一种光子晶体免疫层析试纸条及其制备方法及其应用

1.本发明属于材料学与生物学领域，特别是涉及一种光子晶体免疫层析试纸条及其制备方法及其应用。


背景技术：

2.开发快速、高效精准的诊断和检测技术愈发重要。同时对多种分析物进行识别在临床诊断和生物筛选领域引起了研究者们越来越多的关注。免疫层析技术(immunochromatographicassay，ica)是20世纪末发展起来的结合免疫技术和色谱层析技术的一种分析方法，该方法具有特异性强、操作简单、速度快等特点，在临床诊断、环境监测、食品安全等方面得到了广泛的应用。荧光免疫层析技术作为一项新型免疫检测技术，既保留了传统胶体金试纸条的现场快速检测优点，又加入了荧光检测技术的高灵敏度特点，成为提高免疫层析方法检测性能的主要途径之一。
3.光子晶体因其具有大比表面积和有序通道，适合作为生物分子与功能纳米粒子的载体，可与微通道、酶标免疫检测、层析、细胞培养等生物化学方法有效结合；光子晶体还具有特殊的光学性质，在适宜条件下，能显著增强生物光学检测色，提高生物分析检测的效率。因此，光子晶体的研究意义重大，前景广阔，借助光子晶体固有的荧光增强放大荧光信号的性质，与现有的免疫层析技术结合，可实现更低检测限度的样本检测，且可大大缩短检测时效，推动免疫层析检测的变革。


技术实现要素：

4.为改善现有技术的不足，本发明提供一种光子晶体免疫层析试纸条，所述试纸条包括硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜的一侧表面设置有光子晶体结构。
5.根据本发明的实施方案，所述光子晶体结构上设置有c线和t线。
6.根据本发明的实施方案，所述光子晶体结构包括点阵结构或者薄膜结构。
7.根据本发明的实施方案，所述点阵结构例如为点图案、线图案或面图案。
8.根据本发明的实施方案，所述c线和t线包括生物材料。
9.根据本发明的实施方案，所述生物材料上具有能够与光子晶体反应的基团。
10.根据本发明的实施方案，所述生物材料通过化学键连接在光子晶体上。
11.根据本发明的实施方案，所述t线上的生物材料为不与所述目标分析物结合的生物材料，例如为山羊抗人igg抗体或山羊抗鼠igg。
12.根据本发明的实施方案，所述c线上的生物材料为捕获抗体。优选所述捕获抗体选自能够与目标分析物特异性结合的酶、dna/rna、抗原、抗体、适配体、生物素-链霉亲和素、蛋白受体中的至少一种。
13.根据本发明的实施方案，所述光子晶体结构的宽度为1mm～2mm。
14.根据本发明的实施方案，所述光子晶体免疫层析试纸条还包括与硝酸纤维素膜连接的样品垫。
15.根据本发明的实施方案，所述样品垫上设置有检测抗体，所述检测抗体能够与抗原特异性结合的酶、dna/rna、抗原、抗体、适配体、生物素-链霉亲和素、蛋白受体等中的至少一种，且所述检测抗体与捕获抗体彼此不相同。
16.根据本发明的实施方案，所述检测抗体、捕获抗体能够与目标分析物形成三明治夹心结构。
17.根据本发明的实施方案，所述检测抗体上连接有受体物质，所述受体物质与光子晶体接近会产生荧光增益，将受体物质的荧光信号放大。
18.根据本发明的实施方案，所述受体物质包括纳米晶和荧光染料标记分子中的至少一种。
19.根据本发明的实施方案，所述光子晶体免疫层析试纸条还包括底板和吸收垫，所述样品垫、硝酸纤维素膜和吸收垫依次搭接固定在底板上。
20.根据本发明的实施方案，所述样品垫和硝酸纤维素膜之间还设置有结合垫。
21.根据本发明的实施方案，所述试纸条还包括外壳，所述外壳将所述底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫包覆在内部，所述外壳上与光子晶体区域相对应之处设置有观察窗。
22.本发明还提供一种上述光子晶体免疫层析试纸条的制备方法，所述方法包括如下步骤：
23.1)将上述光子晶体膜上的光子晶体结构转印到硝酸纤维素膜的一侧表面上，得到光子晶体型硝酸纤维素膜。
24.根据本发明的实施方案，所述方法进一步包括以下步骤：
25.2)将样品垫、步骤1)的光子晶体型硝酸纤维素膜和吸收垫依次搭接固定在底板上，得到所述光子晶体免疫层析试纸条。
26.根据本发明的实施方案，所述步骤1)包括：将上述光子晶体膜上的光子晶体结构转印到硝酸纤维素膜的一侧表面上，得到光子晶体型硝酸纤维素膜；在所述光子晶体型硝酸纤维素膜上设置c线和t线。
27.根据本发明的实施方案，所述步骤2)包括：将未设置c线和t线的光子晶体型硝酸纤维素膜粘贴到底板中间，在所述光子晶体结构上设置c线和t线，再分别将吸收垫和样品垫固定在底板的两端，且所述吸收垫、样品垫与硝酸纤维素膜接触。
28.根据本发明的实施方案，步骤1)中，所述转印通过常规的转印方法进行。
29.根据本发明的实施方案，在光子晶体型硝酸纤维素膜上设置c线和t线包括如下步骤：将生物材料固定在所述光子晶体结构上，得到c线和t线。
30.根据本发明的实施方案，将生物材料固定在光子晶体结构上之前，还包括如下步骤：将所述光子晶体结构活化，使所述光子晶体上的反应基团暴露。
31.本发明还提供一种上述光子晶体免疫层析试纸条或上制备方法制备的试纸条在生物检测中的应用。
32.本发明还提供一种上述光子晶体免疫层析试纸条或上述光子晶体免疫层析试纸条的制备方法制备的试纸条的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：将目标分析物滴加到样品垫上，进一步与所述硝酸纤维素膜通过毛细作用层析接触。
33.有益效果
34.1.本发明的光子晶体荧光免疫层析试纸条，包括硝酸纤维素膜和样品垫，硝酸纤维素膜表面设置有光子晶体结构，样品垫上设置有捕获抗体，捕获抗体上连接有受体物质，受体物质与光子晶体接近会产生荧光增益：即光子晶体的禁带位置与荧光物质的发射光谱匹配，对打入的激光具有全反射的效果，使接收器上能够接收更多的荧光信号，进而对荧光信号产生10-100倍的荧光增益作用，能够在原有试纸条的检测限度下，降低1-2个数量级限度。
35.2.本发明制备光子晶体荧光免疫层析试纸条具有普适性，能够通过简单的偶联反应固定目标分析物(抗体、适配体以及多肽等)并报告荧光，实现快速、低浓度检测。
36.4.本发明制备光子晶体荧光免疫层析试纸条的方法，操作简单，绿色环保，可以大规模制备，易于商用。
附图说明
37.图1为光子晶体免疫层析试纸条实物图。
38.图2为光子晶体免疫层析试纸条检测ck-mb标准曲线。
具体实施方式
39.[光子晶体膜]
[0040]
如上所述，本发明提供一种光子晶体膜，所述光子晶体膜包括基材和位于所述基材至少一侧表面的光子晶体结构。
[0041]
根据本发明的实施方案，所述光子晶体结构位于基材的一侧表面或两侧表面。
[0042]
根据本发明的实施方案，所述光子晶体结构包括点阵结构或者薄膜结构，分别记为光子晶体点阵和光子晶体薄膜。
[0043]
根据本发明的实施方案，所述点阵结构例如为点图案、线图案或面图案，分别记为光子晶体点、光子晶体线和光子晶体面。
[0044]
根据本发明的实施方案，所述光子晶体结构是通过光子晶体墨水在基材表面形成的。具体的，可以采用常规的喷涂、印刷或打印的方式，将光子晶体墨水在基材表面形成所述光子晶体结构。例如通过滚筒印刷机或涂布机将光子晶体墨水印刷到基材上形成所述光子晶体结构。
[0045]
根据本发明的实施方案，所述光子晶体结构具有亲水性。
[0046]
根据本发明的实施方案，所述光子晶体结构是由光子晶体在基材上自组装形成；优选地，所述光子晶体结构为光子晶体在基材上自组装形成周期性规则排列的结构。
[0047]
根据本发明的实施方案，所述光子晶体结构具有基本如图2所述的扫描电镜图。
[0048]
根据本发明的实施方案，所述基材包括柔性材料，优选为柔性透明材料，选自包括透明塑料，例如pp塑料(polypropylene，聚丙烯)、ps塑料(generalpurpose polystyrene，聚苯乙烯系塑料)、pvc塑料(polyvinyl chloride，聚氯乙烯)或pet塑料(polyethylene terephthalate，聚对苯二甲酸乙二醇酯)。
[0049]
根据本发明的实施方案，所述光子晶体墨水包含光子晶体、保湿剂和润湿剂。
[0050]
根据本发明的实施方案，所述光子晶体墨水中的光子晶体为含有或不含有连接基团的光子晶体。
[0051]
具体地，所述连接基团包括羧基、羟基、巯基、氨基中的至少一种，例如所述连接基团为羧基。
[0052]
根据本发明的实施方案，所述光子晶体为蛋白石光子晶体、反蛋白石光子晶体、二维光子晶体中的至少一种。
[0053]
根据本发明的实施方案，所述墨水中，光子晶体以乳液形式存在。
[0054]
根据本发明的实施方案，所述墨水中，所述光子晶体以乳胶球形式存在。
[0055]
优选地，所述乳胶球为单分散乳胶球。
[0056]
根据本发明的实施方案，所述单分散乳胶球的粒径为150-320nm，优选所述单分散乳胶球的粒径为180-300nm，进一步地，所述单分散乳胶球的粒径为为180-280nm，示例性为180nm、190nm、200nm、205nm、215nm、220nm、230nm、 250nm、260nm、280nm。
[0057]
根据本发明的实施方案，所述光子晶体乳胶球可以选自光子晶体-聚(甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸-苯乙烯)乳胶球、光子晶体-二氧化硅微球、光子晶体-聚苯乙烯微球等中的至少一种，例如为光子晶体-聚(甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸-苯乙烯)乳胶球。
[0058]
根据本发明的实施方案，所述单分散乳胶球的表面带有羧基官能团。
[0059]
优选地，所述二氧化硅微球为羧基修饰的二氧化硅微球，所述聚苯乙烯微球为羧基修饰的聚苯乙烯微球。
[0060]
根据本发明的实施方案，所述光子晶体墨水中，所述光子晶体的质量浓度为10-25％，优选所述光子晶体的质量浓度为10-20％，进一步地，所述光子晶体的质量浓度为14-18％，例如10％、12％、14％、16％、18％、20％。
[0061]
根据本发明的实施方案，所述保湿剂可以选自乙二醇、丙二醇、丙三醇、山梨糖醇等中的至少一种，例如为乙二醇。
[0062]
根据本发明的实施方案，所述光子晶体墨水中，所述保湿剂的质量浓度为 8-15％，优选所述保湿剂的质量浓度为10-12％，示例性为10％、11％、12％。
[0063]
根据本发明的实施方案，所述润湿剂可以选自byk-3400(聚醚改性聚二甲基硅氧烷)、吐温t-20、曲拉通x-100等中的至少一种，例如为byk-3400。
[0064]
根据本发明的实施方案，所述光子晶体墨水中，所述润湿剂的质量浓度为 0.1-0.5
‰
，优选所述润湿剂的质量浓度为0.2-0.4
‰
，例如为0.5
‰
。
[0065]
根据本发明的实施方案，所述光子晶体墨水还包括溶剂，所述溶剂用于溶解所述光子晶体、保湿剂和湿润剂，所述溶剂选自水，例如为去离子水、超纯水等。
[0066]
作为一个实例，所述光子晶体墨水包含单分散聚(甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸
‑ꢀ
苯乙烯)乳胶球、乙二醇和byk-3400。
[0067]
根据本发明的实施方案，所述光子晶体墨水的平均表面张力小于 35.5mn/m，优选所述光子晶体墨水的平均表面张力小于25.5mn/m，例如，所述光子晶体墨水的平均表面张力为35.158mn/m、23.658mn/m、20.892mn/m、 26.086mn/m、21.492mn/m、21.250mn/m。
[0068]
所述平均表面张力是指在同一条件下，测试5次后所取的平均值。
[0069]
根据本发明的实施方案，所述光子晶体墨水在20℃下的粘度小于4m
·
pa
·
s-1
，优选所述光子晶体墨水在20℃下的粘度小于3m
·
pa
·
s-1
，例如所述光子晶体墨水在20℃下的粘度为1.7431m
·
pa
·
s-1
、1.7280m
·
pa
·
s-1
、3.7642m
·
pa
·
s-1
、 3.8454m
·
pa
·
s-1
、1.9054m
·
pa
·
s-1
、2.4689m
·
pa
·
s-1
。
[0070]
根据本发明的实施方案，所述光子晶体墨水在25℃下的粘度小于 3.5m
·
pa
·
s-1
，优选所述光子晶体墨水在25℃下的粘度小于2.5m
·
pa
·
s-1
，例如所述光子晶体墨水在25℃下的粘度为1.5425m
·
pa
·
s-1
、1.5121m
·
pa
·
s-1
、3.2564m
·
pa
·
s-1
、 3.3385m
·
pa
·
s-1
、1.6604m
·
pa
·
s-1
、2.1114m
·
pa
·
s-1
。
[0071]
[光子晶体膜的制备方法]
[0072]
本发明还提供一种上述光子晶体膜的制备方法，包括如下步骤：
[0073]
s1、配置光子晶体墨水；
[0074]
s2、所述光子晶体墨水在基材的至少一侧表面形成所述光子晶体结构，得到所述光子晶体膜。
[0075]
根据本发明的实施方案，所述光子晶体墨水、基材具有如上所述的定义。
[0076]
根据本发明的实施方案，步骤s1中，配置光子晶体墨水包括以下步骤：将光子晶体、保湿剂、润湿剂和溶剂混合。
[0077]
根据本发明的实施方案，所述光子晶体、保湿剂和润湿剂具有如上文所述含量。
[0078]
根据本发明的实施方案，步骤s2中，采用喷涂、印刷或打印的方式，将所述光子晶体墨水在基材的至少一侧表面形成所述光子晶体结构。例如通过滚筒印刷机或涂布机将光子晶体墨水印刷到基材的至少一层表面上。
[0079]
具体的，所述光子晶体结构具有上文所述定义。
[0080]
[光子晶体免疫层析试纸条]
[0081]
本发明提供一种光子晶体免疫层析试纸条，所述试纸条包括硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜的一侧表面设置有光子晶体结构。
[0082]
根据本发明的实施方案，所述光子晶体结构包括点阵结构或者薄膜结构，分别记为光子晶体点阵和光子晶体薄膜。
[0083]
根据本发明的实施方案，所述点阵结构例如为点图案、线图案或面图案，分别记为光子晶体点、光子晶体线和光子晶体面。
[0084]
根据本发明的实施方案，所述光子晶体结构上设置有c线和t线，例如所述光子晶体薄膜上设置有c线和t线。
[0085]
根据本发明的实施方案，c线是指检测线，t线是指质控线。
[0086]
本发明中，所述的光子晶体结构不会影响硝酸纤维素膜原有的毛细作用，即快速层析渗透，原因在于光子晶体本身为亲水性材料。
[0087]
根据本发明的实施方案，所述c线和t线包括生物材料。
[0088]
根据本发明的实施方案，所述生物材料上具有能够与光子晶体反应的基团，例如所述生物材料含有-nh2官能团。
[0089]
根据本发明的实施方案，所述生物材料通过化学键连接在光子晶体上，例如通过酰胺键连接。
[0090]
例如，所述生物材料通过偶联反应连接在光子晶体表面的化学键上。
[0091]
根据本发明的实施方案，所述t线上的生物材料为不与所述目标分析物结合的生物材料，例如为山羊抗人igg抗体或山羊抗鼠igg。
[0092]
根据本发明的实施方案，所述c线上的生物材料为捕获抗体。
[0093]
根据本发明的实施方案，所述捕获抗体选自能够与目标分析物特异性结合的酶、
dna/rna、抗原、抗体、适配体、生物素-链霉亲和素、蛋白受体等中的至少一种。
[0094]
例如，当所述目标分析物为抗原时，所述捕获抗体为能够与抗原特异性结合的抗体；当所述捕获抗体为抗体时，所述目标分析物为与该抗体对应的抗原；当所述生物材料为适配体时，所述目标分析物为与该适配体对应的核苷酸序列。
[0095]
根据本发明的实施方案，所述光子晶体结构的宽度为1mm～2mm，优选所述光子晶体结构的宽度为1.2mm～1.6mm，例如为1mm、1.3mm、1.5mm、1.8mm、 2mm。
[0096]
根据本发明的实施方案，所述光子晶体结构通过将上述光子晶体膜上的光子晶体结构转印到硝酸纤维素膜上得到。
[0097]
根据本发明的实施方案，所述光子晶体免疫层析试纸条还包括与硝酸纤维素膜连接的样品垫。
[0098]
根据本发明的实施方案，所述样品垫上设置有检测抗体，所述检测抗体能够与抗原特异性结合的酶、dna/rna、抗原、抗体、适配体、生物素-链霉亲和素、蛋白受体等中的至少一种，且所述检测抗体与捕获抗体彼此不相同。
[0099]
优选地，所述检测抗体、捕获抗体能够与目标分析物形成三明治夹心结构。
[0100]
根据本发明的实施方案，所述检测抗体上连接有受体物质，所述受体物质与光子晶体接近会产生荧光增益，将受体物质的荧光信号放大。
[0101]
根据本发明的实施方案，所述受体物质包括纳米晶和荧光染料标记分子中的至少一种。
[0102]
优选地，所述荧光染料标记分子选自罗丹明b、罗丹明6g、荧光素中的至少一种，例如为罗丹明b。
[0103]
根据本发明的实施方案，所述光子晶体免疫层析试纸条还包括底板和吸收垫，所述样品垫、硝酸纤维素膜和吸收垫依次搭接固定在底板上。
[0104]
优选地，所述样品垫和硝酸纤维素膜之间还设置有结合垫。
[0105]
根据本发明的实施方案，所述试纸条还包括外壳，所述外壳将所述底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫包覆在内部，所述外壳上与光子晶体区域相对应之处设置有观察窗。
[0106]
优选地，所述外壳上与c/t线对应之处开有观察窗。
[0107]
本发明中，所述光子晶体对荧光材料具有荧光信号增强作用，对于纯荧光然增益为100-1000倍；对于荧光标记抗体的增益效果为10-100倍。
[0108]
[光子晶体免疫层析试纸条的制备方法]
[0109]
本发明还提供一种上述光子晶体免疫层析试纸条的制备方法，所述方法包括如下步骤：
[0110]
1)将上述光子晶体膜上的光子晶体结构转印到硝酸纤维素膜的一侧表面上，得到光子晶体型硝酸纤维素膜。
[0111]
根据本发明的实施方案，所述方法进一步包括以下步骤：
[0112]
2)将样品垫、步骤1)的光子晶体型硝酸纤维素膜和吸收垫依次搭接固定在底板上，得到所述光子晶体免疫层析试纸条。
[0113]
根据本发明的实施方案，所述步骤1)具体为：将上述光子晶体膜上的光子晶体结构转印到硝酸纤维素膜的一侧表面上，得到光子晶体型硝酸纤维素膜；在所述光子晶体型
硝酸纤维素膜上设置c线和t线。
[0114]
根据本发明的实施方案，所述步骤2)具体为：将样品垫、步骤1)的设置有c线和t线的光子晶体型硝酸纤维素膜和吸收垫依次搭接固定在底板。
[0115]
根据本发明的实施方案，所述步骤2)具体为：将未设置c线和t线的光子晶体型硝酸纤维素膜粘贴到底板中间，在所述光子晶体结构上设置c线和t 线，再分别将吸收垫和样品垫固定在底板的两端，且所述吸收垫、样品垫与硝酸纤维素膜接触。
[0116]
根据本发明的实施方案，所述方法还包括如下步骤：
[0117]
3)将试纸条切条，密封干燥保存。
[0118]
根据本发明的实施方案，步骤1)中，所述转印通过常规的转印方法进行，例如通过热压印。
[0119]
根据本发明的实施方案，所述热压印方法具体指将上述光子晶体膜与硝酸纤维素膜接触，放置在热压印机上进行快速转印。
[0120]
根据本发明的实施方案，所述热压印的温度为80℃～120℃，热压印的时间为5s～30s。
[0121]
优选地，所述热压印的温度为100℃～120℃，热压印的时间为5s～10s。
[0122]
根据本发明的实施方案，在光子晶体型硝酸纤维素膜上设置c线和t线包括如下步骤：将生物材料固定在所述光子晶体结构上，得到c线和t线。
[0123]
根据本发明的实施方案，将生物材料固定在光子晶体结构上之前，还包括如下步骤：将所述光子晶体结构活化，使所述光子晶体上的反应基团暴露，优选所述反应基团是指能够与生物材料反应的基团，所述反应基团例如为羧基。
[0124]
根据本发明的实施方案，所述活化包括在所述光子晶体结构上涂活化剂，所述活化剂例如为edc/nhs混合溶液。
[0125]
作为一个实例地，先将edc/nhs混合溶液通过划线机划线方式划在光子晶体结构上进行活化，再将生物材料划线在活化后的光子晶体结构上，形成固定有生物材料的光子晶体结构。
[0126]
根据本发明的实施方案，将生物材料划线的划线速度为1-3μl/cm，例如为 1μl/cm、2μl/cm或3μl/cm。
[0127]
根据本发明的实施方案，将生物材料划线在活化后的光子晶体薄膜上之后，还包括密闭并在温度为1-10℃的条件下孵育过夜的步骤，优选地，所述孵育温度为1-5℃，例如所述孵育温度为2℃、4℃、5℃、6℃、8℃。
[0128]
[光子晶体免疫层析试纸条在生物检测中的应用]
[0129]
本发明还提供一种上述光子晶体免疫层析试纸条在生物检测中的应用，优选在临床诊断、环境监测、食品安全中的应用，例如用于检测新冠病毒。
[0130]
[光子晶体免疫层析试纸条检测的方法]
[0131]
本发明还提供一种光子晶体免疫层析试纸条检测的方法，包括如下步骤：将目标分析物滴加到样品垫上，进一步与所述硝酸纤维素膜通过毛细作用层析接触。
[0132]
根据本发明的实施方案，所述方法包括如下步骤：
[0133]
a)以不同浓度的标准目标分析物滴加到样品垫上，与所述硝酸纤维素膜通过毛细作用层析接触，测定c/t线荧光值；
[0134]
b)将待测样品滴加到样品垫上，再与所述光子晶体型硝酸纤维素膜的通过毛细作用层析接触，检测c/t线的荧光信号。
[0135]
具体地，目标分析物先与样品垫上的荧光检测抗体结合，随着毛细作用渗透层析到硝酸纤维素膜的光子晶体上的c/t线，进而被c线上的捕获抗体所捕获，不被t线上的抗体所捕获，吸收垫吸收多余液体；检测评断结果为c线报告荧光， t线不报告荧光，若t线报告荧光，则说明该试纸条失效。
[0136]
本发明中，光子晶体的禁带位置与荧光物质的发射光谱匹配，对打入的激光具有全反射的效果，使接收器上能够接收更多的荧光信号，进而对荧光信号产生10-100倍的荧光增益作用，能够减低原有检测限度1-2个数量级，光子晶体对荧光染料的增益效果与生物材料的分子尺度有关，分子尺度越小，其增益效果越好。
[0137]
下文将结合具体实施例对本发明的结构及其制备方法和应用做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
[0138]
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。
[0139]
实施例1
[0140]
制备光子晶体型硝酸纤维素膜，步骤如下：
[0141]
(1)向100ml水中加入10.00mmol甲基丙烯酸甲酯，13.89mmol丙烯酸和65.23mmol苯乙烯，随后溶入乳化剂十二烷基苯磺酸钠(不超过0.011mmol，其浓度低于临界胶束浓度)和缓冲剂碳酸氢铵6.30mmol，得到反应液，将反应液在70℃保持半小时，然后加入2.12mmol过硫酸铵的水溶液，连续搅拌下于80℃聚合10h，得到无需纯化可直接使用的单分散乳胶球。
[0142]
(2)本实施例以230nm乳胶球(组装出光子晶体结构色呈现绿色)为例，将步骤(1)制备的光子晶体原液稀释(用水)至8wt％浓度，以乙二醇作为保湿剂(质量分数占比8％)，byk-3400作为润湿剂(质量分数占比为0.3
‰
)加入稀释后的光子晶体溶液中，配制成光子晶体墨水。
[0143]
(3)选用pet膜作为基材，通过滚筒式印刷机将光子晶体墨水印刷到基材 pet膜上形成光子晶体薄膜(一种光子晶体结构)，得到光子晶体膜，干燥后保存。
[0144]
(4)将步骤(3)中宽度为1mm的光子晶体膜的光子晶体薄膜所在面与硝酸纤维素膜的表面接触，放置热压印机下进行热压，光子晶体薄膜通过热压印机的方式转印到硝酸纤维素膜的c/t线位置处，热压印温度为100℃，压印时间为10s。
[0145]
(5)将硝酸纤维素膜取下，揭掉基材pet膜，室温冷却，即可得到光子晶体型硝酸纤维素膜。
[0146]
实施例2
[0147]
制备光子晶体荧光免疫层析试纸条，具体操作步骤如下：
[0148]
(1)将实施例1制备的将光子晶体型硝酸纤维素膜粘贴到底板中间。
[0149]
(2)制备edc/nhs混合溶液：edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)浓度为6mg/ml，nhs(n-羟基琥珀酰亚胺)浓度为10mg/ml，按照体积比1：1进行混合，得到edc/nhs混合溶液，使用该混合溶液现配现用，取用 edc/nhs混合溶液通过划线机划线方式在光
子晶体区域进行划线，划线速度为 2μl/cm，活化光子晶体表面具有羧基-cooh。
[0150]
(3)待线干燥后，向活化过的光子晶体区域，以捕获抗体(1mg/ml)溶液按速度为2μl/cm原位(c线处)划线，作为检测c线；以羊抗鼠igg抗体 (1mg/ml)溶液按速度为2μl/cm原位划线(t线处)，作为t线，置于4℃冰箱孵育过夜。
[0151]
(4)在样品垫上滴加带有荧光标记的检测抗体(1mg/ml，10μl)。
[0152]
(5)分别将吸收垫和样品垫粘贴在底板两端且与硝酸纤维素膜的端部接触，最后将组装好的试纸条切条，密封干燥保存。
[0153]
图1为光子晶体免疫层析试纸条的实物图，可以看出光子晶体位于硝酸纤维素膜c/t线处。
[0154]
实施例3
[0155]
光子晶体荧光免疫层析试纸条使用原理和检测方法步骤如下：
[0156]
检测原理：光子晶体荧光免疫试纸条采用免疫夹心法定量检测目标分析物的含量：加入目标分析物到微孔板内，经样品垫不断层析，目标分析物会先和样品垫上的检测抗体结合，依靠层析作用在硝酸纤维素膜上缓慢移动，到达检测线区域与所述捕获抗体结合，检测线区域报告荧光信号，在质控线区域与检测抗体结合的目标分析物不与羊抗兔igg抗体结合，通过荧光分析仪即可自动读取试纸条上的检测c线和质控t线的荧光信号强度，光子晶体的存在，能够对荧光信号具有放大作用，最终根据荧光分析仪读取数值。
[0157]
本实施例中，通过预先设置标准检测曲线，再将荧光值代入标准曲线，计算出待测缓冲液中的目标物含量，具体检测方法如下：
[0158]
s1、建立标准检测曲线(这里以急性心梗标志物ck-mb为例)：含rhb标记检测抗体的光子晶体荧光免疫层析试纸条的快速生物可视化检测的最低检测限。以急性心梗标记物ck-mb抗原-抗体体系为例，
[0159]
选用ck-mb抗原作为目标分析物，以及配对的捕获抗体(ab1)和检测抗体(ab2)，检测抗体(ab2)标记罗丹明b(rhb)红色荧光标签，即ab2-rhb，实际上以rhb(激发波长：561nm；发射波长：550-620nm)荧光强度为检测标准，因此选择与rhb染料匹配的粒径为260nm的聚苯乙烯微球对应的光子晶体型硝酸纤维素膜(实施例1制备的)作为固定载体(禁带范围：580-650nm)，具体步骤如下：
[0160]
(1)配置6mg/ml的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和 30mg/ml的n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，交联反应使用体积比为1:1，得到混合溶液，现配现用。
[0161]
(2)取步骤(1)中的edc/nhs混合溶液通过划线机划线方式，在光子晶体区域划线，室温，进行15min活化。
[0162]
(3)待干燥后，向活化过的光子晶体区域原位进行抗体划线，以浓度为1 mg/ml ck-mb的捕获抗体划线c线处作为检测线；以浓度为1mg/ml山羊igg 抗体划线t线处作为质控线，划线速度为2μl/cm，密封培养皿，置于4℃冰箱孵育过夜。
[0163]
(4)将ck-mb抗原标准样品(原液浓度为100μg/ml)分别稀释10倍、 100倍、103倍、104倍、105倍、106倍后，得到ck-mb抗原标准样品(浓度分别为10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、10-2
μg/ml、10-3
μg/ml、10-4
μg/ml)，取sck-mb抗原标准样品各取10μl与2μl rhb标记检测抗体(1mg/ml)混合孵育30min，37℃，得到混合溶液。
[0164]
(5)取10μl步骤(4)中的混合溶液滴加到光子晶体型硝酸纤维素膜一端，让通过硝
酸纤维素膜的毛细作用渗透层析到c/t线处进行识别。
[0165]
(6)将步骤(5)完成识别的光子晶体免疫层析试纸条置于共聚焦显微镜下，选择488nm激发光进行激发，观察并拍摄荧光图像。
[0166]
阴性对照组：设置一组ck-mb抗原标准样品作为阴性对照组。因为实验中无法排除非特异性吸附的干扰，每次实验需增加急性心梗ck-mb抗原的对照组作为背景。对照组制备方法同上，区别在于步骤(4)中急性心梗ck-mb抗原未偶联rhb标记检测抗体。
[0167]
使用标准稀释液对ck-mb标准品进行倍比稀释，采用本发明试纸条进行重复检测3次，取平均值，以ck-mb的浓度为横坐标，以检测荧光信号强度为纵坐标绘制标准曲线，结果如图2所示，ck-mb浓度在0.01～200ng/ml检测范围内的线性关系良好，r2＝0.9921，本发明中试纸条对ck-mb的最低检测限为 10pg/ml。
[0168]
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种光子晶体免疫层析试纸条，其特征在于，所述试纸条包括硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜的一侧表面设置有光子晶体结构。2.根据权利要求1所述的光子晶体免疫层析试纸条，其特征在于，所述光子晶体结构上设置有c线和t线。优选地，所述光子晶体结构包括点阵结构或者薄膜结构。优选地，所述点阵结构例如为点图案、线图案或面图案。优选地，所述c线和t线包括生物材料。3.根据权利要求2所述的光子晶体免疫层析试纸条，其特征在于，所述生物材料上具有能够与光子晶体反应的基团。优选地，所述生物材料通过化学键连接在光子晶体上。优选地，所述t线上的生物材料为不与所述目标分析物结合的生物材料，例如为山羊抗人igg抗体或山羊抗鼠igg。优选地，所述c线上的生物材料为捕获抗体。优选所述捕获抗体选自能够与目标分析物特异性结合的酶、dna/rna、抗原、抗体、适配体、生物素-链霉亲和素、蛋白受体中的至少一种。优选地，所述光子晶体结构的宽度为1mm～2mm。4.根据权利要求1至3任一项所述的光子晶体免疫层析试纸条，其特征在于，所述光子晶体免疫层析试纸条还包括与硝酸纤维素膜连接的样品垫。优选地，所述样品垫上设置有检测抗体，所述检测抗体能够与抗原特异性结合的酶、dna/rna、抗原、抗体、适配体、生物素-链霉亲和素、蛋白受体等中的至少一种，且所述检测抗体与捕获抗体彼此不相同。优选地，所述检测抗体、捕获抗体能够与目标分析物形成三明治夹心结构。优选地，所述检测抗体上连接有受体物质，所述受体物质与光子晶体接近会产生荧光增益，将受体物质的荧光信号放大。优选地，所述受体物质包括纳米晶和荧光染料标记分子中的至少一种。5.根据权利要求4所述的光子晶体免疫层析试纸条，其特征在于，所述光子晶体免疫层析试纸条还包括底板和吸收垫，所述样品垫、硝酸纤维素膜和吸收垫依次搭接固定在底板上。优选地，所述样品垫和硝酸纤维素膜之间还设置有结合垫。优选地，所述试纸条还包括外壳，所述外壳将所述底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫包覆在内部，所述外壳上与光子晶体区域相对应之处设置有观察窗。6.一种权利要求1-5任一项所述光子晶体免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：1)将上述光子晶体膜上的光子晶体结构转印到硝酸纤维素膜的一侧表面上，得到光子晶体型硝酸纤维素膜。7.根据权利要求6所述的光子晶体免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述方法进一步包括以下步骤：2)将样品垫、步骤1)的光子晶体型硝酸纤维素膜和吸收垫依次搭接固定在底板上，得到所述光子晶体免疫层析试纸条。
优选地，所述步骤1)包括：将上述光子晶体膜上的光子晶体结构转印到硝酸纤维素膜的一侧表面上，得到光子晶体型硝酸纤维素膜；在所述光子晶体型硝酸纤维素膜上设置c线和t线。优选地，所述步骤2)包括：将未设置c线和t线的光子晶体型硝酸纤维素膜粘贴到底板中间，在所述光子晶体结构上设置c线和t线，再分别将吸收垫和样品垫固定在底板的两端，且所述吸收垫、样品垫与硝酸纤维素膜接触。8.根据权利要求6或7所述的光子晶体免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，步骤1)中，所述转印通过常规的转印方法进行。优选地，在光子晶体型硝酸纤维素膜上设置c线和t线包括如下步骤：将生物材料固定在所述光子晶体结构上，得到c线和t线。优选地，将生物材料固定在光子晶体结构上之前，还包括如下步骤：将所述光子晶体结构活化，使所述光子晶体上的反应基团暴露。9.一种权利要求1-5任一项所述光子晶体免疫层析试纸条或权利要求6-8任一项所述光子晶体免疫层析试纸条的制备方法制备的试纸条在生物检测中的应用。10.一种采用权利要求权利要求1-5任一项所述光子晶体免疫层析试纸条或权利要求6-8任一项所述光子晶体免疫层析试纸条的制备方法制备的试纸条的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：将目标分析物滴加到样品垫上，进一步与所述硝酸纤维素膜通过毛细作用层析接触。

技术总结
本发明属于材料学与生物学领域，特别是涉及一种光子晶体免疫层析试纸条及其制备方法及其应用。所述试纸条包括硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜的一侧表面设置有光子晶体结构，所述光子晶体结构上设置有C线和T线。本发明的光子晶体荧光免疫层析试纸条具有普适性，能够通过简单的偶联反应固定目标分析物例如抗体、适配体以及多肽等，并报告荧光，实现快速、低浓度检测。度检测。度检测。


技术研发人员：迟基梅 苏萌 宋延林
受保护的技术使用者：中国科学院化学研究所
技术研发日：2022.05.16
技术公布日：2023/9/22