一种荧光增益型NC膜及其制备方法和应用

一种荧光增益型nc膜及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于材料学领域，特别是涉及一种荧光增益型nc膜及其制备方法和应用。


背景技术：

2.硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane，简称nc膜)，是胶体金试纸中用做c/t线的承载体，同时也是免疫反应的发生之处，nc膜是生物学试验中最重要的耗材之一，目前的nc膜大多通过在c/t线上设置与目标物相对应的抗体，通过颜色的改变来进行识别，灵敏度较低。
3.光子晶体因其独特的光学特性，在低浓度的离子、dna、蛋白质和生物探针等生物材料的高灵敏检测领域有着重大研究意义。借助光子晶体固有的荧光增强放大荧光信号的性质，可实现光子晶体生物传感器检测灵敏度的大幅度提升，降低生物检测限，但是，目前的光子晶体主要通过与待测物进行特异性识别，形成相应的发光体系，例如共振能量转移识别体系进行检测，检测体系较复杂，制备难度较大，成本较高。


技术实现要素：

4.为改善现有技术的不足，本发明提供一种光子晶体型nc膜，所述光子晶体型nc膜包含nc膜和位于nc膜光子晶体区域的光子晶体结构，所述光子晶体区域包括c线和t线所在的区域。
5.根据本发明的实施方案，所述光子晶体结构上设置有c线和t线。
6.根据本发明的实施方案，所述c线、t线包括生物材料，所述生物材料上具有能够与光子晶体反应的基团。例如，所述c线、t线通过生物材料连接在光子晶体上形成。
7.根据本发明的实施方案，所述生物材料通过化学键连接在光子晶体上。
8.根据本发明的实施方案，所述t线上的生物材料为不与所述待检测物质结合的生物材料。
9.根据本发明的实施方案，所述c线上的生物材料为能够与目标分析物发生特异性反应的材料。
10.根据本发明的实施方案，所述特异性反应的材料选自酶、dna/rna、抗原、抗体、适配体、生物素-链霉亲和素、蛋白受体等中的至少一种。
11.本发明还提供一种上述光子晶体型nc膜的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
12.将上述光子晶体膜上的光子晶体结构转印到nc膜的光子晶体区域上，得到所述光子晶体型nc膜。
13.根据本发明的实施方案，所述转印通过常规的转印方法进行。
14.根据本发明的实施方案，所述制备方法进一步包括以下步骤：将生物材料固定在所述光子晶体结构上。
15.根据本发明的实施方案，将生物材料固定在光子晶体结构上之前，还包括如下步
骤：将所述光子晶体结构活化，使所述光子晶体上的反应基团暴露，所述反应基团是指能够与生物材料反应的基团。
16.根据本发明的实施方案，所述活化包括在所述光子晶体结构上涂活化剂。
17.本发明还提供一种上述光子晶体型nc膜或上述方法制备的光子晶体型nc膜在生物检测中的应用。
18.本发明还提供一种上述光子晶体型nc膜检测生物标志物的方法，所述方法包括以下步骤：使待测样品与所述光子晶体型nc膜通过毛细作用层析接触。
19.根据本发明的实施方案，所述方法包括如下步骤：
20.a)以不同浓度的标准生物标志物样品与所述光子晶体型nc膜的通过毛细作用层析接触，测定荧光值；
21.b)将待测样品与所述光子晶体型nc膜的通过毛细作用层析接触，检测c/t线的荧光信号。
22.根据本发明的实施方案，步骤b)中，将待测样品与所述光子晶体型nc膜的通过毛细作用层析接触之前，还包括如下步骤：将待测样品与检测抗体混合，所述检测抗体上连接有受体物质。
23.根据本发明的实施方案，所述受体物质包括纳米晶和荧光染料标记分子中的至少一种。
24.根据本发明的实施方案，所述纳米晶选自二氧化硅纳米晶、二氧化钛纳米晶、氧化锆纳米晶、氧化锌纳米晶、硫化镉纳米晶、碲化镉纳米晶、纳米金量子点、纳米银量子点中的至少一种。
25.根据本发明的实施方案，所述荧光染料标记分子选自cy3、cy5、fitc、rhb等中的至少一种。
26.本发明还提供一种生物检测平台，所述生物检测平台含有上述光子晶体型nc膜或上述方法制备的光子晶体型nc膜。
27.有益效果
28.1.本发明通过保湿剂和润湿剂调控光子晶体(如乳胶球)墨水的黏度和表面张力，光子晶体墨水的平均表面张力小于35.5mn/m，在20℃下的粘度小于4m
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，在25℃下的粘度小于3.5m
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；从而有效调控光子晶体墨水在基材表面的铺展、浸润行为；进而使得光子晶体(如乳胶球)通过卷筒印刷机、涂布机在基材上实现快速有序组装形成均匀的光子晶体薄膜。
29.2.本发明制备的光子晶体具有荧光增益作用，将光子晶体薄膜通过热压印方式转印到nc膜上，制备得到光子晶体型nc膜，由于光子晶体的存在，使得在nc膜上进行检测时，当检测抗体-目标检测物-生物材料在光子晶体上形成三明治结构时，连接在检测抗体的受体物质与光子晶体的距离拉近，在受体物质原有荧光基础上，光子晶体的增益效果能够使检测抗体报告的荧光增益10-100倍，将检测限降低一至二个数量级，实现对低浓度待检测物的痕量检测。
30.3.本发明搭建生物平台具有普适性，通过简单的偶联反应将生物材料(抗体、适配体以及多肽等)固定，实现可视化检测。
31.4.本发明的光子晶体型nc膜制备方法简单，绿色环保，可以大规模制备，易于商
terephthalate，聚对苯二甲酸乙二醇酯)。
50.根据本发明的实施方案，所述光子晶体墨水包含光子晶体、保湿剂和润湿剂。
51.根据本发明的实施方案，所述光子晶体墨水中的光子晶体为含有或不含有连接基团的光子晶体。
52.具体地，所述连接基团包括羧基、羟基、巯基、氨基中的至少一种，例如所述连接基团为羧基。
53.根据本发明的实施方案，所述光子晶体为蛋白石光子晶体、反蛋白石光子晶体、二维光子晶体中的至少一种。
54.根据本发明的实施方案，所述墨水中，光子晶体以乳液形式存在。
55.根据本发明的实施方案，所述墨水中，所述光子晶体以乳胶球形式存在。
56.优选地，所述乳胶球为单分散乳胶球。
57.根据本发明的实施方案，所述单分散乳胶球的粒径为150-320nm，优选所述单分散乳胶球的粒径为180-300nm，进一步地，所述单分散乳胶球的粒径为为180-280nm，示例性为180nm、190nm、200nm、205nm、215nm、220nm、230nm、250nm、260nm、280nm。
58.根据本发明的实施方案，所述光子晶体乳胶球可以选自光子晶体-聚(甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸-苯乙烯)乳胶球、光子晶体-二氧化硅微球、光子晶体-聚苯乙烯微球等中的至少一种，例如为光子晶体-聚(甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸-苯乙烯)乳胶球。
59.根据本发明的实施方案，所述单分散乳胶球的表面带有羧基官能团。
60.优选地，所述二氧化硅微球为羧基修饰的二氧化硅微球，所述聚苯乙烯微球为羧基修饰的聚苯乙烯微球。
61.根据本发明的实施方案，所述光子晶体墨水中，所述光子晶体的质量浓度为10-25％，优选所述光子晶体的质量浓度为10-20％，进一步地，所述光子晶体的质量浓度为14-18％，例如10％、12％、14％、16％、18％、20％。
62.根据本发明的实施方案，所述保湿剂可以选自乙二醇、丙二醇、丙三醇、山梨糖醇等中的至少一种，例如为乙二醇。
63.根据本发明的实施方案，所述光子晶体墨水中，所述保湿剂的质量浓度为8-15％，优选所述保湿剂的质量浓度为10-12％，示例性为10％、11％、12％。
64.根据本发明的实施方案，所述润湿剂可以选自byk-3400(聚醚改性聚二甲基硅氧烷)、吐温t-20、曲拉通x-100等中的至少一种，例如为byk-3400。
65.根据本发明的实施方案，所述光子晶体墨水中，所述润湿剂的质量浓度为0.1-0.5
‰
，优选所述润湿剂的质量浓度为0.2-0.4
‰
，例如为0.5
‰
。
66.根据本发明的实施方案，所述光子晶体墨水还包括溶剂，所述溶剂用于溶解所述光子晶体、保湿剂和湿润剂，所述溶剂选自水，例如为去离子水或超纯水。
67.作为一个实例，所述光子晶体墨水包含单分散聚(甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸-苯乙烯)乳胶球、乙二醇和byk-3400。
68.根据本发明的实施方案，所述光子晶体墨水的平均表面张力小于35.5mn/m，优选所述光子晶体墨水的平均表面张力小于25.5mn/m，例如，所述光子晶体墨水的平均表面张力为35.158mn/m、23.658mn/m、20.892mn/m、26.086mn/m、21.492mn/m、21.250mn/m。
69.所述平均表面张力是指在同一条件下，测试5次后所取的平均值。
70.根据本发明的实施方案，所述光子晶体墨水在20℃下的粘度小于4m
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，优选所述光子晶体墨水在20℃下的粘度小于3m
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，例如所述光子晶体墨水在20℃下的粘度为1.7431m
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、1.7280m
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、3.7642m
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、3.8454m
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、1.9054m
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、2.4689m
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。
71.根据本发明的实施方案，所述光子晶体墨水在25℃下的粘度小于3.5m
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，优选所述光子晶体墨水在25℃下的粘度小于2.5m
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，例如所述光子晶体墨水在25℃下的粘度为1.5425m
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、1.5121m
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、3.2564m
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、3.3385m
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、1.6604m
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、2.1114m
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。
72.[光子晶体膜的制备方法]
[0073]
本发明还提供一种上述光子晶体膜的制备方法，包括如下步骤：
[0074]
s1、配置光子晶体墨水；
[0075]
s2、所述光子晶体墨水在基材的至少一侧表面形成所述光子晶体结构，得到所述光子晶体膜。
[0076]
根据本发明的实施方案，所述光子晶体墨水、基材具有如上所述的定义。
[0077]
根据本发明的实施方案，步骤s1中，配置光子晶体墨水包括以下步骤：将光子晶体、保湿剂、润湿剂和溶剂混合。
[0078]
根据本发明的实施方案，所述光子晶体、保湿剂和润湿剂具有如上文所述含量。
[0079]
根据本发明的实施方案，步骤s2中，采用喷涂、印刷或打印的方式，将所述光子晶体墨水在基材的至少一侧表面形成所述光子晶体结构。例如通过滚筒印刷机或涂布机将光子晶体墨水印刷到基材的至少一层表面上。
[0080]
具体的，所述光子晶体结构具有上文所述定义。
[0081]
[光子晶体型nc膜]
[0082]
本发明还提供一种光子晶体型nc膜，所述光子晶体型nc膜包含nc膜和位于nc膜光子晶体区域的光子晶体结构，所述光子晶体区域包括c线和t线所在的区域。
[0083]
根据本发明的实施方案，所述光子晶体结构上设置有c线和t线。
[0084]
根据本发明的实施方案，所述光子晶体区域包括c线和t线所在的区域，例如所述光子晶体区域包括c线区和t线区，所述c线区的宽度大于等于所述c线的设计宽度，所述t线区的宽度大于等于所述t线的设计宽度。
[0085]
根据本发明的实施方案，c线是指检测线，t线是指质控线。
[0086]
根据本发明的实施方案，所述光子晶体结构具有上文所述定义。
[0087]
本发明中，所述的光子晶体结构不会影响nc膜原有的毛细作用，即快速层析渗透，原因在于光子晶体本身为亲水性材料。
[0088]
根据本发明的实施方案，所述光子晶体结构的宽度为1mm-2mm，优选所述光子晶体结构的宽度为1.2mm-1.6mm，例如为1mm、1.2mm、1.3mm、1.4mm、1.5mm、1.6mm、1.7mm、1.8mm、1.9mm或2mm。
[0089]
根据本发明的实施方案，所述c线、t线包括生物材料，所述生物材料上具有能够与光子晶体反应的基团，例如，所述c线、t线通过生物材料连接在光子晶体上形成。
[0090]
根据本发明的实施方案，所述生物材料含有-nh2官能团。
[0091]
根据本发明的实施方案，所述生物材料通过化学键连接在光子晶体上，例如通过
酰胺键连接。具体的，所述生物材料连接在光子晶体上形成c线和t线。
[0092]
例如，所述生物材料通过偶联反应连接在光子晶体表面的化学键上。
[0093]
根据本发明的实施方案，所述形成t线的生物材料为不与所述待检测物质结合的生物材料，例如为山羊抗人igg抗体。
[0094]
根据本发明的实施方案，所述形成c线的生物材料为能够与目标分析物发生特异性反应的材料。
[0095]
根据本发明的实施方案，所述特异性反应的材料选自酶、dna/rna、抗原、抗体、适配体、生物素-链霉亲和素、蛋白受体等中的至少一种；进一步地，单所述目标分析物为抗原时，所述特异性反应的材料为能够与抗原特异性结合的抗体，例如为山羊抗鼠igg。
[0096]
[光子晶体型nc膜的制备方法]
[0097]
本发明还提供一种上述光子晶体型nc膜的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
[0098]
将上述光子晶体膜上的光子晶体结构转印到nc膜的光子晶体区域上，得到所述光子晶体型nc膜。
[0099]
根据本发明的实施方案，所述转印通过常规的转印方法进行，例如通过热压印。
[0100]
根据本发明的实施方案，所述热压印方法具体指将上述光子晶体膜与nc膜接触，放置在热压印机上进行快速转印。
[0101]
根据本发明的实施方案，所述热压印的温度为80℃～120℃，热压印的时间为5s～30s。
[0102]
优选地，所述热压印的温度为100℃～120℃，热压印的时间为5s～10s。
[0103]
根据本发明的实施方案，所述制备方法进一步包括以下步骤：将生物材料固定在所述光子晶体结构上。
[0104]
根据本发明的实施方案，将生物材料固定在光子晶体结构上之前，还包括如下步骤：将所述光子晶体结构活化，使所述光子晶体上的反应基团暴露，优选所述反应基团是指能够与生物材料反应的基团，所述反应基团例如为羧基。
[0105]
根据本发明的实施方案，所述活化包括在所述光子晶体结构上涂活化剂，所述活化剂例如为edc/nhs混合溶液。
[0106]
作为一个实例地，先将edc/nhs混合溶液通过划线机划线方式划在光子晶体结构上进行活化，再将生物材料划线在活化后的光子晶体结构上，形成固定有生物材料的光子晶体结构。
[0107]
根据本发明的实施方案，将生物材料划线的划线速度为1-3μl/cm，例如为1μl/cm、2μl/cm或3μl/cm。
[0108]
根据本发明的实施方案，将生物材料划线在活化后的光子晶体薄膜上之后，还包括密闭并在温度为1-10℃的条件下孵育过夜的步骤，优选地，所述孵育温度为1-5℃，例如所述孵育温度为2℃、4℃、5℃、6℃、8℃。
[0109]
[光子晶体型nc膜的应用]
[0110]
一种上述光子晶体型nc膜在生物检测中的应用，例如在生物标志物检测中的应用。
[0111]
根据本发明的实施方案，所述生物标志物包括蛋白和/或核酸片段，例如用于检测
炎症四项(crp\saa\pct\il-6)、心肌六项(ast/ck/ckmb/ldh/ctni)、新冠(covid-19)等。
[0112]
根据本发明的实施方案，所述检测为即时检测，也称poct(point-of-care testing)
[0113]
[光子晶体型nc膜检测的方法]
[0114]
本发明还提供一种采用上述光子晶体型nc膜检测生物标志物的方法，所述方法包括以下步骤：使待测样品与所述光子晶体型nc膜通过毛细作用层析接触。
[0115]
根据本发明的实施方案，所述方法包括如下步骤：
[0116]
a)以不同浓度的标准生物标志物样品与所述光子晶体型nc膜的通过毛细作用层析接触，测定荧光值；
[0117]
b)将待测样品与所述光子晶体型nc膜的通过毛细作用层析接触，检测c/t线的荧光信号。
[0118]
根据本发明的实施方案，将待测样品与所述光子晶体型nc膜的通过毛细作用层析接触之前，还包括如下步骤：将待测样品与检测抗体混合，所述检测抗体上连接有受体物质。
[0119]
优选地，所述检测抗体、生物材料能够与生物标志物形成夹心结构。
[0120]
根据本发明的实施方案，所述检测抗体上连接有受体物质，所述受体物质与光子晶体接近会产生荧光增益，将受体物质的荧光信号放大。
[0121]
根据本发明的实施方案，所述受体物质包括纳米晶和荧光染料标记分子中的至少一种。
[0122]
优选地，所述半导体纳米晶选自二氧化硅纳米晶、二氧化钛纳米晶、氧化锆纳米晶、氧化锌纳米晶、硫化镉纳米晶、碲化镉纳米晶、纳米金量子点、纳米银量子点中的至少一种。
[0123]
优选地，所述荧光染料标记分子选自cy3、cy5、fitc、rhb等中的至少一种。
[0124]
示例性地，所述检测抗体为cy3标记的山羊抗兔igg、cy3标记的纳米抗体一抗或cy5标记纳米抗体二抗。
[0125]
[生物检测平台]
[0126]
本发明还提供一种生物检测平台，所述生物检测平台含有上述光子晶体nc膜，所述生物检测平台例如为试剂盒。
[0127]
本发明中的光子晶体nc膜与所述目标分析物通过毛细作用层析接触，通过荧光检测进行相应荧光信号捕获，荧光检测增益效果可为原来的10-100倍，优选地，所述目标分析物由荧光分子标记。
[0128]
下文将结合具体实施例对本发明的通式化合物及其制备方法和应用做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
[0129]
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。
[0130]
实施例1
[0131]
制备红色光子晶体工业级印刷墨水，步骤如下：
[0132]
(1)向100ml水中加入10.00mmol甲基丙烯酸甲酯、13.89mmol丙烯酸和182.60mmol苯乙烯，随后溶入乳化剂十二烷基苯磺酸钠(不超过0.011mmol，其浓度低于临界胶束浓度)和缓冲剂碳酸氢铵6.30mmol，得到反应液，将反应液在70℃下保持半小时，然后加入2.12mmol过硫酸铵的水溶液，连续搅拌下于80℃聚合10h，得到无需纯化可直接使用的单分散乳胶球。
[0133]
调整苯乙烯的用量(182.6mmol；121.73mmol；81.15mmol；54.1mmol；36.1mmol；24.04mmol)来调控乳胶球的粒径，制备得到粒径分别为300nm、280nm、260nm、220nm、215nm和180nm的乳胶球。
[0134]
(2)以步骤(1)制备的粒径为260nm乳胶球(组装出光子晶体结构色呈现红色)为例，将包括粒径为260nm乳胶球的光子晶体原液(即离心洗涤后的乳胶球的水溶液)稀释至12wt％浓度，将保湿剂乙二醇(质量分数占比10％)，润湿剂byk-3400(质量分数占比为0.5
‰
)加入稀释后的光子晶体溶液中，配制成光子晶体墨水。
[0135]
(3)选用pet膜作为基材，通过滚筒式印刷机将光子晶体墨水印刷到pet膜上，260nm乳胶球中的光子晶体在pet膜表面自组装形成光子晶体薄膜，干燥后保存。
[0136]
参见图1所示，为本实施例260nm乳胶球在pet膜上组装形成的光子晶体薄膜，光子晶体薄膜呈现红色。
[0137]
参见图2所示，为本实施例光子晶体(粒径为260nm)薄膜局部扫描电镜sem图，从图2中可以看出，单分散聚苯乙烯乳胶微球自组装形成周期性整齐排列的光子晶体形貌。
[0138]
实施例2
[0139]
制备绿色光子晶体工业级印刷墨水，步骤如下：
[0140]
(1)向100ml水中加入10.00mmol甲基丙烯酸甲酯，13.89mmol丙烯酸和65.23mmol苯乙烯，随后溶入乳化剂十二烷基苯磺酸钠(不超过0.011mmol，其浓度低于临界胶束浓度)和缓冲剂碳酸氢铵6.30mmol，得到反应液，将反应液在70℃保持半小时，然后加入2.12mmol过硫酸铵的水溶液，连续搅拌下于80℃聚合10h，得到无需纯化可直接使用的单分散乳胶球。
[0141]
(2)本实施例以230nm乳胶球(组装出光子晶体结构色呈现绿色)为例，将包括230nm乳胶球的光子晶体原液(即离心洗涤后的乳胶球的水溶液)稀释至8wt％浓度，将保湿剂乙二醇作(质量分数占比8％)，润湿剂byk-3400(质量分数占比为0.3
‰
)加入稀释后的光子晶体溶液中，配制成光子晶体墨水。
[0142]
(3)选用pet膜作为基材，通过涂布机将光子晶体墨水印刷到基材pet膜上，230nm乳胶球中的光子晶体在pet膜表面自组装形成光子晶体薄膜，干燥后保存。
[0143]
参见图3所示，为230nm乳胶球在pet膜上组装形成光子晶体薄膜，晶体薄膜呈现绿色。
[0144]
实施例3
[0145]
制备一种光子晶体型nc膜，光子晶体能够很好地印刷到nc膜上，且保持原有nc膜较好的渗透层析作用。
[0146]
(1)取实施例1制备的宽度为1mm光子晶体薄膜材料，将薄膜材料中的光子晶体薄膜所在面与nc膜面接触，放置热压印机下进行热压，光子晶体薄膜上的光子晶体通过热压的方式转印到nc膜上的光子晶体区域，该区域位于c/t线位置处，热压印的温度为100℃，压
印时间为10s。
[0147]
(2)将nc膜取下，揭掉光子晶体薄膜材料的基材，室温冷却，即可得到光子晶体型nc膜。
[0148]
参见图4所示，为光子晶体型nc膜的实物图，从图中可以看出，光子晶体位于c/t线区域。
[0149]
实施例4
[0150]
制备含抗体的光子晶体型nc膜
[0151]
选用cy3标记的山羊抗兔igg以及实施例3制备的光子晶体型nc膜(选用260nm光子晶体，简称pc
260nm
)构建具有生物功能性的光子晶体型nc膜。具体步骤如下：
[0152]
(1)配置6mg/ml的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和10mg/ml的n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，交联反应使用体积比为1:1，得到edc/nhs混合溶液，现配现用。
[0153]
(2)取用edc/nhs混合溶液通过划线机划线方式，在光子晶体区域划线，在室温下，进行15min活化。
[0154]
(3)待线干燥后，向活化过的光子晶体区域原位进行抗体线划线，抗体为1mg/ml cy3标记的山羊抗兔igg，划线速度为2μl/cm，密封培养皿，置于4℃冰箱孵育过夜。随后，即得到含生物抗体功能性光子晶体nc膜。
[0155]
(4)将步骤3制备的含抗体的光子晶体nc膜置于荧光显微镜下，选择激发波段为512-552nm，发射波段为565-615nm的滤波片进行观察并拍摄荧光图像。
[0156]
(5)另取一个实施例2制备的光子晶体型nc膜不进行偶联反应处理，直接在该点阵上滴加cy-3标记的山羊抗兔igg，拍摄荧光图像。
[0157]
参见图5所示，为上述步骤关于生物功能性光子晶体型nc膜(光子晶体偶联cy-3标记igg抗体)的流程示意图。从图中可以看出，因光子晶体乳胶球表面暴露出大量-cooh官能团，通过edc/nhs作为偶联剂，与抗体蛋白中的-nh2反应，形成酰胺键，实现光子晶体nc膜上固定生物材料。
[0158]
为了对生物功能性光子晶体型nc膜的固定效果进行表征，通过荧光显微镜测得的荧光强度前后变化来计算抗体固定的偶联率。图6为光子晶体型nc膜荧光显微镜图，左图代表光子晶体未偶联cy-3标记igg抗体，以直接滴加方式的荧光成像图；右图代表光子晶体在同一参数下的荧光成像图。
[0159]
利用共聚焦显微镜拍摄出的荧光图，直接利用仪器自带软件计算每幅图出荧光强度值，左图平均荧光强度值为355，右图平均荧光强度值为4044。
[0160]
重复20次试验，通过偶联法/直接滴加法得到的荧光强度数值计算得到cy-3标记igg抗体的偶联率范围为40-60％，平均抗体偶联效率为52％。
[0161]
实施例5
[0162]
制备含适配体的生物光子晶体型nc膜
[0163]
选用fitc适配体以及光子晶体型nc膜(参照实施例3方法制备得到，使用230nm光子晶体，简称pc
230nm
)，具体步骤如下：
[0164]
(1)配置6mg/ml的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和10mg/ml的n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，交联反应使用体积比为1:1，得到edc/nhs混合溶液，现配现用。
[0165]
(2)取用edc/nhs混合溶液通过划线机划线方式，在光子晶体区域划线，室温，进行
15min活化。
[0166]
(3)待干燥后，向活化过的光子晶体区域原位进行适配体划线，抗体为1mg/ml fitc适配体，划线速度为2μl/cm，密封培养皿，置于4℃冰箱孵育过夜。随后，即得到含生物适配体功能性光子晶体nc膜。
[0167]
将本实施例制备含适配体的光子晶体nc膜置于荧光显微镜下，选择激发波段为465-495nm，发射波段为515-555nm的滤波片进行观察并拍摄荧光图像。
[0168]
同时，另取一个实施例3制备的光子晶体型nc膜不进行偶联反应处理，直接在该点阵上滴加fitc适配体，拍摄荧光图像。
[0169]
未偶联反应的光子晶体型nc膜与本实施例制备的含适配体的光子晶体型nc膜的荧光图像进行荧光强度比较，计算出适配体固定的平均偶联率。重复20次试验后，计算出适配体固定的平均偶联率。
[0170]
为了对其固定效果进行表征，通过荧光强度前后变化来计算适配体固定的偶联率。重复20次试验，通过偶联法/直接滴加法得到的荧光强度数值计算得到该fitc适配体固定的偶联率范围为70～80％，平均偶联率约为80％。
[0171]
实施例6
[0172]
含cy3标记igg抗体的光子晶体型nc膜的荧光增益效果验证，方法如下：
[0173]
cy3作为荧光标记物常被用于标记抗体或适配体。
[0174]
(1)参考实施例4，选用pc
260
为光子晶体制备光子晶体型nc膜，同时，另取一个空白nc膜作为对比，在上分别滴加100ng/ml cy3标记igg抗体，滴加体积为1μl，即得到本实施例制备的含cy3标记igg抗体的光子晶体型nc膜。
[0175]
(3)待液滴干燥完全，将上述对比纯nc膜和所制备的光子晶体型nc膜放置共聚焦荧光显微镜下观察荧光，拍摄并统计荧光强度值。重复20次试验后，计算出平均荧光强度值。
[0176]
实施例7
[0177]
含fitc标记ck-mb检测抗体的光子晶体型nc膜的快速生物可视化检测标准曲线的建立。
[0178]
以急性心梗ck-mb抗原-抗体体系为例，选用ck-mb抗原以及ck-mb捕获抗体和fitc标记的检测抗体，因目标检测物ck-mb抗原，实际上以fitc标记的检测抗体(激发波长：488nm；发射波长：490-530nm)荧光强度为检测标准，因此选择与fitc染料匹配的粒径为230nm光子晶体型nc膜作为固定载体(禁带范围：450-550nm)，具体步骤如下：
[0179]
(1)配置6mg/ml的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和30mg/ml的n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，交联反应使用体积比为1:1，得到edc/nhs混合溶液，现配现用。
[0180]
(2)取用edc/nhs混合溶液通过划线机划线方式，在光子晶体区域划线，室温下进行15min活化。
[0181]
(3)待干燥后，向活化过的光子晶体区域原位进行抗体划线，抗体为1mg/ml ck-mb的捕获抗体，划线c线处作为检测线；抗体为1mg/ml山羊igg抗体划线t线处作为质控线，划线速度为2μl/cm，密封培养皿，置于4℃冰箱孵育过夜。
[0182]
(4)将ck-mb抗原标准样品(原液浓度为100μg/ml)分别稀释10倍、100倍、103倍、104倍、105倍、106倍后，得到ck-mb抗原标准样品(浓度分别为10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、10-2
μ
g/ml、10-3
μg/ml、10-4
μg/ml)，取ck-mb抗原标准样品各10μl与2μl fitc标记检测抗体(450μg/ml)混合孵育10min，37℃，得到混合溶液。
[0183]
(5)取10μl步骤(4)中的混合溶液滴加到光子晶体型nc膜一端，通过nc膜的毛细作用渗透层析到c/t线处进行识别。
[0184]
(6)将步骤(5)完成识别的光子晶体型nc膜置于共聚焦显微镜下，选择488nm激发光进行激发，观察并拍摄荧光图像。
[0185]
阴性对照组：设置一组ck-mb抗原标准样品作为阴性对照组。因为实验中无法排除非特异性吸附的干扰，每次实验需增加急性心梗ck-mb抗原的对照组作为背景。对照组制备方法同上，区别在于步骤(4)中急性心梗ck-mb抗原未偶联fitc标记检测抗体。
[0186]
参见图7所示，为本实施例制备的光子晶体型nc膜识别急性心梗ck-mb抗原三明治夹心免疫检测(从左到右分别为：识别的光子晶体型nc膜对应的急性心梗ck-mb抗原稀释梯度10、102、103、104、105、106倍数及急性心梗ck-mb抗原，抗原初始浓度为100μg/ml)的标准曲线，由图可知，随着ck-mb抗原浓度的增加，荧光强度逐渐增强。
[0187]
测试例
[0188]
测试不同配比光子晶体墨水的张力和粘度，测试方法如下：
[0189]
采用常规的表面张力测定仪测定光子晶体墨水的张力；采用常规的粘度测定仪测定光子晶体墨水的粘度，测定在常温下进行。
[0190]
参见表1所示(表1中，r为粒径为260nm的乳胶球对应的红色光子晶体)，本发明中添加有保湿剂和湿润剂、不同配比的光子晶体墨水，其表面张力小于35.5mn/m，而仅包含光子晶体的墨水，其平均表面张力大于45mn/m。
[0191]
表1光子晶体墨水配比调控的表面张力值测定
[0192][0193]
参见表2所示(其中，g为粒径为230nm的乳胶球对应的绿色光子晶体)，本发明中添加有保湿剂和湿润剂、不同配比的光子晶体墨水，在20℃下的粘度小于4m
·
pa
·
s-1
，在25℃下的粘度小于3.5m
·
pa
·
s-1
。
[0194]
表2墨水配比调控的黏度值测定
[0195]
样品名20℃下黏度/m
·
pa
·
s-1
25℃下黏度/m
·
pa
·
s-1
10％r+8％eg+1
‰
byk1.74311.5425
10％r+8％eg+5
‰
byk1.72801.512110％r+16％eg+1
‰
byk3.76423.256410％r+16％eg+5
‰
byk3.84543.338510％r+8％eg+1
‰
byk1.90541.660420％g2.51512.213320％g+8％eg2.46892.1114
[0196]
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种光子晶体型nc膜，其特征在于，所述光子晶体型nc膜包含nc膜和位于nc膜光子晶体区域的光子晶体结构，所述光子晶体区域包括c线和t线所在的区域。2.根据权利要求1所述的光子晶体型nc膜，其特征在于，所述光子晶体结构上设置有c线和t线。优选地，所述c线、t线包括生物材料，所述生物材料上具有能够与光子晶体反应的基团，例如，所述c线、t线通过生物材料连接在光子晶体上形成。优选地，所述生物材料通过化学键连接在光子晶体上。优选地，所述t线上的生物材料为不与所述待检测物质结合的生物材料。优选地，所述c线上的生物材料为能够与目标分析物发生特异性反应的材料。优选地，所述特异性反应的材料选自酶、dna/rna、抗原、抗体、适配体、生物素-链霉亲和素、蛋白受体等中的至少一种。3.一种权利要求1或2所述光子晶体型nc膜的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：将上述光子晶体膜上的光子晶体结构转印到nc膜的光子晶体区域上，得到所述光子晶体型nc膜。4.根据权利要求3所述的光子晶体型nc膜的制备方法，其特征在于，所述转印通过常规的转印方法进行。优选地，所述制备方法进一步包括以下步骤：将生物材料固定在所述光子晶体结构上。优选地，将生物材料固定在光子晶体结构上之前，还包括如下步骤：将所述光子晶体结构活化，使所述光子晶体上的反应基团暴露，所述反应基团是指能够与生物材料反应的基团。5.根据权利要求4所述的光子晶体型nc膜的制备方法，其特征在于，所述活化包括在所述光子晶体结构上涂活化剂。6.一种权利要求1或2所述光子晶体型nc膜或权利要求3-5任一项所述方法制备的光子晶体型nc膜在生物检测中的应用。7.一种采用权利要求1或2光子晶体型nc膜检测生物标志物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：使待测样品与所述光子晶体型nc膜通过毛细作用层析接触。8.根据权利要求7所述的光子晶体型nc膜检测生物标志物的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：a)以不同浓度的标准生物标志物样品与所述光子晶体型nc膜的通过毛细作用层析接触，测定荧光值；b)将待测样品与所述光子晶体型nc膜的通过毛细作用层析接触，检测c/t线的荧光信号。优选地，步骤b)中，将待测样品与所述光子晶体型nc膜的通过毛细作用层析接触之前，还包括如下步骤：将待测样品与检测抗体混合，所述检测抗体上连接有受体物质。9.根据权利要求8所述的光子晶体型nc膜检测生物标志物的方法，其特征在于，所述受体物质包括纳米晶和荧光染料标记分子中的至少一种。优选地，所述纳米晶选自二氧化硅纳米晶、二氧化钛纳米晶、氧化锆纳米晶、氧化锌纳米晶、硫化镉纳米晶、碲化镉纳米晶、纳米金量子点、纳米银量子点中的至少一种。
优选地，所述荧光染料标记分子选自cy3、cy5、fitc、rhb等中的至少一种。10.一种生物检测平台，其特征在于，所述生物检测平台含有权利要求1或2所述光子晶体型nc膜或权利要求3-5任一项所述方法制备的光子晶体型nc膜。

技术总结
本发明属于材料学领域，特别是涉及一种荧光增益型NC膜及其制备方法和应用。所述光子晶体型NC膜包含NC膜和位于NC膜光子晶体区域的光子晶体结构。在NC膜上进行检测时，当检测抗体-目标检测物-生物材料在光子晶体上形成三明治结构时，连接在检测抗体的受体物质与光子晶体的距离拉近，在受体物质原有荧光基础上，光子晶体的增益效果能够使检测抗体报告的荧光增益10-100倍，将检测限降低一至二个数量级，实现对低浓度待检测物的痕量检测。实现对低浓度待检测物的痕量检测。实现对低浓度待检测物的痕量检测。


技术研发人员：苏萌 迟基梅 宋延林
受保护的技术使用者：中国科学院化学研究所
技术研发日：2022.05.16
技术公布日：2023/9/22