一种lncRNA分子及其在结肠癌辅助诊断中的应用

一种lncrna分子及其在结肠癌辅助诊断中的应用
技术领域
1.本发明涉及分子标记技术领域，具体涉及一种lncrna分子及其在结肠癌辅助诊断中的应用。


背景技术：

2.结直肠癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率高。目前针对结肠癌的治疗主要以手术为主，结合放疗化疗为辅的综合治疗方法。但目前结肠癌的预后情况很差，术后存在生存率低、耐药性高或复发转移的情况，严重影响着国民身心健康。
3.在临床实践中结肠癌的预后分级可作为其预后指标，而分子标志物被认为是结肠癌预后生存诊断的新发展方向。目前，研究者发现包括cd166、cd44、cd29、lgr5和β-catenin等基因在结肠癌组织中存在异常表达的情况，对这些关键分子标志在患者中的表达量测量有望成为新的结肠癌的预后诊断方式。尽管如此，这些标志物仍未进入临床应用阶段，而许多更加特异的结肠癌分子标志物有待开发。


技术实现要素：

4.针对现有技术所存在的上述缺点，本发明公开了lncrna分子 lncrna 495810，其可作为一种结肠癌分子标志物或靶点，可以有效预测结肠癌病人术后生存期，从而为结肠癌预后诊断提供了新途径，为临床医生对于结肠癌病情分析提供了参考依据，lncrna 495810在结肠癌中高表达，且可以促进结肠癌细胞增殖抑制其凋亡，能够应用在结肠癌辅助诊断中。
5.为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
6.一种lncrna分子，所述的lncrna分子命名为lncrna 495810；
7.所述的lncrna 495810的核苷酸序列为seq id no.1。
8.进一步的，lncrna分子的检测方法，包括以下步骤：
9.(1)验证lncrna 495810是否是非编码rna；
10.(2)验证lncrna 495810在结肠癌中差异表达；
11.(3)验证lncrna 495810在结直肠癌细胞中发挥的功能。
12.更进一步的，在步骤(1)中，验证lncrna 495810是否是非编码rna的过程为：
13.通过预测开发阅读框orf验证lncrna 495810是lncrna，且 lncrna 495810的orf小于200nt；用cpad进行预测，表明lncrna 不具有编码能力，且lncrna 495810在30种哺乳动物中具有较高的保守性。
14.在步骤(2)中，所述的lncrna 495810在结直肠癌细胞中高表达，且其在结直肠癌组织中的表达高于癌旁组织。
15.在步骤(3)中，所述的lncrna 495810促进结直肠癌细胞增殖，抑制细胞凋亡。
16.此外，本发明还提供了lncrna分子在结肠癌辅助诊断中的应用。
17.有益效果
18.采用本发明提供的技术方案，与已知的公有技术相比，具有如下有益效果：
19.本发明公开了lncrna分子lncrna495810，其可作为一种结肠癌分子标志物或靶点，可以有效预测结肠癌病人术后生存期，从而为结肠癌预后诊断提供了新途径，为临床医生对于结肠癌病情分析提供了参考依据，lncrna495810在结肠癌中高表达，且可以促进结肠癌细胞增殖抑制其凋亡，基于此，lncrna495810的发明有利于进一步阐明结肠癌的发生发展的分子机制，本发明兼具应用前景和理论价值。
附图说明
20.图1为本发明验证lncrna495810是非编码rna的示意图；
21.图2为本发明lncrna495810的临床特征的示意图；
22.图3为本发明lncrna495810在结肠癌中的功能分析的示意图。
具体实施方式
23.本发明公开了一种lncrna分子(lncrna495810)及其在结肠癌辅助诊断中的应用，lncrna495810在结肠癌组织中的表达量明显高于癌旁组织，且其表达可作为结肠癌预后的风险预测因子。lncrna495810可促进结肠癌细胞的增殖，抑制其凋亡，基于此，lncrna495810可作为结肠癌分子标志物或靶点，应用于结肠癌临床早期诊断、预后判断或靶向治疗，并有利于进一步阐明结肠癌的发生发展机理、信号通路等，极具理论价值和应用前景。
24.下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
25.本发明提供了一种lncrna分子，lncrna分子命名为lncrna495810；
26.lncrna495810的核苷酸序列为seqidno.1。
27.其中，lncrna分子的检测方法，包括以下步骤：
28.(1)验证lncrna495810是否是非编码rna。
29.如图1所示(图1中，a：orffinder预测lncrna495810的开发阅读框；b：cpad预测lncrna495810的翻译能力；c：ucsc预测lncrna495810在哺乳动物中的保守性；d：qpcr检测lncrna495810的亚细胞定位)，根据lncrna的enst编号(enst00000495810-homo)将其命名为lncrna495810，定位于chr7:26069506-26130778，长度为484bp。我们首先通过预测开发阅读框(orf)来验证lncrna495810是lncrna，发现lncrna495810的orf是小于200nt的，说明该rna可能是非编码的rna(图1a)。同时，cpad预测结果也表明该rna不具有编码能力(图1b)。进一步预测显示lncrna495810在30种哺乳动物中具有较高的保守性(图1c)。对不同结肠癌细胞进行核质分离，检测该lncrna在细胞中的定位，发现lncrna495810主要分布在细胞核(图1d)。以上结果表明lncrna495810不具有编码潜能，且在哺乳动物中具有保守。
30.(2)验证lncrna495810在结肠癌中差异表达。
31.如图2所示(图2中，a：qpcr实验验证检测lncrna495810在正常人结肠上皮细胞(fhc)和不同结肠癌细胞中的相对表达量；b；lncrna495810在68对肿瘤组织及相邻组织中的相对表达量；c:lncrna495810在结肠癌中表达的生存分析)，比较lncrna495810在正常结肠上皮细胞fhc及6种不同结肠癌细胞中的表达，发现其在结直肠癌细胞中高表达
(图2a)。进一步比较了lncrna 495810在 68对病人结肠癌组织样本及癌旁组织中的表达，发现其在结直肠癌组织中的表达高于癌旁组织，差异具有统计学意义(p《0.05)(图2b)。随后分析了其表达与结肠癌患者生存的关系，结果显示：相比低表达组，lncrna 495810高表达的患者生存率显著下降(图2c)。
32.(3)验证lncrna 495810在结直肠癌细胞中发挥的功能。
33.如图3所示(图3中，a：过表达495810后，qpcr实验检测其表达；b：sirna敲除495810后，qpcr实验检测其表达；c：mtt检测过表达495810对结肠癌细胞增殖的影响；d：mtt检测抑制495810 对结肠癌细胞增殖的影响；e：过表达495810后，细胞流式实验检测其对结肠癌凋亡的影响；f：敲低495810后，细胞流式实验检测对凋亡的影响)，转染lncrna 495810过表达载体后，其表达显著升高(图 3a)，lncrna 495810sirna转染细胞后，其表达显著下调(图3b)。进一步采用cck8法检测lncrna过表达及干扰后细胞的增殖能力，并绘制细胞生长曲线，发现lncrna过表达促进肿瘤细胞存活(图3c)，而lncrna干扰细胞存活下降(图3d)。采用流式检测细胞凋亡，发现lncrna 495810过表达后凋亡率下降(图3e)，干扰后凋亡率增加 (图3f)。以上结果显示lncrna495810，暗示其具有癌基因的潜能。
34.实施例1：qpcr检测lncrna 495810的表达
35.细胞总rna提取：待6孔板中结肠癌细胞长满时，弃去培养基，加入500μl rna iso plus(trizol)，吹打细胞，移入无rna酶的ep 管中，室温静置5min；加入100μl氯仿，剧烈振荡15s，静置5min 后，于12000rpm、4℃下离心15min；离心后取上层含rna水相；加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置10min后，于12000 rpm、4℃下离心10min，弃上清；沿管壁小心加入500μl 75％乙醇，轻轻颠倒混匀后，于12000rpm、4℃下离心5min；离心后弃去上清，将沉淀置于超净台吹干，直至变透明；在ep管内加入适量depc水(约 20到30μl)溶解rna，在65℃水浴助溶。
36.rna浓度检测：取1μl的rna，用nanodrop检测rna的浓度和纯度。
37.反转录cdna：提取的rna用all-in-one first strand cdna synthesiskitⅱ试剂盒进行反转录。
38.实时定量pcr：使用chamq sybr qpcr master mix试剂盒进行实时定量pcr，gapdh作为其内参。
39.实施例2：cck8实验检测细胞增殖
40.选取生长状态良好的结肠癌细胞，按3,000个/100μl的密度接种于96孔板中。在37℃，5％co2的环境中培养12h；turbofect试剂将495810质粒或sirna转染到crc细胞中；时间梯度处理后，在超净台中，弃去旧培养基，每孔用pbs洗两次，加入100μl新鲜的 rpmi-1640培养基，每孔再加入10μl cck8试剂；继续培养3h，于 450nm处测96孔板各孔的吸光值。
41.实施例3：annexin v/pi双染色法检测细胞凋亡
42.把结肠癌细胞接种到6孔板，待细胞密度长到底面积的60％-70％， turbofect试剂将495810质粒或sirna转染到crc细胞中，在37℃， 5％co2的环境中培养48h；去培养基，pbs洗细胞，无edta胰酶消化细胞直到变圆，立刻停止消化；将细胞转到离心管后，用pbs清洗细胞并离心；加入适量binding buffer悬浮细胞，再加入annexinv和 pi各5μl，室温避光保存10min；流式细胞仪分析hct-116/l细胞的凋亡情况。
43.以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例
对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不会使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

技术特征：
1.一种lncrna分子，其特征在于，所述的lncrna分子命名为lncrna 495810；所述的lncrna 495810的核苷酸序列为seq id no.1。2.如权利要求1所述的一种lncrna分子，其特征在于，所述的lncrna分子的检测方法，包括以下步骤：(1)验证lncrna 495810是否是非编码rna；(2)验证lncrna 495810在结肠癌中差异表达；(3)验证lncrna 495810在结直肠癌细胞中发挥的功能。3.根据权利要求2所述的一种lncrna分子，其特征在于，在步骤(1)中，验证lncrna 495810是否是非编码rna的过程为：通过预测开发阅读框orf验证lncrna 495810是lncrna，且lncrna 495810的orf小于200nt；用cpad进行预测，表明lncrna不具有编码能力，且lncrna 495810在30种哺乳动物中具有较高的保守性。4.根据权利要求2所述的一种lncrna分子，其特征在于，在步骤(2)中，所述的lncrna 495810在结直肠癌细胞中高表达，且其在结直肠癌组织中的表达高于癌旁组织。5.根据权利要求2所述的一种lncrna分子，其特征在于，在步骤(3)中，所述的lncrna 495810促进结直肠癌细胞增殖，抑制细胞凋亡。6.如权利要求1-5任意一项所述的一种lncrna分子在结肠癌辅助诊断中的应用。

技术总结
本发明涉及分子标记技术领域，具体涉及一种lncRNA分子及其在结肠癌辅助诊断中的应用；本发明公开了lncRNA分子lncRNA495810，其可作为一种结肠癌分子标志物或靶点，可以有效预测结肠癌病人术后生存期，从而为结肠癌预后诊断提供了新途径，为临床医生对于结肠癌病情分析提供了参考依据，lncRNA 495810在结肠癌中高表达，且可以促进结肠癌细胞增殖抑制其凋亡，能够应用在结肠癌辅助诊断中。能够应用在结肠癌辅助诊断中。能够应用在结肠癌辅助诊断中。


技术研发人员：武海丽 崔凯丽 李卓玉 曹利佳 李汉卿
受保护的技术使用者：山西大学
技术研发日：2022.04.19
技术公布日：2023/9/22