子能力较强。
29.实施例三：一种提高间充质干细胞功能及分泌生长因子能力的方法，包括以下步骤：步骤一：收集和培养：将来自不同位置的含有不同间充质干细胞组织进行剪切，然后接种到培养瓶中，组织之间的间隙为0-1.5cm，然后将培养瓶放入培养箱中进行孵育培养。
30.步骤二：制备诱导间充质干细胞培养液：以高糖dmem为基础培养基，然后加入胎牛血清、青-链霉素和具有表皮细胞生长因子和胰岛素样生长因子的生长因子，其中胎牛血清用量为培养基总体积的为2-10%、青-链霉素用量为培养基总体积的1%；表皮细胞生长因子2-20ng/ml、胰岛素样生长因子5-40ng/ml，生长因子还包括血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子，其中血管内皮生长因子30-100ng/ml,碱性成纤维细胞生长因子5-30ng/ml，诱导培养基中还含有抗坏血酸,的抗坏血酸的含量为0.5-10ug/ml。
31.步骤三：将诱导间充质干细胞培养液加入到培育的间充质干细胞中：将制备好的诱导间充质干细胞培养液取出3ml加入到存放间充质干细胞的培养瓶中，制成诱导培养基，然后再次放入培养箱进行培养，细胞传代时，需要加入胰蛋白酶对残留的组织进行消化，然后对细胞进行多次过滤和离心。
32.步骤四：清洗间充质干细胞：将培养好的间充质干细胞的培养瓶，观察细胞融合度达80％-90％，然后去除培养基，然后放入勃脉力a清洗两次后，加入胰蛋白酶消化，待细胞悬浮后，加入无血清培养基中和，收集细胞，离心，弃去上清，用勃脉力a重悬细胞，调整密度，离心，弃去上清，此过程需要进行三次，步骤三中诱导培养基中需要添加氢化可的松,氢化可的松的含量为0.5-10ug/ml。
33.步骤五：制备充质干细胞制剂：清洗后的间充质干细胞采用干细胞制剂液重悬，分装到2ml无菌冻存管中，封装6℃低温保存，24小时内使用；每管2ml体积，此为间充质干细胞制剂。
34.当封装在6℃进行低温保存时，温度略高，在0-6小时之间使用时，其间充质干细胞的活性基本不受损，随着保存时间的延长，间充质干细胞会进行自行发育，由于内部的营养较少，所以间充质干细胞的活性会下降，导致分泌生长因子能力下将判断标准：当充质干细胞制剂在封装6℃低温保存时，间充质干细胞的活性能够长时间保持稳定状态，使间充质干细胞分泌生长因子能力的能力能够处于较高的水平。
35.本发明的有益效果是：该提高间充质干细胞功能及分泌生长因子能力的方法，通过采用不同位置的含有不同间充质干细胞组织和配置诱导间充质干细胞培养液的设置，在使用时可以大幅度增强间充质干细胞的功能，使最终得到的充质干细胞制剂内部的间充质干细胞功能性得到大大增强，通过采用勃脉力a重悬细胞和调整细胞密度以及存放在0-8摄氏度中的设置，可以使间充质干细胞制剂中的间充质干细胞浓度较高，导致间充质干细胞的活性得到加强，使间充质干细胞的分泌生长因子能力进一步提升尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换
和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

技术特征：
1.一种提高间充质干细胞功能及分泌生长因子能力的方法，其特征在于：包括以下步骤：1）收集和培养：将来自不同位置的含有不同间充质干细胞组织进行剪切，然后接种到培养瓶中，组织之间的间隙为0-1.5cm，然后将培养瓶放入培养箱中进行孵育培养；2）制备诱导间充质干细胞培养液：以高糖dmem为基础培养基，然后加入胎牛血清、青-链霉素和具有表皮细胞生长因子和胰岛素样生长因子的生长因子，其中胎牛血清用量为培养基总体积的为2-10%、青-链霉素用量为培养基总体积的1%；表皮细胞生长因子2-20ng/ml、胰岛素样生长因子5-40ng/ml；3）将诱导间充质干细胞培养液加入到培育的间充质干细胞中：将制备好的诱导间充质干细胞培养液取出3ml加入到存放间充质干细胞的培养瓶中，制成诱导培养基，然后再次放入培养箱进行培养；4）清洗间充质干细胞：将培养好的间充质干细胞的培养瓶，观察细胞融合度达80％-90％，然后去除培养基，然后放入勃脉力a清洗两次后，加入胰蛋白酶消化，待细胞悬浮后，加入无血清培养基中和，收集细胞，离心，弃去上清，用勃脉力a重悬细胞，调整密度，离心，弃去上清，此过程需要进行三次；5）制备充质干细胞制剂：清洗后的间充质干细胞采用干细胞制剂液重悬，分装到2ml无菌冻存管中，封装0-8℃低温保存，24小时内使用；每管2ml体积，此为间充质干细胞制剂。2.根据权利要求1所述的一种提高间充质干细胞功能及分泌生长因子能力的方法，其特征在于：所述步骤三中，细胞传代时，需要加入胰蛋白酶对残留的组织进行消化，然后对细胞进行多次过滤和离心。3.根据权利要求1所述的一种提高间充质干细胞功能及分泌生长因子能力的方法，其特征在于：所述步骤二中生长因子还包括血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子，其中血管内皮生长因子30-100ng/ml,碱性成纤维细胞生长因子5-30ng/ml，所述诱导培养基中还含有抗坏血酸,所述的抗坏血酸的含量为0.5-10ug/ml。4.根据权利要求1所述的一种提高间充质干细胞功能及分泌生长因子能力的方法，其特征在于：所述步骤三中诱导培养基中需要添加氢化可的松,所述氢化可的松的含量为0.5-10ug/ml。

技术总结
本发明涉及以医疗技术领域，公开了一种提高间充质干细胞功能及分泌生长因子能力的方法，本发明通过收集和培养；制备诱导间充质干细胞培养液，以高糖DMEM为基础培养基，然后加入胎牛血清、青-链霉素和具有表皮细胞生长因子和胰岛素样生长因子的生长因子；将诱导间充质干细胞培养液加入到培育的间充质干细胞中；清洗间充质干细胞；制备充质干细胞制剂这一系列过程的设置，通过采用不同位置的含有不同间充质干细胞组织和配置诱导间充质干细胞培养液的设置，使最终得到的充质干细胞制剂内部的间充质干细胞功能性得到大大增强，可以使间充质干细胞制剂中的间充质干细胞浓度较高，使间充质干细胞的分泌生长因子能力进一步提升。充质干细胞的分泌生长因子能力进一步提升。


技术研发人员：田程 曹森 何虹瑜 赵自文
受保护的技术使用者：郑州普若提生物科技有限公司
技术研发日：2022.04.22
技术公布日：2023/9/22