一种神经氨酸酶2抑制剂及其应用

1.本发明属于生物医药技术领域，涉及神经氨酸酶2(neu2)是糖尿病血管糖萼损伤的一个关键靶点以及一种褐藻来源的神经氨酸酶2抑制剂及其制备方法与应用，具体可应用于预防和治疗糖尿病血管糖萼损伤和糖尿病血管并发症。


背景技术：

2.糖尿病是严重影响人类的生命及健康水平的重大疾病之一，在我国发病率呈逐年上升。根据美国糖尿病学会和世界卫生组织标准的加权诊断，截止到2017年，中国成年人糖尿病患病率达到了11.2％。由于病因不清，病情迁延不愈难以有效控制，进而导致糖尿病血管病变引起的合并症如动脉粥样硬化症、高血压及视网膜、肾、心脏等合并症高发，这是糖尿病致死的首要原因。
3.血管内皮是血管的第一道防线，内皮直接与血液接触，感受血流动力和各种物质的变化，并通过内皮生理屏障功能和分泌一系列血管活性物质如一氧化氮(no)、前列环素(pgi2)、内皮素(et-1)等，保护血管生理功能和内环境的稳定。血管内皮损伤和功能障碍是血管系统疾病发生和发展的主要原因。
4.血管内皮细胞腔侧表面覆盖着一层由多糖和跨膜蛋白组成的糖萼，构成了血管内皮屏障[7]。内皮细胞膜核心蛋白与一条或多条糖胺聚糖(gags)链通过共价键结合而成的蛋白聚糖(pgs)构成了糖萼骨架结构。核心蛋白包括跨膜多配体蛋白聚糖(syndecan)家族和锚定在内皮细胞膜上的磷脂酰肌醇蛋白聚糖(glypican)等。糖萼gags包括硫酸乙酰肝素(hs)、硫酸软骨素(cs)和透明质酸(ha)等，其中hs约占50％～90％。生理情况下，糖萼构成内皮细胞表面海绵状保护层，血浆可溶性成分(如白蛋白)填充于糖萼“孔隙”中，组成内皮细胞表层。ha和hs都参与了内皮糖萼的完整性及功能，其中hs位于糖萼外层，主要维持其结构，而ha和cs位于靠近内层，有助于维持糖萼的通透性。
[0005]
糖萼作为内皮细胞表层的骨架结构，是整合剪切应力、细胞因子、化学因子等信号传导的关键平台，是血管内皮功能的关键调控者，是血管内外液体平衡调控的关键环节。糖萼作为血流剪切应力的“传感器”，能够减弱或抵消血流对内皮表面的剪切应力减弱至理论上可忽略的程度。选择性降解某些糖萼成分(如hs或ha)或者沉默某些特定基因(如glypican-1)能够抑制剪切应力引起的内皮细胞enos活化以及no的生成。负电性的内皮糖萼与吸附的血浆蛋白位于血液和内皮细胞之间，构成了血管壁的天然选择性通透屏障，限制了白细胞、血小板和红细胞与内皮细胞的接触。糖萼gags链形成的非均相表面为大量血源性分子的停泊提供了可能，高度负荷电性的硫酸基团的存在使得蛋白聚糖能够结合多种生长因子、细胞因子、细胞活素包括fgf、tgf等，将它们隔离在细胞表层胞外基质中，并有利于这些活性因子在受到外部刺激时快速释放并发挥细胞功能调节作用。
[0006]
生理状态下，糖萼维持着合成与降解的动态平衡。糖萼结构的破坏会对其功能产生极大影响，糖萼降解引起白细胞黏附及血栓形成。在维持糖萼稳态过程中参与糖萼合成与降解的酶起到了关键作用。糖尿病人在持续高血糖状态会引起内皮糖萼损伤，导致糖萼
硫酸乙酰肝素和透明质酸等糖胺聚糖降低。研究发现，糖尿病患者糖萼减少50％，导致血管通透性增高，促进白细胞黏附和活性氧产生，降低no合成，并引起血管内皮功能的进一步恶化。因此保护血管内皮糖萼的完整性是防治糖尿病血管并发症的重要途径。
[0007]
神经氨酸酶，也称为唾液酸酶(neus)，是一种酶家族，通过从内源性糖缀合物中去除唾液酸来调节细胞表面的唾液酸表达。末端唾液酸可以促进内皮屏障的完整性。神经氨酸酶是一个大家族，存在于许多生物中，包括病毒、细菌、真菌、原生动物、鸟类和哺乳动物。神经氨酸酶存在于许多哺乳动物器官。神经氨酸酶2(neu2)neu2是一种可溶性蛋白，存在于细胞质和质膜中，参与成肌细胞和神经元的分化；neu3是一种完整的膜蛋白，定位于质膜、内溶酶体膜和溶酶体膜的小凹微区；neu4定位于溶酶体、线粒体或内质网。neu3和neu4参与神经元分化、凋亡和粘附。
[0008]
本发明首次公开了神经氨酸酶2(neu2)是糖萼降解的一个关键靶点。褐藻多糖硫酸酯能够靶向神经氨酸酶2，与神经氨酸酶互作并且可有效抑制神经氨酸酶2活性，从而抑制糖尿病血管糖萼降解，保护血管内皮糖萼功能。


技术实现要素：

[0009]
本发明的目的之一是公开了神经氨酸酶2(neu2)是糖萼降解的一个关键靶点，目的之二是提供一种神经氨酸酶2抑制剂，具体可应用于预防和治疗糖尿病血管糖萼损伤和糖尿病血管并发症。细胞实验和动物实验表明，褐藻多糖硫酸酯可以减少糖尿病细胞/血管内皮糖萼脱落。
[0010]
所述的神经氨酸酶2抑制剂为来源于褐藻的褐藻多糖硫酸酯，其主要组成单糖为岩藻糖，岩藻糖含量在30％-45％之间，水解硫酸基含量在25-45％之间，糖醛酸含量在0％-5％之间，分子量在2-200kd之间。
[0011]
所述的褐藻多糖来源于海洋褐藻，海洋褐藻包括海带、裙带菜、马尾藻、墨角藻、泡叶藻、昆布、枝管藻、鼠尾藻、羊栖菜等中的一种或多种。其主要制备方法为褐藻采用水提,经过滤醇沉得到粗多糖,粗多糖重新溶于水后,加入mgcl2至0.05mol/l，并加入乙醇至浓度为20％，搅拌，离心去除沉淀，上清继续加入乙醇至终浓度为70-75％，收集沉淀干燥，干燥后的样品继续溶于水，经deae-sepharose cl-6b柱色谱分离，收集1mol/lnacl洗脱组分，脱盐干燥得到褐藻多糖硫酸酯lwmf。
[0012]
所述的褐藻多糖具有神经氨酸酶2抑制活性。
[0013]
所述的褐藻多糖抑制神经氨酸酶2可以用于治疗和预防糖尿病血管糖萼损伤。
[0014]
所述预防和治疗糖尿病血管糖萼损伤相关症状/疾病的药品、保健品、食品及生物材料中可添加药学及生物学上可接受的载体或辅料。
附图说明
[0015]
图1huvec过表达neu2糖萼电镜图像(nc正常对照组；neu2
+
:neu2过表达组)
[0016]
图2huvec过表达neu2糖萼免疫荧光图像。huvec免疫荧光图像，绿色：wga(n-乙酰葡萄糖胺，n-乙酰神经氨酸)，蓝色：dapi，红色：dil。neu2
+
：neu2过表达组。
[0017]
图3.lmwf减轻db/db小鼠主动脉/肾脏糖萼脱落。a：小鼠主动脉/肾脏血管糖萼透射电镜图像；gbm:肾小球基底膜；eglx：内皮糖萼；pglx：足细胞糖萼。b：小鼠主动脉/肾脏糖
萼免疫荧光图像；绿色：wga(n-乙酰葡萄糖胺，n-乙酰神经氨酸)，蓝色：dapi。c-d：小鼠主动脉(c)和肾脏(d)血管糖萼长度。e：小鼠全身糖萼容积。f-i：小鼠血浆40kda dextran-texas red及500kda dextran-fitc荧光强度(f：neg，g：db/db，h：lmwf，i：sul)。j-m：小鼠血清中唾液酸(j)、硫酸乙酰肝素(k)、透明质酸(l)和syndecan 1(m)的含量。数据以平均值
±
sem呈现。*,p《0.05versus db/db；**,p《0.01versus db/db.
[0018]
图4免疫印迹检测小鼠肾脏神经氨酸酶1和神经氨酸酶2表达情况。数据以平均值
±
sem表示。*,p《0.05versus db/db；**,p《0.01versus db/db.
[0019]
图5.褐藻多糖硫酸酯lmwf与神经氨酸酶2存在相互作用并且具有抑制神经氨酸酶的活性。a：lmwf(左)和奥司他韦磷酸(右)对神经氨酸酶的抑制活性曲线。b：lmwf对高糖培养的huvec细胞内神经氨酸酶2的活性影响。neg：huvec在含有5.6mm d-葡萄糖的dmem培养基中培养；vh：huvecs在含有56mm d-葡萄糖的dmem培养基中培养；25、50、100、200：在含有56mm d-葡萄糖的dmem培养基中培养huvecs，并与25、50、100或200μg/ml lmwf共处理。c：elisa检测lmwf与neu2的相互作用。d：spr检测lmwf与neu2的相互作用。数据以平均值
±
sem表示。*,p《0.05versus vh；**,p《0.01versus vh.
[0020]
图6.lmwf对高糖环境下huvec的糖萼有保护作用。a：huvec糖萼透射电镜图像。b：huvec糖萼免疫荧光图像；绿色：wga(n-乙酰葡萄糖胺，n-乙酰神经氨酸)，蓝色：dapi，红色：dil。c：huvec匀浆中各实验组神经氨酸酶2的western blot分析以及相应蛋白的比例。neg：huvec在含有5.6mm d-葡萄糖的dmem培养基中培养；vh：huvecs在含有56mm d-葡萄糖的dmem培养基中培养；25、50、100、200：huvecs分别在含有56mm d-葡萄糖的dmem培养基中培养，并与25、50、100或200μg/ml lmwf共处理。数据以平均值
±
sem表示。*,p《0.05versus vh；**,p《0.01versus vh.
具体实施方式
[0021]
通过以下具体实施例对本发明方案作进一步的具体说明，但本发明要求保护的范围并不局限于实例表述的范围。
[0022]
实施例1褐藻多糖硫酸酯的制备
[0023]
(1)将5kg海带除去泥沙，用20倍海带重量的水在100℃提取3小时，提取2次。除去藻体，合并2次提取液，用硅藻土抽滤，滤液浓缩至原体积的1/4，加入浓缩液4倍体积的无水乙醇沉淀，过滤得粗多糖，多糖粗品得率为：4.84％。
[0024]
(2)将粗多糖溶于蒸馏水配成质量浓度为1.5％的溶液，加入2mol/l mgcl2使mgcl2终质量浓度为0.05mol/l，同时加入无水乙醇，使乙醇终重量浓度为20％，搅拌生成沉淀，离心除去沉淀，取上清液加入95％乙醇，使乙醇终重量浓度为70-75％，搅拌生成沉淀，离心收集沉淀，将沉淀溶于蒸馏水配成质量浓度2％的水溶液，装入透析袋内，用3500da透析袋透析2天，浓缩透析袋内溶液至比重1.05，冻干，得率为2.71％。
[0025]
(3)取上述冻干得到的多糖溶于水，配成浓度为2.5％的水溶液，上样到以deae-sepharose-cl-6b(sigma公司)为载体柱层析，依次用0.1mol/l nacl、0.5mol/lnacl、1.0mol/l nacl、1.5mol/l nacl和2.0mol/l nacl溶液洗脱，收集各洗脱液，分别装入3500da透析袋内透析、浓缩透析袋内溶液至比重1.05，冻干。其中由1.0mol/lnacl洗脱所得的白色固体即为褐藻多糖硫酸酯lmwf。其化学组成结果如表1所示。
[0026]
表1褐藻多糖硫酸酯(lmwf)的化学组成分析(％，w/w)
[0027][0028]
由结果可知，褐藻多糖硫酸酯lmwf的分子量为8100da，岩藻糖和硫酸基含量较高，分别为43.43％和41.80％，葡萄糖醛酸含量较低，仅有3.1％。中性单糖组成结果表明除岩藻糖和半乳糖外，还含有少量的甘露糖、葡萄糖和鼠李糖
[0029]
实施例2神经氨酸酶2过表达会引起内皮细胞huvec糖萼脱落
[0030]
人脐静脉内皮细胞(huvecs)购买自american type culture collection(atcc)。细胞在含有10％胎牛血清(bi，以色列)的dmem(hyclone,cytiva,china)培养基中培养，培养箱温度维持在37℃，co2含量维持在5％。细胞被分为6组：1)neg：huvecs在含5.6mm的d-葡萄糖的dmem培养基中培养：2)vh：huvecs在含有56mm d-葡萄糖的dmem培养基中培养；3)25、50、100、200：huvecs分别在含56mm d-葡萄糖的dmem培养基中培养，并分别给药25、50、100、200μg/ml实施例1制备的lmwf共培养。neu2+：lipofectamine 3000转染试剂(invitrogen,usa)瞬时转染质粒neu2到huvec细胞中。
[0031]
细胞内神经氨酸酶活性检测：huvec细胞在测定缓冲液(20mm柠檬酸ph 4.5,60mm nacl,1mm mgcl2)中超声裂解。细胞裂解液加入到含有0.1mm2
′‑
(4-methylumbelliferyl)-α-d-n-acetylneuraminic acid(4-munana,sigma)的100μl测定缓冲液中，37℃孵育4h(seol et al.,2021)。50μl 0.1m的甘氨酸-氢氧化钠(ph 10.5)缓冲液终止反应。在365nm和450nm的激发和发射光下，测定所得的4-lumbelliferone(4-mu)的荧光信号，即可反应细胞内的神经氨酸酶活性。
[0032]
结果表明，神经氨酸酶2(neu2)的过表达引发huvec糖萼脱落。neu2过表达组(neu2+组)糖萼缺失(图1)，wga表达弱(图2)，而nc组糖萼完整清晰，wga表达强。同样，高浓度葡萄糖(56mm)培养的huvec细胞显示neu2高表达。
[0033]
实施例3自发性2型糖尿病db/db小鼠主动脉/肾脏神经氨酸酶2高表达引起糖萼脱落，褐藻多糖硫酸酯lmwf减轻db/db小鼠主动脉/肾脏糖萼脱落
[0034]
糖尿病引起db/db小鼠主动脉和肾小球血管糖萼脱落，而实施例1制备的lmwf可减轻糖尿病小鼠的主动脉/肾脏糖萼脱落。图3显示，正常情况下，db/+小鼠(neg组)糖萼绒毛结构完整清晰，可见明显的针刺状结构，wga标记小鼠主动脉/肾脏的细胞外糖萼层表现出强烈且连续的绿色荧光表达。而db/db组小鼠主动脉以及肾脏糖萼完全脱落，wga标记小鼠肾脏/主动脉内皮细胞外糖萼的绿色荧光几乎不表达。糖萼降解酶在糖萼的形成中起着重要的作用，可以通过影响糖萼合成和降解酶来保护糖萼的完整性。免疫印迹分析调控糖萼降解酶的蛋白表达情况，可以看到db/db小鼠主动脉和肾脏神经氨酸酶2的表达水平显著上调，而神经氨酸酶1表达水平基本不变(图4)。表明神经氨酸酶2是调控糖萼脱落的一个重要靶点。
[0035]
lmwf对db/db小鼠的血管糖萼有保护作用。lmwf对db/db小鼠肾脏其他糖萼降解酶(hyal2、mmp-2、cho、has2、neu1)均无显著影响，但lmwf可显著下调neu2的表达(图4)。lmwf给药后，db/db小鼠主动脉/肾脏糖萼结构恢复清晰完整，可见针刺状结构，并且wga恢复强
烈的绿色荧光表达。糖萼屏障功能实验结果显示，lmwf能保护db/db小鼠全身糖萼，使db/db小鼠全身糖萼容积恢复到正常水平。同时，与neg组相比，db/db小鼠血清中糖萼组成成分如唾液酸(sia)、硫酸乙酰肝素(hs)、透明质酸(ha)和syndecan1(syn1)水平升高。lmwf给药可通过靶向neu2减少db/db小鼠血清中这些糖萼组成成分的含量，减少糖萼脱落。
[0036]
实施例4褐藻多糖硫酸酯lmwf可以抑制神经氨酸酶2(neu2)活性并且与neu2存在相互作用
[0037]
图5显示，与神经氨酸酶的抑制剂磷酸奥司他韦相比，lmwf在体外表现出更强的神经氨酸酶2抑制活性，lmwf浓度在100μg/ml的时候，对神经氨酸酶2的抑制率可以接近50％。而在同样的条件下奥司他韦磷酸的体外神经氨酸酶2抑制活性不到30％。同时，lmwf可以抑制高糖引发的huvec神经氨酸酶2活性。高糖情况下，huvec表达出高的神经氨酸酶2活性，而lmwf可以抑制高糖引发的神经氨酸酶2的表达。体外elisa和spr实验显示lmwf与neu2存在相互作用，平衡解离常数(kd)为3.075μm，结合速率常数(ka)为2018m-1s-1，解离速率常数(kd)为0.006204s-1。
[0038]
实施例5褐藻多糖硫酸酯lmwf对高糖环境下huvec的糖萼有保护作用
[0039]
细胞实验进一步证明lmwf对糖萼有保护作用。图6显示，以56mm葡萄糖浓度建立培养细胞的高糖环境(实施例4中的高糖)。高浓度葡糖引起huvec糖萼脱落。lmwf可缓解高糖诱导的huvec糖萼脱落，恢复高糖损伤的huvec的糖萼，使绒毛结构完整、清晰，重现糖萼针状结构，恢复wga的高表达。

技术特征：
1.神经氨酸酶2作为药物靶点在筛选糖尿病血管内皮糖萼损伤保护药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物是抑制所述神经氨酸酶2的表达水平的药物。3.一种权利要求1所述的褐藻来源的神经氨酸酶2抑制剂，其特征在于：所述的神经氨酸酶2抑制剂为褐藻多糖硫酸酯。4.根据权利要求3所述的褐藻来源的神经氨酸酶2抑制剂，其特征在于：所述的褐藻多糖硫酸酯来源于褐藻，其主要组成单糖为岩藻糖；其岩藻糖含量在30％-45％之间，水解硫酸基含量在25-45％之间，糖醛酸含量在0％-5％之间，分子量2-200kd。5.根据权利要求3或4所述的褐藻来源的神经氨酸酶2抑制剂，其特征在于：所述的褐藻多糖硫酸酯来源于海洋褐藻门中的一种或多种褐藻。6.根据权利3所述的褐藻来源的神经氨酸酶2抑制剂，其特征在于：褐藻多糖硫酸酯通过抑制神经氨酸酶2治疗和预防糖尿病血管糖萼损伤。7.根据权利要求6所述的褐藻来源的神经氨酸酶2抑制剂，其特征在于：所述预防和治疗或改善糖尿病血管糖萼损伤相关症状/疾病的药品、保健品、食品及生物材料中可添加药学及生物学上可接受的载体或辅料。

技术总结
本发明属于生物医药技术领域，涉及神经氨酸酶2作为药物靶点在筛选糖尿病血管内皮糖萼损伤保护的药物中的应用以及一种神经氨酸酶2抑制剂及其制备方法与应用。本发明公开了神经氨酸酶2(NEU2)是调控糖尿病血管糖萼降解的一个关键靶点。褐藻多糖硫酸酯与神经氨酸酶2(NEU2)存在相互作用并且具有神经氨酸酶抑制活性。此外，褐藻多糖硫酸酯可以下调糖尿病小鼠肾脏神经氨酸酶2表达并且减轻糖尿病小鼠主动脉/肾脏糖萼脱落。本发明的褐藻多糖硫酸酯可用于制备神经氨酸酶2抑制剂并且可用于制备防治糖尿病血管糖萼损伤及糖尿病血管并发症的药物，具有良好的开发利用价值。具有良好的开发利用价值。


技术研发人员：张全斌 李志 吴宁 耿丽华 王晶 岳洋
受保护的技术使用者：中国科学院海洋研究所
技术研发日：2023.06.26
技术公布日：2023/9/22